煙草根黑腐病抗性位點(diǎn)RBRR1的InDel分子標(biāo)記開發(fā)與分析

馮智宇，陳學(xué)軍，蓋曉彤，姜寧，焦芳嬋，吳興富，童治軍，劉天彥，楊林明，許美玲，李永平*

生物技術(shù)

煙草根黑腐病抗性位點(diǎn)的InDel分子標(biāo)記開發(fā)與分析

馮智宇1，陳學(xué)軍1，蓋曉彤1，姜寧1，焦芳嬋1，吳興富1，童治軍1，劉天彥2，楊林明2，許美玲1，李永平1*

1云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，云南省昆明市五華區(qū)圓通街33號(hào)，650021；2云南省煙草公司曲靖市公司，云南省曲靖市麒麟?yún)^(qū)玄天路51號(hào)，655099

【背景和目的】是通過遠(yuǎn)緣雜交與回交導(dǎo)入栽培煙草的一個(gè)單顯性廣譜型根黑腐病抗病位點(diǎn)，為了開發(fā)基于該位點(diǎn)的簡(jiǎn)單高效穩(wěn)定且成本低的緊密連鎖分子標(biāo)記。【方法】在已有酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列（Cleaved amplified polymorphism sequences, CAPS）標(biāo)記相關(guān)序列基礎(chǔ)上，利用云曬1號(hào)基因組與抗、感根黑腐病材料重測(cè)序信息，基于其序列插入/缺失（Insertion/Deletion, InDel）多態(tài)性設(shè)計(jì)抗病相關(guān)分子標(biāo)記，并開展遺傳效應(yīng)和遺傳變異分析?！窘Y(jié)果】篩選到4對(duì)具有良好多態(tài)性的引物，在目標(biāo)單株的分子標(biāo)記輔助選擇中具備便捷、高效且呈共顯性的特點(diǎn)。遺傳效應(yīng)分析表明，通過分子標(biāo)記輔助選擇導(dǎo)入位點(diǎn)能夠極顯著提高栽培煙草根黑腐病抗性。遺傳變異分析結(jié)果顯示，在煙草核心種質(zhì)資源中僅有白肋煙TN90和SoTa2攜帶有抗病基因，并發(fā)現(xiàn)4對(duì)引物在普通煙草自然群體中呈現(xiàn)2種基因型?！窘Y(jié)論】抗病位點(diǎn)在我國(guó)尚未進(jìn)行廣泛利用，具有較高的利用價(jià)值；而開發(fā)的4個(gè)InDel標(biāo)記可用于該抗性位點(diǎn)的分子標(biāo)記輔助選擇育種和后續(xù)抗病基因的精細(xì)定位與克隆。

煙草；根黑腐；根串珠霉菌；分子標(biāo)記輔助選擇；InDel標(biāo)記

煙草根黑腐?。˙lack root rot, BRR）是由土壤真菌根串珠霉菌（）引起的一種常見土傳病害[1]。該病害在世界主要煙葉產(chǎn)區(qū)廣泛分 布[2-3]，在我國(guó)云南、貴州等煙葉主產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生[4-5]。煙草根黑腐病的特征是煙草根和幼莖基部等部位出現(xiàn)黑色病變，進(jìn)而導(dǎo)致煙草營(yíng)養(yǎng)缺乏、發(fā)育遲緩，嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)倒伏、死亡，或?qū)е鲁芍昶谥仓臧?、長(zhǎng)勢(shì)不均勻、葉片皺縮或萎蔫、成熟期推遲，從而嚴(yán)重影響煙草產(chǎn)量和質(zhì)量[1,6]。盡管輪作及施用化學(xué)藥劑能有效防控根黑腐病，但增加了煙草種植成本且易造成環(huán)境污染[7]，故選育并種植抗根黑腐病品種是一種經(jīng)濟(jì)有效且可持續(xù)的防治策略。

