一種高效溶磷解鉀微生物菌劑的篩選及應(yīng)用研究

張心青，田杰偉，馬娜娜，蔡倩倩，王紅霞，部麗群

（1.黃河三角洲京博化工研究院有限公司，山東 濱州 256500；2.山東京博控股集團(tuán)有限公司，山東 濱州 256500）

施用化肥是補(bǔ)充土壤養(yǎng)分的重要措施，化肥在促進(jìn)作物生長(zhǎng)發(fā)育、提高作物產(chǎn)量中發(fā)揮了巨大作用，但肥料利用率低造成的土壤質(zhì)量退化、養(yǎng)分流失、微生物數(shù)量減少等一系列負(fù)面影響已成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)面臨的主要難題，可持續(xù)化生產(chǎn)已然成為未來(lái)農(nóng)業(yè)發(fā)展的必然趨勢(shì)。氮、磷、鉀作為農(nóng)作物生長(zhǎng)發(fā)育所必須的三大營(yíng)養(yǎng)元素，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著極其重要的作用。我國(guó)土壤中含有豐富的磷鉀元素，但絕大多數(shù)的磷鉀元素都是以難溶性鹽的形式存在，其中90%以上不能被植物直接吸收利用。如何提高土壤中磷鉀含量，成為限制農(nóng)作物生長(zhǎng)的重要因素。為了提高農(nóng)作物產(chǎn)量，需要每年施用大量的化學(xué)肥料或有機(jī)肥料，但施入的肥料利用率卻極低，并不能被農(nóng)作物有效吸收利用，當(dāng)季利用率低于25%。由于化學(xué)肥料的大量施用及施肥結(jié)構(gòu)的不合理，造成了我國(guó)的農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境污染和破壞以及土壤理化性能下降。已有大量的研究表明，土壤中存在許多有益微生物，其中部分微生物具有溶磷、解鉀效果，能夠?qū)⒅参镫y吸收的養(yǎng)分轉(zhuǎn)化為植物可吸收利用的形態(tài)，進(jìn)而在降低化肥使用量的同時(shí)提高作用的產(chǎn)量。若增加土壤中此類有益微生物的含量，能夠有效將土壤中不溶性養(yǎng)分轉(zhuǎn)化為作物可直接吸收利用的養(yǎng)分，降低肥料的使用量和成本，提高產(chǎn)量，同時(shí)降低大量肥料使用對(duì)生態(tài)環(huán)境造成的破壞。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株 試驗(yàn)所用的WB1、Q1、L4 均是從番茄、黃瓜及小麥等大田連作土壤中分離得到的，對(duì)照菌株巨大芽孢桿菌11、西安膠質(zhì)芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌均為本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 試驗(yàn)用培養(yǎng)基 ①LB 培養(yǎng)基（1 L）：氯化鈉10 g、蛋白胨10 g、酵母粉5 g，攪拌至完全溶解后定容至1 000 mL，固體培養(yǎng)基加入1.8%～2%的瓊脂粉，121℃滅菌20 min。②PDA 培養(yǎng)基（1 L）：取200 g土豆去皮切塊，于800～900 mL 蒸餾水中煮30～40 min，冷卻后過(guò)濾，濾液中加入20 g 葡萄糖，攪拌至完全溶解后定容至1 000 mL，固體培養(yǎng)基加入1.8%～2%的瓊脂粉后，分裝入三角瓶?jī)?nèi)并用紗布封口，121 ℃滅菌20 min。③發(fā)酵培養(yǎng)基（1 L）：葡萄糖10 g，酵母膏3 g，KHPO·3HO 2 g，MgSO0.25 g，豆粕20 g，氯化鈉10 g，pH 值7.5，用蒸餾水混勻并定容至1 000 mL，121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 主要設(shè)備 XSP-BM 系列生物顯微鏡購(gòu)自上海彼愛姆光學(xué)儀器制造有限公司；SHP-150 智能生化培養(yǎng)箱購(gòu)自上海博迅實(shí)業(yè)股份有限公司；SW-CJ-2F 超凈工作臺(tái)購(gòu)自蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司；恒溫振蕩器購(gòu)自上海旻泉儀器有限公司；TG-16WS 臺(tái)式高速離心機(jī)購(gòu)自長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司；ARTP 常壓室溫等離子體誘變系統(tǒng)購(gòu)自北京思清源生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 溶磷解鉀菌株的篩選（1）菌株的分離純化。本研究篩菌所用的土壤采集自山東省濱州市番茄根際土、黃瓜根際土、小麥根際土。稱取10 g 土壤樣品，置于90 mL 無(wú)菌水中，放于35 ℃搖床中振蕩處理2 h，制成土壤菌懸液。然后對(duì)菌懸液進(jìn)行梯度稀釋后涂布在LB 固體培養(yǎng)基上，倒置于生化培養(yǎng)箱中30 ℃培養(yǎng)1～3 d。挑取平板上菌落形態(tài)不同的菌株在新的LB 固體培養(yǎng)基上劃線分離純化，將分離純化的純菌進(jìn)行保存。

