類泛素蛋白FAT10通過Nrf2/HO?1通路對心肌細(xì)胞缺血缺氧修復(fù)損傷的保護(hù)作用

陳天德 曹玉芳

缺血性心肌病是心血管疾病中最嚴(yán)重的一類，致死率較高［1］。缺血心肌組織恢復(fù)血供后發(fā)生再灌注損傷是缺血性心肌病發(fā)生的重要原因之一［2］。心肌再灌注損傷的發(fā)病機制目前尚未完全明確。有研究顯示，心肌缺血早期的心肌細(xì)胞損傷以凋亡為主，而晚期以壞死為主［2］。探討缺血再灌注損傷心肌細(xì)胞凋亡的機制有重要意義。類泛素蛋白人類白細(xì)胞抗原F 介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子10（Human HLA?F ad?jacent transcript 10，F(xiàn)AT10）在人類各種組織中廣泛表達(dá)，在靶蛋白降解、細(xì)胞周期調(diào)控、免疫調(diào)控等過程中發(fā)揮重要作用［3?5］。近年來研究顯示，F(xiàn)AT10 與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)［3］。核因子E2 相關(guān)因子2（nu?clear factor erythroid2?related factor 2，Nrf2）是機體重要的抗氧化分子，可以靶向調(diào)控血紅素氧化酶1（heme oxygenase 1，HO?1），影響心肌細(xì)胞凋亡［6］，在心肌缺血再灌注損傷的發(fā)病過程中起到重要作用［7］。FAT10 與Nrf2/HO?1 通路的關(guān)系尚不清楚，本研究采用小干擾RNA（siRNA）沉默F(xiàn)AT10 蛋白，檢測心肌細(xì)胞凋亡情況，旨在探討FAT10 在心肌缺血再灌注損傷中的作用，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑

H9C2 大鼠心肌細(xì)胞購于通派（上海）生物科技有限公司，胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)基和胰蛋白酶購于上海臥宏生物科技有限公司，細(xì)胞活力檢測試劑盒（cell cuounting kit 8，CCK?8）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）檢測試劑盒購于武漢卡諾斯科技有限公司，BCA 蛋白定量試劑盒和十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodec?yl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS?PAGE）凝膠制備試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司，siRNA 轉(zhuǎn)染試劑購于美國Sigma 公司，An?nexin V?FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購于上海翊圣生物科技有限公司，F(xiàn)AT10 抗體、Nrf2 抗體、HO?1抗體、GAPDH 抗體、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的山羊抗兔抗體均購于美國bioxcell 公司，混合氣體購于上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司，F(xiàn)AT10 沉默序列由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計并提供，序列為：5′?GCCCTTACC?GTTCCAAGGCC?3′。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將H9C2 細(xì)胞置于含有10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素雙抗混合液的DMEM 培養(yǎng)基中，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為5% CO2、37℃。待細(xì)胞生長至80%時，用胰蛋白酶消化進(jìn)行傳代。

1.2.2 心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型的構(gòu)建

將細(xì)胞（密度為2×105/孔）接種于6 孔板中，在5% CO2、37℃條件下培養(yǎng)48 h。將95%氮氣和5%CO2充入Concept 400M 厭氧培養(yǎng)箱，構(gòu)建缺氧復(fù)氧模型。將細(xì)胞分為對照組、缺氧4 h 組、復(fù)氧2 h組及復(fù)氧4 h 組。對照組正常培養(yǎng)。缺氧前首先將DMEM 培養(yǎng)基更換為無糖無血清培養(yǎng)基，進(jìn)行同步化處理3 h，隨后將缺氧組及復(fù)氧組細(xì)胞放入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱，沖入混合氣體，缺氧4 h 后取出。復(fù)氧組將培養(yǎng)基更換為DMEM 培養(yǎng)基，在5% CO2、37℃條件下進(jìn)行復(fù)氧處理2、4 h。