迪勃納氏煙草（i，2n = 4x = 48）是源于澳大利亞的一種野生煙草，它不僅是研究雜交特性的理想材料，而且攜帶煙草根黑腐病、霜霉病和白粉病等多種病害抗性基因，已成為煙草抗病性狀改良的有效遺傳資源[8-9]。通過種間雜交和回交，迪勃納氏煙草根黑腐病的顯性抗病基因已成功被轉(zhuǎn)育到白肋煙與烤煙等栽培煙草中[10-11]。例如，Tennessee 90（TN90）是美國(guó)田納西州立大學(xué)用Burley49和PVY202雜交選育而成的優(yōu)良品種，對(duì)煙草普通花葉病毒?。? TMV）、煙草脈斑駁病毒?。? TVMV）、煙草蝕紋病毒?。? TEV）、馬鈴薯Y病毒（Y, PVY）、煙草野火病（）、煙草根黑腐病等多種病害表現(xiàn)明顯抗性；其中，TN90的根黑腐抗性（基因）從品種Burley49繼承而來，而Burley49的原始抗性供體是迪勃納氏煙草[11-12]。前人研究發(fā)現(xiàn)對(duì)煙草根黑腐病具有完全抗性，并在煙草各生育階段均對(duì)根串珠霉菌具有較高的免疫能力[11,13]。通過基因分型測(cè)序（genotyping-by-sequencing, GBS）方法，煙草抗性位點(diǎn)已被定位在煙草17號(hào)染色體（K326參考基因組）上，SS219555和SS192650是與其共分離的共顯性酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列（Cleaved amplified polymorphism sequences, CAPS）標(biāo)記[14]。然而，CAPS標(biāo)記必須使用限制性內(nèi)切酶，需要較冗長(zhǎng)的分析步驟，增加了CAPS標(biāo)記的使用成本和實(shí)驗(yàn)難度，并受限于酶切效率不能適應(yīng)高通量自動(dòng)化檢測(cè)[15]；此外，各種突變會(huì)引起酶切位點(diǎn)的增加或消失，極大限制了兩個(gè)分子標(biāo)記在分子標(biāo)記輔助選擇育種（Molecular marker assisted selection, MAS）中的應(yīng)用。因此，開發(fā)一種方便檢測(cè)且能適應(yīng)高通量要求的根黑腐病抗性分子標(biāo)記，是開展煙草根黑腐病品種選育的迫切需求。

本文基于與連鎖的CAPS標(biāo)記的引物序列，以云曬1號(hào)（G306）基因組為參考，錨定了抗病位點(diǎn)的物理區(qū)間；又通過對(duì)攜帶抗病基因材料TN90和感病材料云煙87的重測(cè)序數(shù)據(jù)的遺傳差異分析，開發(fā)并篩選獲得了方便檢測(cè)的插入/缺失（Insertion/Deletion, InDel）分子標(biāo)記。隨后，利用這些分子標(biāo)記進(jìn)行了標(biāo)記輔助抗病選育，鑒定了抗病位點(diǎn)導(dǎo)入的遺傳效應(yīng)，并分析了位點(diǎn)在煙草核心種質(zhì)資源中的分布，為下一步開展烤煙抗根黑腐病品種選育及基因的克隆奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

所用材料為攜帶有抗性位點(diǎn)的普通煙草TN90與烤煙主栽品種云煙87。前期研究中，以TN90為供體親本、以云煙87為受體親本，通過連續(xù)回交獲得了74個(gè)BC3F1單株產(chǎn)生的74份BC3F2種子，作為74個(gè)BC3F1:2家系。從這些家系中發(fā)現(xiàn)14個(gè)家系含有抗病位點(diǎn)，選取一個(gè)含有抗病位點(diǎn)的TN90/云煙87衍生的BC3F2群體用于新開發(fā)/轉(zhuǎn)化標(biāo)記的驗(yàn)證，并結(jié)合分子標(biāo)記輔助選育方法篩選BC3F2群體中純合抗性位點(diǎn)基因型和純合感病基因型單株用于抗性表型鑒定。以337份不同煙草類型種質(zhì)資源為研究材料分析抗性位點(diǎn)的等位基因頻率分布。兩份親本材料和337份種質(zhì)資源來源于云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院種質(zhì)庫(kù)。

