基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討桃紅四物湯促進(jìn)骨折愈合的主要活性成分及作用機(jī)制

喬 宇，袁發(fā)滸，卯玉嶸，王 昕，胡 駿，趙志剛*，

（1.江漢大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430056；2.武漢市第四醫(yī)院 脊柱外科，湖北 武漢 430033）

骨折是臨床中常見多發(fā)病，可導(dǎo)致機(jī)體局部腫脹、疼痛、畸形、活動受限等癥狀。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國50歲以上人群總骨折患病率為26.6%。其中男性占比24.6%，女性達(dá)28.5%（P＜0.01）；其中髖部骨折患病率為1.9%，前臂骨折患病率為4.0%，脊椎骨折患病率為13.3%。并且中老年人骨折患病率隨著年齡增長而增加，呈現(xiàn)女性高于男性，城市高于農(nóng)村的趨勢［1］。針對2018年9月至2019年8月北京協(xié)和醫(yī)院骨科233例骨質(zhì)疏松性骨折費(fèi)用進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，得出其平均住院天數(shù)為（6.6±7.9）d，平均住院費(fèi)用為（64 890±38 250）元［2］。由于人們對生活質(zhì)量的要求不斷提高以及對住院費(fèi)用問題的關(guān)注，如何快速促進(jìn)骨折愈合成為了臨床工作的重點(diǎn)。中醫(yī)藥為我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)瑰寶，其中不乏大量治療方法，中醫(yī)治療骨折講究動靜結(jié)合、筋骨并重、內(nèi)外兼治的原則［3］，其中內(nèi)外兼治則指骨折早期活血祛瘀、消腫止痛，骨折中期舒筋活絡(luò)、接骨續(xù)筋，骨折后期補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨。

“桃紅四物湯”首次見于吳謙所著的《醫(yī)宗金鑒·婦科心法要訣》，為活血化瘀之代表藥方，因此被廣泛用于骨折治療中［4］?！疤壹t四物湯”中熟地黃、白芍為血藥，川芎、當(dāng)歸為氣藥，再加之桃仁、紅花具有活血作用，全方具有養(yǎng)血而不滯血、活血而不傷血的療效［5］。目前藥理學(xué)認(rèn)為“桃紅四物湯”具有消炎、鎮(zhèn)痛、擴(kuò)張血管以及抑制肉芽腫形成，可促進(jìn)骨痂區(qū)成骨細(xì)胞生成［6-7］。但其作用機(jī)制并未完全明確，因此采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)這一將生物信息學(xué)與藥理學(xué)相結(jié)合的新興學(xué)科來建立中藥有效成分與疾病靶點(diǎn)之間的相互聯(lián)系，為“桃紅四物湯”治療骨折提供更多依據(jù)，也為后期的深入研究提供研究思路。

1 材料與方法

1.1 “桃紅四物湯”活性成分及對應(yīng)靶點(diǎn)篩選

在中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）中輸入“桃紅四物湯”主要成分（桃仁、紅花、熟地黃、白芍、川芎、當(dāng)歸）的拉丁文，檢索有效活性成分，由于中藥成分較為復(fù)雜，并非所有成分均能被人體有效吸收、利用?？诜锢枚龋╫ral bioavailability，OB）是決定藥物是否能被人體吸收進(jìn)入體循環(huán)并作用于靶點(diǎn)的重要指標(biāo)。藥物類似度（drug-likeness，DL）可評估藥物化學(xué)成分的藥代動力學(xué)特性。因此設(shè)定口服生物利用度（OB）≥30%［8］和類藥性（DL）≥0.18［9］，最終得到有效活性成分及其所對應(yīng)的有效作用靶點(diǎn)。

1.2 FH相關(guān)靶點(diǎn)查詢

以“fracture healing”為檢索詞在GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：∥www.genecards.org/）進(jìn)行檢索，獲得FH相關(guān)靶點(diǎn)，將查詢結(jié)果以csv格式保存并導(dǎo)出。