1.2.3 CCK?8 法檢測心肌細(xì)胞活力

將心肌細(xì)胞（密度為8×103/孔）接種于96 孔板，對照組正常培養(yǎng)，其余組缺氧復(fù)氧處理后，加入CCK?8 溶液，孵育1 h，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。使用BK?EL10C 酶標(biāo)儀在450nm處檢測光密度值。實驗重復(fù)4 次。

1.2.4 微量酶標(biāo)法檢測LDH

建立心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型后，取細(xì)胞上清液，使用LDH 試劑盒以微量酶標(biāo)法檢測LDH，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。實驗重復(fù)4 次。

1.2.5 Annexin V?FITC/PI 法檢測心肌細(xì)胞凋亡

將細(xì)胞制成1×106個/mL 的懸液，加入5 μL 異硫氰酸熒光素，孵育10 min，隨后加入2.5 μL 碘化丙啶，孵育5 min。最后使用美國Orflo 流式細(xì)胞儀檢測凋亡率。實驗重復(fù)4 次。

1.2.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將心肌細(xì)胞（密度為2×105/孔）加入6 孔板，用120 μL riboFECT CP Buffer（v2）轉(zhuǎn)染試劑稀釋10 μL 的siRNA 儲備液，隨后加入12 μL ribo?FECT CP Buffer（v4），溫室孵育10 min。隨后將混合物加入1 858 μL 的DMEM 培養(yǎng)基中。用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將陰性對照RNA 序列（si?CON）和FAT10 沉默序列轉(zhuǎn)入心肌細(xì)胞。將心肌細(xì)胞分為對照組、缺氧4 h+si?CON 組（陰性對照）、缺氧4 h+siRNA 組、復(fù)氧4 h+si?CON 組（陰性對照）、復(fù)氧4 h+siRNA 組。

1.2.7 Western?blot 檢測心肌細(xì)胞FAT10、Nrf2、HO?1 蛋白表達(dá)水平

用RAPI 裂解液提取心肌細(xì)胞中的總蛋白，用BCA 試劑盒檢測蛋白濃度，10% SDS?PAGE 電泳分離蛋白，用半干轉(zhuǎn)移法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜上。隨后用5%脫脂奶粉封閉1 h，加入FAT10 抗體（稀釋500 倍）、Nrf2 抗體（稀釋1 000 倍）、HO?1 抗體（稀釋1 000 倍），4℃過夜孵育，次日除去一抗，用TBST 緩沖液洗滌3 次后加入二抗。用ECL 發(fā)光儀成像，Image J 軟件分析灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理。計量資料以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較用LSD?t檢驗。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 缺氧復(fù)氧模型的建立

細(xì)胞活性檢測結(jié)果顯示，隨時間延長，心肌細(xì)胞存活率下降，在復(fù)氧4 h 后最低。復(fù)氧4 h 組細(xì)胞存活率低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。LDH 檢測結(jié)果顯示，隨時間延長，心肌細(xì)胞損傷加重，在復(fù)氧4 h 后最嚴(yán)重。復(fù)氧4 h 組LDH 活性高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，在復(fù)氧4 h 后心肌細(xì)胞凋亡率最高。復(fù)氧4 h 組細(xì)胞凋亡率高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1、圖1。

表1 各組細(xì)胞存活率、LDH 活性和細(xì)胞凋亡率比較（±s）Table 1 Comparison of cell survival rate，LDH activity and apoptosis rate in each group（±s）

表1 各組細(xì)胞存活率、LDH 活性和細(xì)胞凋亡率比較（±s）Table 1 Comparison of cell survival rate，LDH activity and apoptosis rate in each group（±s）

注：與對照組比較，aP<0.05。

組別對照組缺氧4 h 組復(fù)氧2 h 組復(fù)氧4 h 組n 4 4 4 4細(xì)胞存活率（%）1 65.12±10.12a 62.7±15.20a 54.70±8.24a LDH 活性（U/L）87.23±6.27 110.26±14.29a 200.34±35.05a 271.46±60.02a細(xì)胞凋亡率（%）4.08±0.87 8.21±1.02a 14.65±3.41a 19.33±3.17a