病原菌根串珠霉菌（）由西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院竇彥霞老師提供[1,16]。

1.2 引物設(shè)計(jì)及優(yōu)化

前人已測(cè)序獲得了根黑腐病抗病和感病材料中SS219555和SS192650標(biāo)記所在位點(diǎn)的擴(kuò)增序列[14]，據(jù)此研究結(jié)果，利用軟件DNAMan（Version 9.0.1.116）分別對(duì)每個(gè)標(biāo)記所在位點(diǎn)抗、感材料中的等位序列進(jìn)行序列對(duì)比分析，根據(jù)序列的插入缺失（InDel）差異設(shè)計(jì)開發(fā)標(biāo)記，將兩個(gè)共分離CAPS標(biāo)記轉(zhuǎn)化成免酶切的InDel類型標(biāo)記。

前期研究中已獲取了云曬1號(hào)（G306）的基因組序列和普通煙草TN90和云煙87的重測(cè)序序列（尚未發(fā)表）。本文以云曬1號(hào)為參考序列，通過BLAST方法錨定SS219555和SS192650標(biāo)記之間的物理區(qū)段，并分析TN90和云煙87重測(cè)序數(shù)據(jù)以獲取兩者之間的序列差異信息。隨后，根據(jù)兩個(gè)CAPS標(biāo)記所在物理區(qū)間內(nèi)的InDel差異位點(diǎn)設(shè)計(jì)開發(fā)標(biāo)記。

參照吳迷等[17]所述方法進(jìn)行InDel分子標(biāo)記開發(fā)并稍作改良。具體步驟如下：篩選出插入/缺失大于等于5 bp的InDel位點(diǎn)，提取InDel位點(diǎn)上下游125 bp序列并生成fasta文件，使用BatchPrimer3（v1.0, https:// wheat.pw.usda.gov/demos/BatchPrimer3/）批量設(shè)計(jì)引物，引物長(zhǎng)度范圍為18～27 bp，最適長(zhǎng)度21 bp，GC含量范圍在40%～60%之間，擴(kuò)增片段150～200 bp，最優(yōu)擴(kuò)增片段180 bp。對(duì)返回的設(shè)計(jì)結(jié)果進(jìn)行檢查和手動(dòng)調(diào)整。為了提高特異性，本文對(duì)BRR_LG2_InD-5標(biāo)記進(jìn)行PCR擴(kuò)增測(cè)序和引物設(shè)計(jì)優(yōu)化。

為了豐富抗病位點(diǎn)的檢測(cè)方式以滿足不同育種科技工作者的需求，基于本研究所獲InDel標(biāo)記只有2種基因型的特點(diǎn)，結(jié)合云煙87和TN90的重測(cè)序數(shù)據(jù)，靶向InDel標(biāo)記在雙親中擴(kuò)增序列的序列差異之處，設(shè)計(jì)TN90序列特異的引物，將部分InDel共顯性標(biāo)記轉(zhuǎn)化為顯性標(biāo)記，并對(duì)其做了試驗(yàn)驗(yàn)證，共篩選出3個(gè)顯性標(biāo)記。

1.3 DNA提取、PCR擴(kuò)增和電泳檢測(cè)

選用植物基因組提取試劑盒（天根生化科技(北京)有限公司）提取供試材料基因組DNA，具體操作步驟按說明書進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系：2×DreamTaq Green PCR Master Mix（dNTP濃度為0.4 mmol/L, Mg2+（濃度為4 mmol/L）5 μL），正、反引物（2 μmoL/L）各1 μL，DNA模板2 μL（濃度50～100 ng/μL），補(bǔ)充ddH2O到10 μL。PCR程序設(shè)置：95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，設(shè)置35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物用8%的聚丙烯酰胺凝膠或1%的瓊脂糖電泳檢測(cè)。

