菜豆植物凝集素的理化性質(zhì)及活性研究

陳 高，朱 洵，曾 芬，何青松，陳禪友

（江漢大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北省豆類（蔬菜）植物工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430056）

凝集素（lectin/hemagglutinin）是一類非酶催化活性、非免疫源性的蛋白質(zhì)或糖蛋白，能與糖基專一旦多階地非共價可逆結(jié)合，不改變所結(jié)合糖基的共價鍵結(jié)構(gòu)，并具有凝集細胞和沉淀聚糖或糖復(fù)合物的作用［1］。菜豆植物凝集素（Phytohaemagglutinin，PHA）含有4個亞基，亞基有兩種，E亞基可以凝集紅血球，L亞基可以凝集白細胞且具有有絲分裂原活性［2］。

近年來，國內(nèi)外因食用生的或烹飪不充分的菜豆而引起中毒的事件時有發(fā)生［3-4］，但由于菜豆品種繁多，毒性成分各不相同，其中毒原因至今尚無全面闡述。目前，人們普遍認為菜豆凝集素是食用菜豆中毒的主要毒性成分［5］。菜豆凝集素是菜豆植物體內(nèi)主要的自我防衛(wèi)機制之一，可以特異性地結(jié)合昆蟲小腸表面的糖結(jié)合位點，阻礙昆蟲對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，并伴隨著一系列的并發(fā)反應(yīng)，導(dǎo)致昆蟲停止生長及多種病變，嚴重時導(dǎo)致死亡［6］；菜豆凝集素還可以特異性地與真菌、細菌等微生物表面的各種糖結(jié)合蛋白相結(jié)合，進而干擾其細胞壁的合成，從而影響到其細胞的正常代謝，對菌類產(chǎn)生抑制作用［7］。因此，菜豆凝集素具有作為一種高效又安全的植物源生物農(nóng)藥的潛質(zhì)，有潛在的商業(yè)應(yīng)用前景。

目前國內(nèi)外已經(jīng)在抗蟲、抗菌、抗腫瘤細胞、抗HIV、細胞凝集及促進有絲分裂等多個方面對凝集素展開相關(guān)研究［8-9］，并將其廣泛運用于抗蟲轉(zhuǎn)基因、血型鑒定、親和層析和靶向藥物載體等多個領(lǐng)域［10-11］，但對于菜豆凝集素理化性質(zhì)的研究還較少。本文探究了菜豆凝集素的理化性質(zhì)與生物活性，為進一步明晰菜豆中毒原理和解決菜豆不當(dāng)食用中毒的實際問題提供思路，同時亦可利用其凝集特性與毒性作用開發(fā)生產(chǎn)相關(guān)產(chǎn)品或制作植物源生物農(nóng)藥。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菜豆凝集素標準品購自Sigma-aldrich；葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳糖、乳糖、D-海藻糖、L-鼠李糖、蔗糖、D-麥芽糖、D-果糖、D-木糖、鹽酸胍、脲、SDS、氯化鉀、氯化鈉、醋酸、氫氧化鈉、Tris、無水乙醇、碳酸氫鈉、十二水合磷酸氫二鈉、兩水合磷酸二氫鈉、檸檬酸、檸檬酸鈉、氯化鈉等均為分析純，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。9種豆科植物材料由湖北省豆類（蔬菜）植物工程技術(shù)研究中心提供。

1.2 測定方法

1.2.1 凝集素的血凝活性檢驗 菜豆凝集素的血凝活性檢測采用血凝法［12］。在96孔V型血凝板檢的每一孔中加入25μL 0.01 mol/L PBS緩沖液（pH=7.2），然后取25μL樣品溶液，加入第一孔，混勻后，取出25μL加至第二孔，混勻后再取25μL，加至第三孔，以此類推，做倍比稀釋。同時每孔加入25μL 2%的兔紅細胞懸液，并將V型血凝板放在微型振蕩器上振蕩1 min，25℃下放置2 h，肉眼觀察血凝結(jié)果。當(dāng)血紅細胞凝成一片時為完全凝集；當(dāng)血紅細胞自然沉降，中間形成小紅點時為無凝集；當(dāng)一半血紅細胞凝成一片，一半血紅細胞自然沉降，中間小紅點為無凝集現(xiàn)象時的一半，此時為半凝集。