圖1 流失細(xì)胞術(shù)檢測的代表性圖片F(xiàn)igure 1 Representative images of drain cytometry assays

2.2 缺氧復(fù)氧對FAT10 蛋白表達(dá)的影響

FAT10 蛋白表達(dá)水平：復(fù)氧4 h+si?CON 組>缺氧4 h+si?CON 組>對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2、圖2。

表2 各組FAT10 蛋白相對表達(dá)量及細(xì)胞凋亡率比較（±s）Table 2 Comparison of the relative expression of FAT10 protein and cell apoptosis rate in each group（±s）

表2 各組FAT10 蛋白相對表達(dá)量及細(xì)胞凋亡率比較（±s）Table 2 Comparison of the relative expression of FAT10 protein and cell apoptosis rate in each group（±s）

注：與對照組比較，aP<0.05；與缺氧4h+si?CON 組比較，bP<0.05；與對應(yīng)的陰性對照組比較，c P<0.05。

組別對照組缺氧4h+si?CON 組缺氧4h+siRNA 組復(fù)氧4h+si?CON 組復(fù)氧4h+siRNA 組n4 4 4 4 4蛋白相對表達(dá)量1 1.67±0.23a 1.12±0.20c 2.02±0.31ab 1.03±0.17c細(xì)胞凋亡率（%）3.67±1.50 7.43±2.03 14.04±3.15c 12.00±2.32 16.46±1.29c

圖2 Western?blot 檢測的代表性條帶Figure 2 Representative bands detected by Western?blot

2.3 沉默F(xiàn)AT10 表達(dá)對心肌細(xì)胞凋亡的影響

FAT10 蛋白表達(dá)水平：復(fù)氧4 h+siRNA 組<缺氧4 h+siRNA 組<缺氧4 h+si?CON 組，見表2、圖2。沉默F(xiàn)AT10 后細(xì)胞凋亡率升高（P<0.05）。見表2、圖3。

圖3 流失細(xì)胞術(shù)檢測的代表性圖片F(xiàn)igure 3 Representative images of drain cytometry assays

2.4 沉默F(xiàn)AT10 表達(dá)對Nrf2、HO?1 蛋白表達(dá)水平的影響

缺氧復(fù)氧損傷使FAT10 蛋白表達(dá)水平增加，Nrf2、HO?1 蛋白表達(dá)水平也增高。沉默F(xiàn)AT10后，Nrf2、HO?1 蛋白表達(dá)水平降低（P<0.05）。見表3和圖4。

表3 各組FAT10、Nrf2、HO?1 蛋白表達(dá)水平比較（±s）Table 3 Comparison of protein expression levels of FAT10，Nrf2 and HO?1 in each group（±s）

表3 各組FAT10、Nrf2、HO?1 蛋白表達(dá)水平比較（±s）Table 3 Comparison of protein expression levels of FAT10，Nrf2 and HO?1 in each group（±s）

注：與復(fù)氧4h+si?CON 組比較，aP<0.05。

組別對照組復(fù)氧4h+si?CON 組復(fù)氧4h+si?RNA 組n4 4 4 FAT10 1 1.95±0.21 1.62±0.10a Nrf2 1 1.45±0.12 1.21±0.09a HO?1 1 1.51±0.10 1.18±0.11a