1.3 構(gòu)建藥物-化合物-疾病共同靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

為方便展示“桃紅四物湯”在促進(jìn)骨折愈合中的作用機(jī)制，將“桃紅四物湯”有效作用靶點(diǎn)與“fracture healing”相關(guān)靶點(diǎn)兩者取交集，構(gòu)建韋恩圖，圖片以PNG格式導(dǎo)出。將共同靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件，繪制“藥物活性成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)調(diào)控圖，并通過設(shè)置不同的模式等，提高網(wǎng)絡(luò)調(diào)控圖中靶點(diǎn)相互作用可視化效果。

1.4 構(gòu)建靶點(diǎn)間相互作用網(wǎng)絡(luò)及核心靶點(diǎn)篩選

運(yùn)用String 11.5（https：∥www.string-db.org/）中“multiple proteins”模式，將藥物與疾病交集靶點(diǎn)導(dǎo)入，對其蛋白間相互作用（protein-protein interaction，PPI）進(jìn)行分析，隱藏游離靶點(diǎn)，其他參數(shù)值保持默認(rèn)，構(gòu)建出PPI網(wǎng)絡(luò)模型。導(dǎo)出PPI網(wǎng)絡(luò)圖和string_interactions.tsv文件。將所得文件導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2，運(yùn)用插件CytoNCA進(jìn)行拓?fù)浞治?，首先通過限定計(jì)算度中心度（degree centrality，DC）篩選出TOP＞50%的靶點(diǎn)；再按中間度中心度（betweenness centrality，BC）篩選出TOP＞50%的靶點(diǎn)，最終得出PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點(diǎn)。

1.5 交集靶點(diǎn)富集分析

不同的蛋白可能在生物學(xué)活動中發(fā)揮著協(xié)調(diào)效應(yīng)，因此可以通過基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析挖掘靶點(diǎn)蛋白在基因功能中的作用，利用京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes andgenomes，KEGG）通路富集分析可預(yù)測“桃紅四物湯”在促進(jìn)骨折愈合中的核心通路。運(yùn)用R語言包c(diǎn)lusterProfiler對“桃紅四物湯”與骨折愈合的共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能注釋和KEGG通路富集分析。

1.6 構(gòu)建KEGG關(guān)系網(wǎng)絡(luò)

KEGG關(guān)系網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建可直觀反映出各靶點(diǎn)參與通路的數(shù)目，以及不同通路中參與靶點(diǎn)的數(shù)目。利用Cytoscape 3.8.2構(gòu)建KEGG關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，通過設(shè)定鄰接節(jié)點(diǎn)數(shù)目（Degree）來分析關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖中的各靶點(diǎn)，設(shè)置為連續(xù)性變量，靶點(diǎn)的Degree值越大，在網(wǎng)絡(luò)中的圖形大小越大。各節(jié)點(diǎn)圖形的大小反映了各靶點(diǎn)所參與的通路數(shù)目以及各通路中所參與的靶點(diǎn)數(shù)，圖形越大，則節(jié)點(diǎn)的鄰接節(jié)點(diǎn)數(shù)越多，更能直觀反映出該節(jié)點(diǎn)在此網(wǎng)絡(luò)中的重要程度，同時(shí)也反映出其生物學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 “桃紅四物湯”活性成分及有效靶點(diǎn)

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫并設(shè)定OB≥30%、DL≥0.18的篩選條件進(jìn)行檢索，最終得到化合物共69個（桃仁含有23個、紅花含有22個、白芍含有13個、川芎含有7個、當(dāng)歸含有2個、熟地黃含有2個）。同時(shí)將得到的69個化合物所對應(yīng)的有效靶點(diǎn)進(jìn)行ID轉(zhuǎn)換，再去除重復(fù)靶點(diǎn)，最終得到共計(jì)212個有效靶點(diǎn)。

2.2 “桃紅四物湯”促進(jìn)骨折愈合作用靶點(diǎn)預(yù)測

利用Gene Cards數(shù)據(jù)庫對“fracture healing”進(jìn)行檢索，可得到相關(guān)靶點(diǎn)2 383個，再將促進(jìn)骨折愈合的相關(guān)靶點(diǎn)與“桃紅四物湯”的有效靶點(diǎn)進(jìn)行取交集，最終得到140個共同靶點(diǎn)，見圖1。