凝集素的血凝活性用凝集活力（HU）表示，HU=2n/50μL，其中n為樣品在96孔V型板中半凝集時，倍比稀釋的孔數(shù)。2n為倍比稀釋的倍數(shù)，即為血凝滴度。

1.2.2 熱穩(wěn)定性的測定 將菜豆凝集素用0.01 mol/L的PBS緩沖液（pH=7.2）配成初始濃度為1 mg/mL的溶液，在水浴中進行加熱處理，按照20、30、40、50、60、70、80、90、100℃依次提高溫度，每10℃保持恒溫5 min，使用血凝法檢測血凝活性。

1.2.3 酸堿穩(wěn)定性測定 將菜豆凝集素0.01 mol/L的PBS緩沖液（pH=7.2）配成初始濃度為1 mg/mL的溶液，分別測定其在pH值2～13條件下的血凝活性。其中，pH 2～3，采用0.1 mol/L的KCl-HCl緩沖液；pH 4～5，采用0.1 mol/L的Na Cl-Hac緩沖液；pH 6～7，采用0.1 mol/L的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液；pH 8～9，采用0.1 mol/L的Tris-HCl緩沖液；pH 10～11，采用0.1 mol/L的Na HCO3-Na OH緩沖液；pH 12～13，采用0.1 mol/L的KCl-Na OH緩沖液。

1.2.4 金屬離子結(jié)合特性 將菜豆凝集素用0.01 mol/L的PBS緩沖液（pH=7.2）配成初始濃度為1 mg/mL的溶液，并對0.02 mol/L的EDTA溶液充分透析，再使用3 kD的超濾離心管加入0.2 mol/L的PBS緩沖液（pH=7.2）離心數(shù)次，充分去除溶液中的EDTA。向96孔V型凝血板中分別加入0.01 mol/L的各種金屬離子溶液25μL，使用血凝法檢測血凝活性。

1.2.5 糖結(jié)合特異性 將菜豆凝集素用0.01 mol/L的PBS緩沖液（pH=7.2）配成初始濃度為1 mg/mL的溶液。并分別配制0.5 mol/L的葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳糖、乳糖、D-海藻糖、L-鼠李糖、蔗糖、D-麥芽糖、D-果糖、D-木糖溶液，再分別向96孔V型血凝板加入25μL，使用血凝法檢測血凝活性。

1.2.6 變性劑對凝集素血凝活性的影響 考查了3種變性劑對凝集素活性的影響，分別配制不同濃度的變性劑溶液，將2 mg/mL菜豆凝集素與不同濃度的變性劑混合，室溫放置2 h后，倍比稀釋測檢血凝活性。其中鹽酸胍溶液濃度設(shè)定為0.5、1、3、6 mol/L；脲溶液濃度設(shè)定為2、4、5、6、8 mol/L；SDS溶液濃度設(shè)定為1、5、10、20 mmol/L。

1.2.7 9種豆科植物凝集素血凝活性的檢測 分別選取菜豆、刀豆、貓豆、扁豆、四棱豆、決明子、飯豆、豇豆、荷包豆的商品成熟莢，加入0.01 mol/L PBS緩沖液（pH=7.2）1∶1冰浴研磨，離心取上清液，采用血凝法測量其血凝活性。

1.3 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)分析軟件為WPS office 2016和IBM SPSS26.0，所有數(shù)據(jù)進行3次重復(fù)。顯著性分析使用單因素ANOVA檢驗，后期進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 菜豆PHA的理化性質(zhì)

菜豆PHA的pH穩(wěn)定性如圖1A所示。菜豆PHA的凝集活力在pH值2～10之間均無顯著變化，保持在5.12 HU；至pH值11時才有部分下降；至pH值13時，降到了1.28 HU，下降了75%。結(jié)果表明菜豆凝集素保持較強的酸堿穩(wěn)定性，并且在強酸強堿條件下依然可以保持有較高的血凝活性。整體上菜豆凝集素在酸性條件下的耐受性比堿性條件下強，這可能與菜豆凝集素的等電點在5.5～6.0之間有關(guān)。

