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    尿液肌氨酸在前列腺癌中的應用及檢測

    2022-11-22 03:09:30周斌胡晞江
    分子診斷與治療雜志 2022年8期
    關鍵詞:丙氨酸印跡檢出限

    周斌 胡晞江

    前列腺癌(prostate carcinoma,PCa)發(fā)病率在臨床上位于男性惡性腫瘤的第二位,且在中國呈逐年上升趨勢[1],PCa 早診斷、早治療尤為重要,目前PCa 早期篩查主要依靠直腸指檢聯(lián)合血液前列腺特異性抗原(prostate specific antigen,PSA)檢測,但其存在一定程度的“灰區(qū)”和假陽性結果,造成過度治療和漏診(靈敏度為20.5%、特異性為51%~91%)[2?3],因此在臨床上迫切需要特異和敏感的生物標志物及其準確且靈敏的檢測方法。

    尿液前列腺癌抗原3(prostate cell antigen 3,PCA3)、早期前列腺抗原(early prostatecancer anti?gen,EPCA)、前列腺干細胞抗原(prostate stem cell antigen,PSCA)、α?甲酰輔酶A 消旋酶(alpha?meth?ylacyl?coa racemase,AMACR)等生物標志物逐步走進了大眾的視野[4?5],但是由于其檢測手段有限,限制了在臨床上的使用。近年來通過代謝組學逐漸發(fā)現(xiàn)包括肌氨酸、丙氨酸、精氨酸、尿嘧啶、谷氨酸、富馬酸、檸檬酸和絲氨酸等多種代謝產(chǎn)物有望被用作PCa 患者生物標志物[6?7],其中肌氨酸是最早被篩選和證實的[8]。對于這些新型生物標志物推廣至臨床應用還需進行嚴密評估及確證,使科研向臨床轉化。本文主要綜述肌氨酸的臨床應用價值和近十年來尿液中肌氨酸的檢測方法,為醫(yī)務工作者及科研工作者提供參考依據(jù)。

    1 肌氨酸的臨床應用價值

    肌氨酸,即N? 甲基甘氨酸,化學式為CH3NHCH2COOH,末端含羧基,溶于水,是膽堿代謝為甘氨酸過程的中間體。自2009年研究者首次揭示肌氨酸是PCa 發(fā)展時顯著增高的代謝產(chǎn)物后[8],又陸續(xù)開展了眾多研究以期評估肌氨酸作為PCa 生物標志物的價值。少量研究顯示,尿液中的肌氨酸不能用于鑒別前列腺相關疾病。Jentzmik發(fā)現(xiàn)直腸指診與尿液中肌氨酸聯(lián)合使用并不比PSA 更容易區(qū)分PCa 和非PCa,且肌氨酸濃度與評分無相關性[9]。大部分研究認為:尿肌氨酸不僅能作為前列腺疾病早期篩查、病理分級及預后判斷的關鍵指標,還能有效反映PCa 的侵襲性,辨別癌細胞是緩慢生長還是高度侵襲生長,其檢測診斷PCa 的準確性優(yōu)于血PSA 檢測[8,10]。Wang 等[11]也進一步證實了尿肌氨酸/肌酐比值不僅可區(qū)分良性前列腺增生性疾病和PCa,還可在PSA 灰色區(qū)(PSA<10 ng/mL)水平時作為PCa 生物標志物,而且還發(fā)現(xiàn)肌氨酸濃度水平與Gleason 評分密切相關。上述結果說明,肌氨酸在檢出PCa 以及判斷PCa 侵襲性方面至少與PSA 相當,甚至更優(yōu)。也有研究者推測,將PSA 檢測和一些新的生物標志物如肌氨酸等結合起來,可使PCa 的診斷、治療和監(jiān)測更個體化,最重要的是在活檢之前就能預判前列腺病變的嚴重程度,減少不必要的穿刺活檢。

    綜上所述,尿液肌氨酸檢測在前列腺癌診斷中的應用價值目前存在爭議,導致出現(xiàn)爭議的原因可能與尿液肌氨酸檢測方法、測定樣本(尿沉渣或經(jīng)尿液離心后的上清液)、受試人群等差異有關[12]。不同GNMT遺傳背景可影響人群中肌氨酸水平[13],而且樣品預處理方法和檢測方法都可能影響檢測結果[12,14]。因此,樣品前處理和檢測對肌氨酸在臨床上的應用非常重要。