圖1“桃紅四物湯”與骨折愈合靶點(diǎn)韋恩圖Fig.1 Venn diagram of common targets of THSWT and fracture healing

2.3 “藥物活性成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)調(diào)控圖

通過Cytoscape 3.8.2構(gòu)建藥物有效成分與骨折愈合靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控圖，該網(wǎng)絡(luò)藥理圖總共包含180個節(jié)點(diǎn)（40個化合物節(jié)點(diǎn)、140個靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)）和373條關(guān)聯(lián)線（圖2）。其中交集靶點(diǎn)為綠色，白芍、川芎、紅花、桃仁的活性成分為藍(lán)色、橙色、黃色、粉色、藥物共有的活性成分為紅色。篩選出Degree值較大的節(jié)點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)分析，這些節(jié)點(diǎn)可能在調(diào)控中起到樞紐作用。其中PTGS2、NCOA2、PTGS1、HSP90AA1、PGR為Degree值排名前五的靶點(diǎn)，它們的Degree值分別是30、21、16、14、14。槲皮素（MOL000098）、木樨草素（MOL000006）、山柰酚（MOL000422）、黃芩素（MOL002714）、β-胡蘿卜素（MOL002773）為Degree值排名前五的活性成分，它們的值分別為100、45、38、24、20。

圖2“桃紅四物湯”有效成分與骨折愈合靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Interaction network between ingredients in THSWT and fracture healing-related genes

2.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析及核心靶點(diǎn)篩選

將取交集得出的“桃紅四物湯”可促進(jìn)骨折愈合的140個交集靶點(diǎn)上傳至String 11.5數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，隱藏游離靶點(diǎn)最終得到包含140個靶蛋白節(jié)點(diǎn)，共2 653條相互作用線的PPI網(wǎng)絡(luò)模型，見圖3。同時(shí)保存string_interactions.tsv文件，并將其導(dǎo)入Ctyoscape 3.8.2軟件，利用CytoNCA插件進(jìn)行拓?fù)浞治觯妶D4a；通過設(shè)置計(jì)算度中心度（DC）篩選TOP≥50%后創(chuàng)建子網(wǎng)絡(luò)，見圖4b；再通過設(shè)置中間度中心度（BC）≥50%后創(chuàng)建子網(wǎng)絡(luò)，見圖4c。同時(shí)運(yùn)用count.R將string_interactions.tsv文件進(jìn)行分析，最終得到PPI網(wǎng)絡(luò)中度值最大的前30個交集靶點(diǎn)，其中排名前五的有ALB、AKT1、IL-6、VEGFA、CASP3，它們與其他蛋白相互作用，在該網(wǎng)絡(luò)中起著關(guān)鍵作用，見圖5。

圖3 “桃紅四物湯”促進(jìn)骨折愈合靶點(diǎn)蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 PPI network between ingredients in THSWT and fracture healing-related genes

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龊诵幕騀ig.4 PPI network topology analysis of core genes

圖5 “桃紅四物湯”促進(jìn)骨折愈合關(guān)鍵蛋白直方圖Fig.5 Histogram of THSWT promoting fracture healing key protein

2.5 GO功能富集分析

通過R語言對“桃紅四物湯”促進(jìn)骨折愈合靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析，并按照P＜0.05為篩選條件運(yùn)行，最終獲得GO條目2 258項(xiàng)，其中生物過程（biological process，BP）2 037項(xiàng)、細(xì)胞組成（cellular component，CC）71項(xiàng)、分子功能（molecular function，MF）150項(xiàng)。BP涉及富集基因較多 的 有response to oxidative stress、response to extracellular stimulus、cellular response to chemical stress等；CC涉及富集基因較多的有membrane raft、membrane microdomain、vesicle lumen等；MF涉及富集基因較多的有DNA-binding transcription factor binding、RNA polymerase II-specific DNA-binding transcription factor binding、ubiquitin-like protein ligase binding等；柱狀圖的長度和紅色程度可反應(yīng)富集基因的數(shù)目及顯著程度。各類GO條目前20條注釋，見圖6至圖8。