PHA的熱穩(wěn)定性試驗結(jié)果如圖1B所示。隨著溫度升高，菜豆凝集素的血凝活性先上升后下降，溫度為30℃時有最大凝集活力，為8.53 HU；從50℃開始明顯下降；80℃時凝集活力降到了1.71 HU，活力降低了80%；并在90℃時徹底失去活性。結(jié)果表明菜豆凝集素具有極強的熱穩(wěn)定性，這也是導(dǎo)致人們食用未熟透菜豆中毒的原因之一。

PHA的糖基穩(wěn)定性試驗結(jié)果如圖1C所示，添加大部分糖基后菜豆凝集素的凝集活力為2.56 HU，與空白一致；而添加D-果糖和L-鼠李糖后，菜豆凝集素的凝集活力降為1.71 HU，凝集活力下降了33.3%。由此可見，菜豆凝集素可特異性結(jié)合D-果糖和L-鼠李糖，其他寡糖對菜豆凝集素?zé)o明顯抑制作用。在反應(yīng)中，D-果糖和L-鼠李糖特異性地占據(jù)了菜豆凝集素的糖結(jié)合位點，使之不能與血紅細胞結(jié)合，從而降低了菜豆凝集素的血凝活性，對菜豆凝集素的活性表現(xiàn)出抑制作用。而其他的D-甘露糖、D-半乳糖、乳糖、D-海藻糖、蔗糖、D-麥芽糖、D-木糖均不能與菜豆凝集素特異性結(jié)合，因而無法抑制菜豆凝集素的血凝活性。

PHA經(jīng)EDTA處理后重金屬的穩(wěn)定性試驗如圖1D所示。經(jīng)EDTA處理后加入Ca2+、Mg2+、Zn2+，菜豆凝集素的凝集活力均為0；經(jīng)EDTA處理后加入Fe2+，菜豆凝集素的凝集活力為5.21 HU；經(jīng)EDTA處理后加入Cu2+，菜豆凝集素的凝集活力為0.72 HU。當(dāng)用EDTA處理菜豆凝集素提取液時，其失去血凝活性，加入Fe2+和Cu2+后菜豆凝集素回復(fù)了血凝活性，而Ca2+、Mg2+、Zn2+均不能使菜豆凝集素回復(fù)血凝活性。大多數(shù)凝集素表現(xiàn)出凝集活力都需要依賴于金屬離子，本研究中菜豆凝集素依賴于Fe2+和Cu2+，其中對于Fe2+的依賴性更強。

圖1 菜豆凝集素的理化性質(zhì)Fig.1 Physicochemical properties of PHA

2.2 變性劑對凝集素凝血活性的影響

凝集素對于不同的變性劑有著不同的抗性。如圖2A所示，隨著脲濃度的提高，菜豆凝集素的凝集活力呈下降趨勢，由2.56 HU下降到1.28 HU，活性降低了50%，可見脲濃度較高時對菜豆凝集素的血凝活性有部分影響，但無法使菜豆凝集素完全失活。如圖2B所示，隨著鹽酸胍溶液濃度的升高，菜豆凝集素的血凝活性并沒有顯著變化，凝集活力一直保持在2.56 HU，可見鹽酸胍對于菜豆凝集素的血凝活性并沒有顯著的影響，一直到6 mol/L都無法抑制菜豆凝集素的血凝活性。如圖2C所示，隨著SDS溶液濃度的升高，菜豆凝集素的凝集活力呈下降趨勢，由2.56 HU下降到0.64 HU，活性降低了75%，高濃度的SDS對菜豆凝集素活力有較為明顯的抑制作用，但是還是無法使菜豆凝集素完全失活。由此可見，菜豆凝集素活力的穩(wěn)定性非常好，對于變性劑的抗性較強。