（2）溶磷解鉀菌株的初篩。先將融化后的1.5%素瓊脂（已滅菌）倒入已滅菌的平板中，形成一層薄薄的瓊脂層，使其恰好覆蓋平板底部。待瓊脂凝固后，每個(gè)平板按照等邊三角形的三個(gè)角放置3 個(gè)牛津杯，每個(gè)平板倒入10 mL 初篩培養(yǎng)基，待凝固后用滅菌的鑷子將牛津杯取出。每個(gè)孔內(nèi)加入相應(yīng)初篩菌液30 μL，于30 ℃培養(yǎng)5～7 d。用直尺測(cè)量透明圈的直徑（D）和菌斑的直徑（d），根據(jù)公式（1）計(jì)算直徑比（M）。

式中，M 為直徑比；D 為透明圈直徑；d 為菌斑直徑。

（3）溶磷解鉀菌株的復(fù)篩。將待測(cè)菌株轉(zhuǎn)接入LB 液體培養(yǎng)基內(nèi)，35 ℃170 r·min過(guò)夜培養(yǎng)，測(cè)定OD600，用LB 液體培養(yǎng)基調(diào)節(jié)各菌液的OD600 相同，按照相同的比例添加至對(duì)應(yīng)的復(fù)篩液體培養(yǎng)基內(nèi)，32 ℃170 r·min處理7 d，將發(fā)酵培養(yǎng)液置于離心管中，12 000 r·min離心取上清液，用鉬銻抗顯色法和火焰光度法分別檢測(cè)可溶性磷和鉀離子濃度的變化情況，對(duì)比溶磷能力和解鉀能力。

1.2.2 溶磷解鉀菌株的誘變 采用ARTP 的方法進(jìn)行誘變，通過(guò)設(shè)置不同的誘變條件，得到誘變曲線。設(shè)置通氣量為10 SLM，功率為120 W，誘變時(shí)間 依次 為0，10，30，60，70，80，90，100，110，120 s。將誘變后的載片置于1 mL 無(wú)菌水中，振蕩1 min以上，梯度稀釋至10，取65 μL 涂布，過(guò)夜培養(yǎng)后，計(jì)數(shù)，計(jì)算致死率，繪制致死率曲線，確定最佳誘變條件。

以最佳誘變條件對(duì)無(wú)機(jī)磷溶解菌菌株和解鉀菌菌株進(jìn)行誘變。將誘變后的載片置于1 mL 無(wú)菌水中，振蕩1 min 以上，梯度稀釋至10，培養(yǎng)過(guò)夜后，挑取突變子于4 ℃保存。

采用初篩和復(fù)篩的方法對(duì)誘變子進(jìn)行篩選，篩選方法見1.2.1。

1.3 大田試驗(yàn)

將活化后的Q1、L4、WB1 于5 500 r·min4 ℃離心15 min，去掉上清液，其中WB1 離心前添加絮凝劑吸附，用蒸餾水重懸，將菌液和肥料按照表1所示的量進(jìn)行添加，每棵番茄苗按照10 mL 的量澆灌，每周取樣檢測(cè)土壤中有效磷和速效鉀含量的變化情況。

表1 大田番茄試驗(yàn)體系配制方案

2 結(jié)果與分析

2.1 溶磷解鉀菌株的篩選

2.1.1 菌株的分離純化 通過(guò)各地大田采集土樣等方式，共獲得了23 種樣品，并對(duì)這23 種樣品進(jìn)行了分離純化，經(jīng)過(guò)分離純化得到了84 種單菌。

2.1.2 溶磷解鉀菌株的初篩 通過(guò)對(duì)84 株單菌進(jìn)行有機(jī)磷溶解菌的初篩，以實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有菌種庫(kù)中溶磷效果最好的菌株巨大芽孢桿菌11 為對(duì)照菌株，初步篩選得到溶磷能力較對(duì)照菌株提高菌株有13 株，具體見圖1，初篩試驗(yàn)中部分菌株溶解圈的效果圖見圖2。

圖1 有機(jī)磷溶解菌的初篩結(jié)果

圖2 有機(jī)磷溶解菌的溶解圈

通過(guò)對(duì)84 株單菌進(jìn)行無(wú)機(jī)磷溶解菌的初篩，以實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有菌種庫(kù)中溶磷效果最好的菌株凝結(jié)芽孢桿菌為對(duì)照菌株，初步篩選得到溶磷能力較對(duì)照菌株提高菌株5 株，具體見圖3。