1.4 煙草根黑腐抗性鑒定

按照Chen等描述的根部擴(kuò)散法（Root irradiation）進(jìn)行煙草根黑腐病抗性鑒定[18]。在人工氣候室采用滅菌土培養(yǎng)煙草供試材料，設(shè)定（30±1）℃/（28±1）℃的日/夜溫度、85%～90%的相對(duì)濕度以及14 h的光照時(shí)間，直至第4片真葉出現(xiàn)。同時(shí)，將單孢分離得到的根串珠霉菌（）病原菌接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potato dextrose agar, PDA）平板上，在25℃暗箱培養(yǎng)10～15 d，收獲分生孢子后，用無(wú)菌水配成孢子濃度為107孢子/mL的懸浮液。利用無(wú)菌剪刀對(duì)四葉期煙苗的莖基兩側(cè)根系進(jìn)行輕微傷害，立即灌根接種20 mL的孢子懸浮液于煙株莖基部，并隨后將供試煙苗放置于人工氣候室進(jìn)行培養(yǎng)。在接種后第15 d，第一片枯萎葉片出現(xiàn)時(shí)，用清水洗凈煙株根系，參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 23222—2008進(jìn)行病害等級(jí)鑒定，計(jì)算病情指數(shù)（disease severity index, DSI）。所有對(duì)照處理用滅菌水進(jìn)行。試驗(yàn)設(shè)計(jì)采取隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，共設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)每個(gè)基因型包含15個(gè)單株。每個(gè)重復(fù)獨(dú)立計(jì)算病情指數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 RBRR1抗性位點(diǎn)共顯性分子標(biāo)記的轉(zhuǎn)化、開發(fā)及優(yōu)化

抗病和感病材料SS219555和SS192650標(biāo)記所在DNA擴(kuò)增區(qū)段序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)，在SS192650標(biāo)記位點(diǎn)817 bp的序列區(qū)間內(nèi)共檢測(cè)到50個(gè)單核苷酸多態(tài)性（Single-nucleotide polymorphism, SNP）和5個(gè)InDel差異位點(diǎn)，其中有2個(gè)InDel位點(diǎn)序列差異大于5 bp；在SS219555標(biāo)記位點(diǎn)629 bp的序列區(qū)間內(nèi)共檢測(cè)到9個(gè)SNP和4個(gè)InDel差異位點(diǎn)，其中有2個(gè)InDel位點(diǎn)序列差異大于5 bp（圖1）。根據(jù)SS192650位點(diǎn)和SS219555位點(diǎn)的InDel差異信息分別設(shè)計(jì)1對(duì)和3對(duì)引物（圖1；表1）。利用含有抗病基因的材料TN90和不含該抗病位點(diǎn)的材料云煙87對(duì)引物進(jìn)行差異分析，其中InD192650和InD219555-3F/3R具有良好的多態(tài)性（圖2）。

注：（a）SS192650位點(diǎn)的序列對(duì)比；（b）SS219555位點(diǎn)的序列對(duì)比。紅色框和箭頭顯示轉(zhuǎn)化InDel分子標(biāo)記所在位置。TKF2002和TKF7002分別是前人報(bào)道的抗性和感病材料。

表1 轉(zhuǎn)化與開發(fā)的RBRR1抗性位點(diǎn)共顯性標(biāo)記

注：泳道1和2為云煙87；泳道5和6為TN90；泳道3和4為F1。

以云曬1號(hào)基因組序列為參考，通過BLAST方法將SS219555和SS192650標(biāo)記錨定到其Chr2染色體上，并將兩者之間的物理區(qū)段（191,732,059～193,313,373）作為目標(biāo)區(qū)間。利用TN90和云煙87重測(cè)序數(shù)據(jù)以及云曬1號(hào)參考基因組序列對(duì)目標(biāo)區(qū)間開發(fā)InDel分子標(biāo)記，在目標(biāo)區(qū)間內(nèi)共獲得6個(gè)InDel標(biāo)記，分別命名為BBR-LG2-InDel-1～6（表1）。對(duì)這些標(biāo)記進(jìn)行篩選，共有2個(gè)標(biāo)記具有較好的多態(tài)性，分別是BRR_LG2_InD-2和-5（圖2）。