圖2 變性劑對菜豆凝集素的影響Fig.2 Effect of denaturant to PHA

2.3 9種豆科植物凝集素含量比較分析

植物凝集素在豆科植物中普遍存在，并廣泛參與了豆科植物的有絲分裂、抵御病蟲害、生物固氮等生理反應(yīng)。雖然豆科植物凝集素的結(jié)構(gòu)大體相似，多為四聚體或二聚體，但是不同的豆科植物，其所含的植物凝集素性質(zhì)依然存在部分差異，如菜豆凝集素可以導(dǎo)致食用中毒，而其他豆科植物凝集素尚未有相關(guān)報道。如圖3A圖3B所示，不同豆科植物凝集素的凝集活力高低為菜豆＞扁豆＞貓豆=決明子＞刀豆=荷包豆＞飯豆＞豇豆=四棱豆。且菜豆凝集素的凝集活力極顯著大于其他豆科植物凝集素（P＜0.01），為17.01 HU，是凝集活力第二高的扁豆（凝集活力為1.28 HU）的13.3倍。菜豆凝集素這種遠高于其他豆科植物凝集素的血凝活性，可能是其有別于其他豆科植物凝集素并導(dǎo)致食用中毒的主要原因之一。

圖3 不同豆科植物凝集素含量比較Fig.3 PHA content comparation of different leguminous plant

3 討論與結(jié)論

不同的凝集素其熱穩(wěn)定性各有不同，但大部分凝集素都有較高的熱穩(wěn)定性，如徐小超［13］報道蜘蛛抱蛋凝集素血凝活性在30～70℃無顯著變化，在80℃時才損失20%，到90℃時才完全失活，與本研究相似；李建［14］報道大黑花蕓豆凝集素活性也是在80℃時才完全失活，凝集素的這種熱穩(wěn)定性可能與凝集素分子含有豐富的胱氨酸有關(guān)。同時在本研究中菜豆凝集素亦有較強的酸堿穩(wěn)定性，在pH 2～14之間均有較強血凝活性，與大多數(shù)凝集素相似。如黑皮扁豆凝集素在pH 3.0～10.5之間保持活力不變［15］；大黑花蕓豆凝集素對于酸堿均比較穩(wěn)定，在pH較低和較高時保持有較高的凝集活性［14］。

糖基的專一結(jié)合特性是凝集素的主要特性之一，不同的凝集素對糖的結(jié)合特異性不同。如鱗柄小奧德蘑凝集素的特異性糖為N-乙酰-D-半乳糖胺［16］；D-阿拉伯糖、L-巖藻糖對黑木耳凝集素的凝血活性具有抑制作用［17］；α-D-半乳糖、D-氨基半乳糖、異丙基-β-D-硫代半乳糖昔和α-乳糖均對大豆凝集素活性有抑制作用［18］；而本研究中菜豆凝集素可以特異性結(jié)合D-果糖和L-鼠李糖。凝集素的血凝活性依賴于特定的某些金屬離子，不同的凝集素對于金屬離子的需求也不同，如Ca2+、Zn2+、Mn2+和Mg2+均可使黑皮扁豆凝集素恢復(fù)血凝活性［11］，Zn2+可以有效加強阿魏菇凝集素的血凝活性［19］。而本研究中菜豆凝集素依賴于Fe2+和Cu2+，其中對于Fe2+的依賴性更強。

綜上所述，菜豆凝集素具有較強的熱穩(wěn)定性與酸堿穩(wěn)定性，并且對多種變性劑具有較強的抵抗能力，這種穩(wěn)定性在一定程度上揭示了食用未完全煮熟透的菜豆容易中毒的原因，同時也表明了菜豆凝集素可作為一種優(yōu)秀的生物源農(nóng)藥的潛力。另外，菜豆凝集素對于糖基的特異性結(jié)合能力也可運用于血型鑒定、靶向藥物載體等多方面。而其對于金屬離子的依賴性也提供了一種降低菜豆凝集素毒性的思路。菜豆遠高于其他豆科植物的凝集活性一方面揭示了菜豆比其他豆科植物容易中毒的原因，另一方面也表明了菜豆是研究提取凝集素的優(yōu)良素材來源。明晰菜豆凝集素的理化性質(zhì)與生物活性為進一步揭示菜豆食用中毒原理，也為研究利用菜豆凝集素提供了多種思路和想法。