圖3 溶無(wú)機(jī)磷菌的初篩結(jié)果

通過(guò)對(duì)84 株單菌進(jìn)行解鉀菌的初篩，以實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有菌種庫(kù)中解鉀效果最好的菌株西安膠質(zhì)芽孢桿菌為對(duì)照菌株，篩選得到解鉀能力較好的菌株8 株，其中最高的為L(zhǎng)4。具體見圖4。

圖4 解鉀菌的初篩結(jié)果

2.1.3 溶磷解鉀菌株的復(fù)篩 對(duì)初篩得到的有機(jī)磷溶解效果較好的菌株進(jìn)行了復(fù)篩，通過(guò)復(fù)篩發(fā)現(xiàn)，其中溶磷能力高于對(duì)照菌株巨大芽孢桿菌11 的有10株（見圖5），溶磷能力提高50%以上的有6 株，提高120%以上的有1 株（Q1）。經(jīng)過(guò)16S rDNA 鑒定確定Q1 為解淀粉芽孢桿菌。

圖5 有機(jī)磷溶解菌的復(fù)篩結(jié)果

對(duì)初篩得到的無(wú)機(jī)磷溶解效果較好的菌株進(jìn)行了復(fù)篩，其中溶磷能力高于對(duì)照菌株的有4 株（圖6）。溶磷能力提高5%以上的有2 株。將這4 株復(fù)篩效果較好的菌株又進(jìn)行了同批次對(duì)比處理，通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，仍然是WB1 的溶磷能力最高，因此選定WB1 為誘變出發(fā)菌株。經(jīng)過(guò)16S rDNA 鑒定和BioLOG 鑒定確定WB1 為產(chǎn)酸克雷伯氏菌。

圖6 無(wú)機(jī)磷溶解菌的復(fù)篩結(jié)果

對(duì)8 株初篩得到的解鉀效果較好的菌株進(jìn)行了復(fù)篩（表2），以西安膠質(zhì)芽孢桿菌作為對(duì)照菌株，培養(yǎng)4 d 后，L4 釋放鉀離子含量為33.88 μg·mL，pH值為5.59，鉀離子含量高于對(duì)照組西安膠質(zhì)芽孢桿菌269.06%，高于空白組35.2%，TU13 菌株在培養(yǎng)6 d 時(shí)，鉀離子含量達(dá)到最大為30.79 μg·mL，pH 值為4.68，選擇L4 進(jìn)行下一步誘變處理。經(jīng)過(guò)16S rDNA 鑒定確定L4 為枯草芽孢桿菌。

表2 解鉀菌復(fù)篩檢測(cè)結(jié)果

2.2 溶磷解鉀菌株的誘變

由圖7 可知，致死率隨著ARTP 誘變時(shí)間的延長(zhǎng)而增長(zhǎng)，誘變時(shí)間在90 s 內(nèi)時(shí)致死率呈急劇增長(zhǎng)趨勢(shì)，90 s 時(shí)致死率為89.91%，故確定最佳誘變條件為80～90 s。

圖7 ARTP 誘變?cè)囼?yàn)

根據(jù)上述確定的最佳誘變條件，進(jìn)行了4 批次的無(wú)機(jī)磷溶解菌的誘變，共計(jì)獲得誘變子833 個(gè)，并完成了對(duì)這833 個(gè)誘變子的初篩，從溶磷圈的直徑比D/d 來(lái)看，其中正突變子有364 個(gè)，其余為負(fù)突變子，直徑比D/d 明顯較誘變出發(fā)菌株增大的有56 株菌（圖8）。

圖8 正突變子的溶磷圈

選取初篩效果較好的無(wú)機(jī)磷溶解菌株188 株進(jìn)行了復(fù)篩，從檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，有110 個(gè)正突變子，溶磷能力較誘變出發(fā)菌株（野生菌WB1）提高30%以上的有6 株，提高40%以上的有1 株，為4p-462（44.10%），提高60%以上的有1 株，為4p-449（63.23%），確定后期應(yīng)用4p-449 誘變子（表3）。

表3 溶磷菌部分誘變子復(fù)篩結(jié)果

進(jìn)行了2 批次的解鉀菌的誘變，共計(jì)獲得誘變子410 個(gè)，并完成了對(duì)這410 個(gè)誘變子的初篩，從溶磷圈的直徑比D/d 來(lái)看，其中正突變子有7 個(gè)，誘變子編號(hào)分別為編號(hào)為6、7、13、55、57、64、82。