在后續(xù)的標(biāo)記使用過程中，BRR_LG2_InD-5在分離群體中表現(xiàn)出3種以上帶型，不利于準(zhǔn)確讀取基因型。因此，我們進(jìn)一步對(duì)BRR_LG2_InD-5標(biāo)記進(jìn)行優(yōu)化，在多態(tài)性位點(diǎn)兩側(cè)分別增設(shè)1條正引物和4條反引物（表1）。通過BRR_LG2_InD-5標(biāo)記多條正反引物的組合及篩選，檢測(cè)結(jié)果顯示BRR_LG2_InD-5- 2F/2R，-2F/4R和-2F/5R均具有良好的多態(tài)性，其中BRR_LG2_InD-5-2F/4R的條帶比較清晰（圖3）。然而，在TN90/云煙87的分離群體中進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，雖然3個(gè)標(biāo)記能夠檢測(cè)出抗性位點(diǎn)，但是3個(gè)標(biāo)記均表現(xiàn)為顯性標(biāo)記特征，即所有單株基因型均具有云煙87的帶型（圖3）。綜上所述，將InD192650，BRR_LG2_ InD-2，BRR_LG2_InD-5-2F/4R和InD219555-3F/3R作為抗性位點(diǎn)共顯性分子標(biāo)記用于后續(xù)分析。

注：泳道A、F1和B分別為云煙87、雜交1代基因型和TN90；泳道1-15為BC3F2單株。箭頭指示云煙87擴(kuò)增條帶所在位置。

2.2 分子標(biāo)記輔助選擇

本研究前期已獲得以TN90為供體親本、云煙87為輪回親本的74個(gè)BC3F1:2家系。選取每個(gè)家系27個(gè)單株混合取樣用于基因型檢測(cè)，并利用上述轉(zhuǎn)化或開發(fā)的標(biāo)記進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇，共發(fā)現(xiàn)14個(gè)含有抗病位點(diǎn)的株系，這些株系可用作后續(xù)的抗病育種。

2.3 抗性位點(diǎn)的遺傳效應(yīng)分析

為了分析抗病位點(diǎn)導(dǎo)入云煙87后的遺傳效應(yīng)，選取云煙87和TN90衍生的一個(gè)含有抗病位點(diǎn)的BC3F2群體進(jìn)行研究。選用上述4個(gè)分子標(biāo)記進(jìn)行基因型分析，在285個(gè)BC3F2單株中，目標(biāo)區(qū)間基因型為純合抗病位點(diǎn)基因型（記作）、純合感病基因型的材料（記作）及雜合基因型的個(gè)體數(shù)目分別為60、76和149個(gè)，且沒有檢測(cè)到遺傳交換單株。選取和基因型單株在溫室條件下進(jìn)行根黑腐抗病性鑒定。同時(shí)，在同樣條件下考察TN90和云煙87的根黑腐病抗性。結(jié)果表明，云煙87平均病情指數(shù)為59.26%，TN90所有測(cè)試單株均未發(fā)病，其病情指數(shù)為0。對(duì)應(yīng)的和在根黑腐病的抗性上表現(xiàn)出極顯著差異；材料的根黑腐抗病平均病情指數(shù)為20.39%，材料的根黑腐抗病平均病情指數(shù)為72.35%（圖4）。

注：（a）RBRR1位點(diǎn)在染色體上的位置（以云曬1號(hào)為參考基因組）；（b）RBRR1位點(diǎn)的遺傳定位，數(shù)據(jù)參考文獻(xiàn)[14]；（c）RBRR1位點(diǎn)定位區(qū)間各分子標(biāo)記的物理位置；（d）BC3F2世代RBRR1位點(diǎn)的兩種重組類型；（e）BC3F2世代RBRR1+和RBRR1-基因型單株接菌后根系表型（左）和根黑腐病抗性統(tǒng)計(jì)（右）。比例尺=2 cm；**P < 0.01，t測(cè)驗(yàn)。為了方便繪圖，將BRR_LG2_InD-1、-2、-3、-4、-5和-6分別簡(jiǎn)寫為InD-1、-2、-3、-4、-5和-6。