圖4 Western?blot 檢測的代表性條帶Figure 4 Representative bands detected by Western?blot

3 討論

心肌缺血再灌注損傷會造成一系列并發(fā)癥，如心律失常、心衰等，對疾病預(yù)后造成不良影響［8］。心肌缺血再灌注損傷的發(fā)病機制目前尚未完全明確，可能與氧化應(yīng)激損傷、鈣離子超載、能量代謝障礙、免疫炎癥損傷等有關(guān)［9?10］。心肌缺血再灌注損傷過程中存在心肌細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，如何減少心肌細(xì)胞凋亡已成為疾病研究熱點［11?12］。FAT10 是泛素樣蛋白家族成員之一，由165 個氨基酸組成，其基因位于6 號染色體上。既往FAT10在腫瘤疾病中被研究的較多，F(xiàn)AT10 與細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、凋亡和免疫反應(yīng)密切相關(guān)［13］。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AT10 可以通過穩(wěn)定caveolin?3 緩解缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡［14］。另外，F(xiàn)AT10 可以抑制沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator 1，SIRT1）改善心肌細(xì)胞自噬，進(jìn)而對缺血心肌組織起到保護(hù)作用［15］。

FAT10 與心肌缺血再灌注損傷的關(guān)系，既往未見報道。本研究將95%氮氣和5% CO2充入Concept 400M 厭氧培養(yǎng)箱，構(gòu)建缺氧復(fù)氧模型。細(xì)胞活性檢測結(jié)果顯示，隨時間延長，心肌細(xì)胞存活率下降，在復(fù)氧4 h 后最低。復(fù)氧4 h 組細(xì)胞存活率低于對照組。LDH 檢測結(jié)果顯示，隨時間延長，心肌細(xì)胞損傷加重，在復(fù)氧4 h 后最嚴(yán)重。復(fù)氧4 h 組LDH 活性高于對照組。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，在復(fù)氧4 h 后心肌細(xì)胞凋亡率最高。復(fù)氧4 h 組細(xì)胞凋亡率高于對照組。結(jié)合上述結(jié)果，本研究選擇缺氧4 h、復(fù)氧4 h 為模型建立的時間進(jìn)行后續(xù)研究。缺氧4h、復(fù)氧4h 為模型建立的最佳時間，與既往報道一致［16］。在心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧過程中，心肌細(xì)胞FAT10 表達(dá)水平升高。

本研究中，缺氧4 h+si?CON 組FAT10 蛋白相對表達(dá)水平高于對照組，復(fù)氧4 h+si?CON 組FAT10 蛋白相對表達(dá)水平高于對照組，復(fù)氧4 h+si?CON 組FAT10 蛋白相對表達(dá)水平高于缺氧4 h+si?CON 組，提示FAT10 參與了缺氧復(fù)氧損傷過程，可能是保護(hù)心肌細(xì)胞損傷的因子。此外，沉默F(xiàn)AT10 后細(xì)胞凋亡率升高，說明FAT10 激活與心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)，可能起到保護(hù)作用。Nrf2 是抗氧化應(yīng)激損傷的重要分子，受到刺激后，Nrf2 進(jìn)入細(xì)胞核，與氧化應(yīng)答元件結(jié)合后被激活，進(jìn)而靶向作用于HO?1，發(fā)揮抗氧化作用［17］。既往研究顯示，Nrf2/HO?1 通路與心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)［17］。本研究發(fā)現(xiàn)，沉默F(xiàn)AT10 基因后Nrf2 和HO?1 蛋白表達(dá)水平降低，提示FAT10 可能通過激活Nrf2/HO?1通路對心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷起到保護(hù)作用。

綜上所述，F(xiàn)AT10 可能通過Nrf2/HO?1 通路抗心肌細(xì)胞凋亡，進(jìn)而對缺氧修復(fù)損傷起到保護(hù)作用，F(xiàn)AT10 可能成為缺血再灌注損傷的潛在靶點。然而本研究僅分析了FAT10 對心肌細(xì)胞存活及凋亡的影響，未分析心肌細(xì)胞免疫炎癥損傷、氧化應(yīng)激損傷等的變化，而這些變化與缺血再灌注損傷密切相關(guān)。未來需要開展細(xì)胞和動物研究，進(jìn)一步明確FAT10 在缺血再灌注中的作用及機制。