    2 肌氨酸檢測方法

    肌氨酸要達到臨床應用必須依賴準確,且快速的檢測方法,目前肌氨酸檢測方法種類繁多,主要包括間接定量分析和直接檢測兩大類。間接定量分析是通過肌氨酸氧化酶或納米酶氧化肌氨酸間接檢測,主要包括比色法[15],熒光法[16]和電化學方法[17]。2007年以來隨著納米酶催化體系的不斷發(fā)展,肌氨酸比色法中基于納米酶的生物傳感器逐漸增多,大大優(yōu)化了比色法的檢測性能。直接檢測方法通常包括色譜法、色譜與質(zhì)譜聯(lián)用法[18]以及電化學方法[17]。這類方法準確性和重復性都非常好,但暫未能實現(xiàn)標準化的快速批量檢測,電化學方法靈敏度也有待提高。隨著分子印跡技術在電化學傳感器中的應用,其檢測性能均達到了新的高度。

    2.1 分光光度法

    傳統(tǒng)的分光光度法主要依賴的是肌氨酸氧化酶,這是最早開發(fā)和最經(jīng)典的檢測方法之一,目前已有成熟檢測試劑盒和專利誕生,該方法操作簡單,成本低,也不受丙氨酸干擾,但在低濃度尿液加標實驗中回收率較低。隨著材料科學的迅猛發(fā)展,越來越多的人工模擬酶如貴金屬絡合物和金/銀納米顆粒等有望替代傳統(tǒng)酶用于分析檢測中,納米酶的應用也是肌氨酸比色檢測未來發(fā)展方向。納米酶既具有納米材料優(yōu)異的理化特性,良好的相容性,合成簡單,易修飾和無毒,又兼具極佳的酶學催化功能,可避免酶修飾和分離步驟,也能減少蛋白酶的非特異性吸附。早期在Pd 納米顆粒合成中引入碳納米管,石墨烯等納米顆粒增強模擬酶活性,改善生物親和力,使方法的檢出限降至5.0 nmol/L[19]。BawaMbage 等人以自制的葉酸官能團化的多金屬氧酸鹽化合物為模擬酶,實現(xiàn)肌氨酸和雙氧水同時檢測,但檢出限較高(0.311 μmol/L)[20]。

    2.2 電化學分析法

    尿液中肌氨酸的含量極低(健康成人為1~1.5 μmol/L),常規(guī)的電化學生物傳感器的靈敏度和選擇性并不都能滿足臨床需求[17,21]。近年來,研究者們一方面致力于改善肌氨酸氧化酶活性,通過新型材料的合成或結構改善實現(xiàn)活性生物物質(zhì)固定在基體電極表面保證接觸面積最大化,達到酶催化活性增強目的。比如,Yang 等[22]合成鉑負載介孔磷酸鎳增加活性位點,對肌氨酸氧化酶產(chǎn)物具有良好的電化學性能,在定量分析肌氨酸時檢出限為0.24 μmol/L。Yang 等以類沸石咪唑酯骨架材料(zeoliticimidazolate framework?8,ZIF?8)負載納米鉑(Pt@ZIF8),將其修飾在玻碳電極(glassy carbon electrode,GCE)上(Pt@ZIF8/GCE),ZIF?8獨特的3D 網(wǎng)絡結構提高了鉑納米顆粒對肌氨酸氧化酶的電催化活性,維持檢出限在1.06 μmol/L水平,線性范圍為5~30 μmol/L[23]。另一方面研究者們利用分子印跡聚合物對模板分子的良好識別機制,實現(xiàn)肌氨酸檢測中出色的選擇性和穩(wěn)定性[24],比如,Sheydaei Omid 等[25]利用新型納米分子印跡聚合物修飾碳糊電極建立了微分脈沖伏安法,以甲基丙烯酸為功能單體,乙腈水溶液為致孔劑,通過溶膠?凝膠法制備分子印跡聚合物納米珠,納米珠結構在碳糊電極上良好的電催化作用,實現(xiàn)了肌氨酸定量分析的高親和性和高選擇性,但該方法同樣沒有呈現(xiàn)優(yōu)異的檢出限(0.38 μmol/L)。?zkütük 等[26]以甲基丙烯酰胺基組氨酸為功能單體,乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑,通過乳液聚合合成分子印跡聚合物,該分子印跡聚合物電位傳感器平臺對肌氨酸顯示出高選擇性,且響應時間短(<2 min),線性范圍寬(10?5~10?9mol/L)。也有研究者把磁性Fe3O4納米粒子嵌入金屬有機骨架化合物作為分子印跡化合物載體,利用金屬有機骨架的多孔結構提高傳質(zhì)效率和吸附能力,印跡因子達4.30,使檢測肌氨酸的檢測限降至0.4 pmol/L,線性范圍為1~100 pmol/L[27]。所以,電化學方法可通過改變模板分子的結構或基于復合材料創(chuàng)建多層分子印跡聚合物來設計聚合物的整體形態(tài)以此提高選擇性和靈敏度。雖然分子印跡技術在電化學傳感器中已經(jīng)獲得了良好應用,但仍然存在機理研究不夠深入,制備技術有待優(yōu)化等亟待解決的問題。