2.4 根黑腐抗性位點(diǎn)的遺傳變異分析

為了進(jìn)一步探究抗病位點(diǎn)在自然群體中的分布，利用4個(gè)InDel標(biāo)記對(duì)包含不同調(diào)制類型的普通煙草（SSTT）材料進(jìn)行基因型分析，以檢測(cè)抗病位點(diǎn)的等位變異頻率。結(jié)果表明，在337份普通煙草核心種質(zhì)資源中，共檢測(cè)到2份煙草材料（Sota2和TN90）含有抗病位點(diǎn)，基因型頻率為0.59 %（表2）。表性鑒定結(jié)果顯示，Sota2與TN90具有相似的根黑腐病抗性表型（表4，圖5）。由此推測(cè)，該抗病位點(diǎn)尚未在我國(guó)煙草生產(chǎn)中普及應(yīng)用。由于上述4個(gè)InDel共顯性標(biāo)記在自然群體中均表現(xiàn)為只有2種基因型，因此，將其中3個(gè)InDel標(biāo)記轉(zhuǎn)化為檢測(cè)抗病位點(diǎn)的特異顯性標(biāo)記，分別為DM192650- 2F/2R、DM219555-2F/2R和DM5-1F/2R，為KASP轉(zhuǎn)化及高通量應(yīng)用奠定基礎(chǔ)（表3，圖5）。

表2 不同材料中RBRR1抗病位點(diǎn)的等位變異頻率

注：SoTa2、Burley21和Kentucky14為白肋煙，Hicks broad leaf、Virginia Gold和Yellow Special為國(guó)外烤煙。

表3 RBRR1抗性位點(diǎn)顯性分子標(biāo)記

表4 部分材料根黑腐病抗性鑒定

注：表中數(shù)據(jù)為不同等級(jí)或死亡單株統(tǒng)計(jì)數(shù)，“.”代表沒有對(duì)應(yīng)等級(jí)單株。加粗的兩個(gè)材料TN90和SoTa2攜帶抗性基因。

3 討論

3.1 RBRR1位點(diǎn)InDel分子標(biāo)記可用于標(biāo)記輔助選擇育種

分子標(biāo)記輔助選擇回交育種已經(jīng)在農(nóng)作物抗病育種、品質(zhì)育種中得到廣泛應(yīng)用[19-22]。在分子標(biāo)記輔助選擇過程中，分子標(biāo)記的可靠性、分子標(biāo)記的多態(tài)性水平、檢測(cè)所需DNA的質(zhì)和量、檢測(cè)流程和檢測(cè)成本被認(rèn)為是限制分子標(biāo)記廣泛應(yīng)用的5個(gè)因素[23]。CAPS標(biāo)記的特點(diǎn)使其適合于相對(duì)較小的實(shí)驗(yàn)室開展定位克隆基因組目標(biāo)區(qū)段/目標(biāo)基因或多態(tài)性分析研究[15]，而在分子標(biāo)記輔助選擇中受限。本研究在前人研究基礎(chǔ)上，錨定了抗性位點(diǎn)的2個(gè)共分離CAPS標(biāo)記SS219555和SS192650的基因組所在物理區(qū)間，并根據(jù)這2個(gè)標(biāo)記的兩翼序列以及TN90和云煙87的重測(cè)序數(shù)據(jù)，基于抗、感材料序列的InDel多態(tài)性轉(zhuǎn)化、開發(fā)獲得多個(gè)共顯性、免酶切的分子標(biāo)記。進(jìn)而，利用InD192650，BRR_LG2_InD-2，BRR_LG2_InD-5-2F/4R和InD219555-3F/3R進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇，篩選出根黑腐抗性顯著提高的BC3F2世代位點(diǎn)純合單株，這些材料可用于后續(xù)的抗根黑腐品種選育。以上結(jié)果表明，本研究轉(zhuǎn)化或開發(fā)的4個(gè)InDel標(biāo)記可用于根黑腐抗性育種的分子標(biāo)記輔助選擇和后續(xù)的抗病基因定位。