選取初篩效果較好的菌株7 株進(jìn)行了復(fù)篩，從檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，編號(hào)為64 的菌株培養(yǎng)7 d 后，鉀離子含量高于對(duì)照原始菌30.94%，pH 值為6.52，確定后期應(yīng)用編號(hào)為64 誘變子（表4）。

表4 解鉀菌部分誘變子復(fù)篩結(jié)果

2.3 溶磷解鉀菌的大田試驗(yàn)

空白組、L4+WB1、L4+Q1 3 個(gè)組做對(duì)比，速效鉀和可溶性磷呈先下降后上升的趨勢(shì)。其中，21 d 后，L4+WB1 組、L4+Q1 組的速效鉀和有效磷含量都提高了100%以上，甚至有的提高200%以上，充分說(shuō)明溶磷解鉀菌能夠釋放土壤中的難溶性磷、鉀；隨著植物生長(zhǎng)，速效鉀和有效磷含量略有下降，但基本能夠維持在一定的水平，且高于空白組，說(shuō)明解鉀菌L4、溶磷菌WB1、Q1 能夠成功定植土壤，并發(fā)揮了高效溶磷解鉀的作用。

減肥40%+L4+WB1、減肥20%+L4+WB1、全肥試驗(yàn)組在施用微生物菌劑肥料后，速效鉀、可溶性磷均大幅升高，其中減肥40%+L4+WB1 和減肥20%+L4+WB1 2 組試驗(yàn)組呈先下降后上升的趨勢(shì)，全肥組一直呈下降趨勢(shì)，21 d 后，減肥組的有效磷和速效鉀含量高于全肥組50%以上；直到下一次施肥，全肥組有效磷和速效鉀含量略有升高，后又呈下降趨勢(shì)，而減肥40%+L4+WB1 和減肥20%+L4+WB1 2組能夠維持一直高于全肥組，說(shuō)明添加解鉀溶磷復(fù)合菌劑后，在減肥40%情況下，土壤中溶磷解鉀菌持續(xù)釋放土壤中速效鉀、可溶性磷，避免植物生長(zhǎng)對(duì)速效鉀、可溶性磷大量使用后下降的情況出現(xiàn)，使其含量能夠高于施用全肥的效果，滿足植物生長(zhǎng)需求。

對(duì)大棚種植番茄株高、莖粗進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)對(duì)平均值的對(duì)比，其中，試驗(yàn)組WB1+L4 和試驗(yàn)組Q1+L4，莖粗分別為10.98，10.97 mm，株高分別為189，202.05 mm。試驗(yàn)組減肥40%+WB1+L4 與試驗(yàn)組減肥20%+WB1+L4、全肥（未接種解磷解鉀菌劑），莖粗分別為9.96，10.30，10.8 mm，株高分別為188.83，190.75，181.58 mm。通過(guò)減肥組與復(fù)合菌劑組的對(duì)比，復(fù)合菌劑組株高、莖粗略高于減肥組、全肥組，說(shuō)明僅添加復(fù)合菌劑的試驗(yàn)組中番茄生長(zhǎng)未出現(xiàn)明顯影響，能夠達(dá)到與施用全肥相當(dāng)?shù)男Ч??？紤]番茄苗種植前，土壤中施用過(guò)一次有機(jī)肥作為底肥，解鉀溶磷復(fù)合菌劑定植土壤后，主要起到了持續(xù)釋放土壤中難溶性鉀元素、磷元素的作用，使土壤保持豐富磷鉀元素，滿足植物生長(zhǎng)需求，可以有效減少后期追肥次數(shù)及肥料施用量。

3 結(jié)論與討論

本研究開發(fā)的高效溶磷解鉀微生物菌劑具有高效溶磷解鉀功能，經(jīng)過(guò)誘變改造，溶磷解鉀功能提高30%以上，且該菌劑在土壤中的定植情況良好，能夠提高土壤中速效磷含量3 倍以上，提高速效鉀含量30%以上；通過(guò)大田試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高效溶磷解鉀微生物菌劑能夠有效促進(jìn)植物的生長(zhǎng)，植株生物量提高25%以上，莖粗提高5%以上，有效提高植株的抗逆性。大田應(yīng)用發(fā)現(xiàn)，溶磷解鉀菌劑的添加能夠有效釋放土壤中的磷、鉀元素，通過(guò)減肥組與全肥組對(duì)比，復(fù)合菌劑組與施肥組對(duì)比，發(fā)現(xiàn)施用復(fù)合菌劑組土壤中有效磷和速效鉀含量能夠達(dá)到施肥組的水平，效果明顯，且施用復(fù)合菌劑組的番茄莖粗和株高與施肥組相當(dāng)，甚至高于空白組，這與溶磷解鉀菌不僅具有溶磷解鉀功能，還具有固氮等其他功能有關(guān)。