    2.3 色譜法或色譜?質(zhì)譜聯(lián)用法

    質(zhì)譜法是氨基酸定量檢測的最準確的方法之一。肌氨酸結構上帶有氨基和羧基,是一種分子量較小的親水物質(zhì),在電噴霧離子源中肌氨酸離子化效率較低,直接用質(zhì)譜法信號較弱,通常需要與氣相色譜、液相色譜和毛細管電泳聯(lián)合使用[28]。目前肌氨酸檢測的色譜法主要以高效液相色譜為主,而氣相色譜使用較少(需要合適的衍生化試劑衍生)。尿液中存在內(nèi)源性丙氨酸,其濃度是肌氨酸的數(shù)千倍,在常規(guī)色譜法或色譜?質(zhì)譜聯(lián)用法中不能有效分離肌氨酸及其分子異構體(α?L?丙氨酸,α?D?丙氨酸和β?丙氨酸)。近年來,通過合適的衍生化等手段逐步可排除丙氨酸的干擾。如Tang?Chia Chung 等人利用熒光試劑左氧氟沙星酰氯衍生化,以乙酸鈉緩沖液和四氫呋喃作為流動相進行梯度洗脫,在己基?苯基柱上能較好的分離氨基酸衍生物與其分子異構體,線性范圍為44.5~1780.0 ng/mL,檢出限為8.9 ng/mL[18]。研究者利用丹磺酰氯進行柱前衍生,在液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀上通過提高分辨率和離子化效率,使衍生后肌氨酸及丙氨酸保留時間延長以達到分離目的[29]。高效液相色譜?質(zhì)譜或氣相色譜?質(zhì)譜法能對復雜基質(zhì)中的肌氨酸進行準確定量,重復性好,且有極高的分辨率和分析效率,值得注意的是質(zhì)譜法需要昂貴的儀器設備、標準品和固相萃取等樣品前處理手段。所以在今后要實現(xiàn)臨床意義上的色譜?質(zhì)譜法常規(guī)檢測肌氨酸,應該更著重樣品前處理方法的簡化以及臨床操作的標準化。

    2.4 熒光光譜法

    肌氨酸本身不具有熒光,必須利用熒光染料等試劑與其相互作用生成絡合物再進行測定。研究者利用鑭系金屬有機骨架出色的光學特性[30],將Tb3+和Cu2+引入到金屬有機骨架中設計了發(fā)光探針,通過肌氨酸與Cu2+之間的強相互作用來影響傳感器的發(fā)光性質(zhì),檢出限為0.23 μmol/L[16]。近兩年也報道了基于核酸適體的熒光光譜法,肌氨酸核酸適體于2018年首次合成,對肌氨酸具有嚴格的識別行為和高度的親和力(解離常數(shù)為134.8±1.12 nmol/L),用于肌氨酸檢測,不受內(nèi)源性丙氨酸干擾[31]。2019年Canan ?zyurt 等[31]使用氧化石墨烯輔助的配體指數(shù)富集技術又篩選了兩個特異性的DNA 核酸適體9S 和13S,顯著降低了解離常數(shù),相比2018年報道的核酸適體熒光法,其檢出限降低了5 個數(shù)量級,低至0.5 pmol/L,是現(xiàn)有檢測方法中檢出限最低的方法,線性范圍達到6 個數(shù)量級,核酸適體的應用避免了復雜繁瑣的衍生和樣品預處理步驟[32]。

    3 小結與展望

    本文綜述了肌氨酸在前列腺癌早期篩查和等級評分中的應用價值及近十年來的檢測方法。肌氨酸定量方法種類多,早期不同的檢測方法的結果差異性大,而且全自動化檢測方法較少,嚴重制約了肌氨酸在臨床上的應用。比色法有成品的試劑盒,操作簡便,對儀器設備要求不高,適合醫(yī)院大規(guī)模檢測,未來應該更多的開發(fā)納米酶的潛在應用價值。色譜?質(zhì)譜檢測方法難以在基層單位開展,其需要昂貴的檢測費用和特殊的專業(yè)技術操作人員,但準確性和重復性都非常好。電化學方法近年來通過使用分子印跡聚合物等極大降低了肌氨酸檢測的檢出限,并提高了選擇性,電化學方法和熒光光譜法未來應該朝連續(xù)、自動化、快速和計算機方向發(fā)展,通過自動化儀器向醫(yī)院推廣。實驗室可根據(jù)檢測目的和自身實驗室條件選擇合適的檢測方法,建立普通人群和前列腺相關疾病的肌氨酸數(shù)據(jù)庫,提高肌氨酸生物標志物早期篩查的靈敏度和準確性。總之,如何選擇和互補不同的檢測方法,改善檢測方法的性能參數(shù),提高肌氨酸檢測的臨床應用價值是檢驗工作人員一致的追求方向。

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