小片段易位系是目前將野生資源優(yōu)異基因?qū)肷a(chǎn)作物最為理想的方式。一般來說，具有較小的外來片段的易位系在遺傳上更穩(wěn)定，產(chǎn)生有害影響的可能性更小。例如，在主糧作物小麥的研究中發(fā)現(xiàn)，冰草6P染色體小片段的插入易位系Pubing3035的粒重和穗長(zhǎng)顯著提高，并根據(jù)連鎖圖譜將易位斷點(diǎn)定位在小麥1A染色體短臂的著絲粒附近[24]。與此類似，前人同樣通過遺傳連鎖圖譜將基因定位在17號(hào)染色體（K326基因組）的SS127301和SS166247標(biāo)記之間[14]；同時(shí)，本研究將基因共分離標(biāo)記SS219555和SS192650錨定到Chr2染色體（G306基因組，Chr2長(zhǎng)=201,712,017 bp）長(zhǎng)臂末端，表明基因是以片段易位而非整臂易位的形式被導(dǎo)入到普通煙草中。前人測(cè)序發(fā)現(xiàn)攜帶基因的抗性材料中SS219555和SS192650標(biāo)記兩翼序列與i一致[14]，說明2個(gè)標(biāo)記之間的序列為外源片段。通常情況下，位于一個(gè)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的外源易位插入片段的標(biāo)記表現(xiàn)為顯性標(biāo)記，即只能在外源片段上擴(kuò)增出條帶；然而，在本研究的標(biāo)記開發(fā)鑒定過程中，所轉(zhuǎn)化和開發(fā)的標(biāo)記均為共顯性標(biāo)記。其次，如果插入親緣關(guān)系較近的外源片段，則標(biāo)記在擴(kuò)增攜帶有外源插入片段的親本材料時(shí)（在本研究中為TN90抗性親本）應(yīng)表現(xiàn)為兩條擴(kuò)增條帶，分別是煙草自身和外源片段擴(kuò)增條帶。然而，本研究轉(zhuǎn)化和開發(fā)的標(biāo)記擴(kuò)增TN90時(shí)均為單一條帶。同時(shí)，在對(duì)BRR_LG2_InD-5標(biāo)記的改良過程中，BRR_LG2_InD-5-2F/2R，-2F/4R和-2F/5R在分離群體的所有單株中均能夠擴(kuò)增出云煙87的帶型。綜上，推測(cè)基因是以一個(gè)外源片段替換易位而非插入易位的形式導(dǎo)入到普通煙草，對(duì)攜帶基因抗性材料基因組組成的鑒定尚需要進(jìn)一步研究。

3.2 RBRR1位點(diǎn)在我國(guó)煙草育種中的利用價(jià)值

由于早期栽培所用普通煙草品種對(duì)根黑腐病沒有抗病能力，煙草根黑腐病給全世界煙草種植者造成了巨大的損失。隨后，抗病位點(diǎn)在白肋煙上的應(yīng)用使得根黑腐病情得到了有效控制[5]。本研究發(fā)現(xiàn)，在我國(guó)國(guó)內(nèi)烤煙、國(guó)內(nèi)曬煙和香料煙、國(guó)外引進(jìn)烤煙資源以及國(guó)外引進(jìn)曬煙中均未攜帶抗病位點(diǎn)，僅在引進(jìn)的白肋煙中發(fā)現(xiàn)2個(gè)材料攜帶有該抗病位點(diǎn)，表明抗病位點(diǎn)在我國(guó)尚未進(jìn)行廣泛利用，具有較大的利用價(jià)值。

緊密連鎖標(biāo)記將有助于識(shí)別重組事件，從而打破潛在的不利連鎖。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)來自迪勃納氏煙草的易位小片段不僅攜帶有抗病位點(diǎn)，可能還和一些不良農(nóng)藝性狀及化學(xué)特質(zhì)相關(guān)[25]，限制了在烤煙中的廣泛應(yīng)用。本研究獲得的4個(gè)共顯性InDel標(biāo)記將有助于抗病位點(diǎn)后續(xù)的精細(xì)定位，從而打破連鎖累贅。同時(shí)，遺傳變異分析結(jié)果表明，InD192650，BRR_LG2_InD-2，BRR_LG2_InD-5-2F/4R和InD219555-3F/3R分子標(biāo)記在擴(kuò)增自然群體時(shí)僅表現(xiàn)為2種基因型，而并非如SSR標(biāo)記在擴(kuò)增普通煙草的不同材料時(shí)表現(xiàn)出多種基因型。因此，將其中3個(gè)標(biāo)記轉(zhuǎn)化為檢測(cè)抗病位點(diǎn)的顯性標(biāo)記，為后續(xù)的KASP標(biāo)記轉(zhuǎn)化及高通量基因型鑒定奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究在前人的研究基礎(chǔ)上，以云曬1號(hào)基因組為參考，錨定了煙草根黑腐抗病位點(diǎn)的物理區(qū)間。利用云曬1號(hào)參考基因組與抗、感根黑腐病材料重測(cè)序數(shù)據(jù)，篩選并獲得了4個(gè)多態(tài)性良好、免酶切的煙草根黑腐病抗病基因的緊密連鎖分子標(biāo)記，克服了現(xiàn)有CAPS標(biāo)記的缺點(diǎn)。通過標(biāo)記輔助篩選應(yīng)用和遺傳效應(yīng)分析，鑒定獲得了煙草根黑腐病抗性極顯著提高的云煙87改良株系。通過自然群體遺傳變異分析，發(fā)現(xiàn)4對(duì)引物在普通煙草自然群體中呈現(xiàn)2種基因型，并發(fā)現(xiàn)僅有白肋煙SoTa2與TN90攜帶有抗病位點(diǎn)。綜上所述，抗病位點(diǎn)在我國(guó)尚未進(jìn)行廣泛利用，具有較高的利用價(jià)值，而本研究獲取的4個(gè)分子標(biāo)記能夠簡(jiǎn)單、高效、穩(wěn)定地用于該抗病基因的輔助選育。

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Development and haplotype analysis of insertion–deletion (InDel) molecular markers for resistance locusto black root rot of tobacco ()

FENG Zhiyu1, CHEN Xuejun1, GAI Xiaotong1, JIANG Ning1, JIAO Fangchan1, WU Xingfu1, TONG Zhijun1, LIU Tianyan2, YANG Linming2, XU Meiling1, LI Yongping1*

1 Key Laboratory of Tobacco Biotechnological Breeding, National Tobacco Genetic Engineering Research Center, Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences, Kunming 650021, Yunnan, China;2 Qujing Tobacco Company of Yunnan Province, Qujing 655099, Yunnan, China

is a single dominant broad-spectrum locus coffering resistance to black root rot that was introduced into tobacco () by remote hybridization and backcross, and the development of efficient, stable, low-cost and user-friendly tightly linked molecular markers is an effective approach for resistance breeding by marker-assisted selection and for location of functional gene within the locus.In this study, we anchored the region oflocus based on the primer sequences of published CAPS markers, and acquired four polymorphism markers targeting insertion-deletion (InDel) within the region ofusing the genome sequence of Yunshai#1 as reference and the resequencing data of a pair of resistant and susceptible root black rot materials. These markers were convenient, efficient and codominant in molecular marker-assisted selection of target individuals.Genetic effect analysis showed that the introduction ofthrough marker-assisted selection could significantly improve the resistance to black root rot in cultivated tobacco. Haplotype analysis showed that only TN90 and SoTa2 carriedin the tobacco core germplasm resources, and four pairs of primers presented two genotypes in the natural population of common tobacco.Collectively, our data indicated that the four InDel markers have high utilization value in marker-assisted selection and subsequent mapping of the functional gene.

tobacco, black root rot,, molecular marker-assisted selection, InDel marker

Corresponding author. Email：1303046997@qq.com

中國(guó)煙草總公司云南省煙草公司科技項(xiàng)目“優(yōu)質(zhì)抗病烤煙新品種選育”（2019530000241001）；河北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目“甜瓜根系分泌物中化感物質(zhì)與鐮孢枯萎菌的互作關(guān)系研究”（C2019402430）

馮智宇（1990—），博士，助理研究員，主要從事煙草功能基因組與育種研究，Tel：0877-2075074, Email：ffengzhiyu@163.com

李永平（1966—），Tel：0871-65113766，Email：1303046997@qq.com

2021-11-04；

2022-02-22

馮智宇，陳學(xué)軍，蓋曉彤，等. 煙草根黑腐病抗性位點(diǎn)RBRR1的InDel分子標(biāo)記開發(fā)與分析[J]. 中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，2022，28（4）.FENG Zhiyu, CHEN Xuejun, GAI Xiaotong, et al. Development and haplotype analysis of insertion–deletion (InDel) molecular markers for resistance locus RBRR1 to black root rot of tobacco (Nicotiana tabacum)[J]. Acta Tabacaria Sinica, 2022, 28(4). doi:10.16472/ j.chinatobacco. 2021.T0203