圖6 GO富集分析（生物過程）Fig.6 GO Term(BP)

圖7 GO富集分析（細(xì)胞組成）Fig.7 GO Term(CC)

圖8 GO富集分析（分子功能）Fig.8 GO Term(MF)

2.6 KEGG信號通路富集分析及關(guān)系網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用R語言包c(diǎn)lusterProfiler并以P＜0.05為篩選條件，對交集靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行KEGG富集分析，富集分析得到KEGG信號通路151條，將富集分析得出的前20項(xiàng)通路進(jìn)行可視化，得到KEGG通路氣泡圖，見圖9。從圖中可見主要與骨折愈合有關(guān)的富集通路為AGE-RAG信號通路、IL-17信號通路、TNF信號通路、PI3K-Akt信號通路、Th17信號通路等。最后利用Cytoscape 3.8.2軟件進(jìn)行靶點(diǎn)-信號通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建，得到包含20條信號通路和97個靶點(diǎn)蛋白的通路網(wǎng)絡(luò)，見圖10。綠色代表靶點(diǎn)蛋白，紅色代表信號通路，將圖形的長、寬按照Degree值，設(shè)置為連續(xù)性變量，此時(shí)網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)的Degree值越高，所對應(yīng)的圖形越大。因此，可以較為直觀地通過網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)大小來判斷其節(jié)點(diǎn)在該關(guān)系網(wǎng)絡(luò)中的重要性。

圖9 “桃紅四物湯”促進(jìn)骨折愈合有效成分KEGG富集Fig.9 KEGG terms of ingredients in THSWT related to fracture healing

圖10 治療靶點(diǎn)-信號通路網(wǎng)絡(luò)Fig.10 Therapeutic target-signaling pathway network

3 討論

骨折愈合分為三個階段，分別是血腫機(jī)化期、骨痂形成期和骨痂塑性期，中醫(yī)則認(rèn)為骨折愈合的過程分為瘀去、新生、骨合［10］。“桃紅四物湯”是中醫(yī)藥活血化瘀中最常見的復(fù)方之一，以桃仁、紅花為主，四物湯為輔，可活血化瘀，消腫止痛，補(bǔ)益正氣以生血。目前認(rèn)為骨代謝、骨折斷端周圍血供以及炎性細(xì)胞等是影響骨折愈合重要因素［11］。近年來，各項(xiàng)臨床研究均表明“桃紅四物湯”對調(diào)節(jié)骨代謝，治療骨折均起到促進(jìn)作用，大鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ桶l(fā)現(xiàn)“桃紅四物湯”可促使pSmad2磷酸化水平上調(diào)，進(jìn)一步激活轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）信號通路，并加速骨折局部微血管血流速度，從而促進(jìn)骨折愈合，并且有效延長疼痛反射弧，提高痛閾值［12-13］。

“桃紅四物湯”中的槲皮素、木樨草素、山柰酚、黃芩素、β-胡蘿卜素可能是促進(jìn)骨折愈合的主要成分。通過核心靶點(diǎn)預(yù)測，可知“桃紅四物湯”促進(jìn)骨折愈合主要涉及ALB、AKT1、VEGF、CASP3、MMP3、MMP9、Jun、Fos、MYC、MAPK1、MAPK8、MAAPK14、EGF、EGFR等 核 心靶點(diǎn)。

MAPK1、MAPK8、MAPK14均為MAPK基因家族中的成員，在其MAPK通路中起著關(guān)鍵作用。MAPK8又稱c—Jun氨基末端激酶（C—Jun N—terminal kinase，JNK），在JNK受到細(xì)胞外刺激時(shí)，JNK上游的MKK4、MKK7通過雙磷酸化JNK的蘇氨酸和酪氨酸位點(diǎn)而激活JNK，進(jìn)而通過使c—jun激活區(qū)域的絲氨酸—63和絲氨酸—73位點(diǎn)雙磷酸化而提高其轉(zhuǎn)錄活性，同時(shí)c—jun是AP-1復(fù)合體的一部分，在包括細(xì)胞增殖、分化和腫瘤轉(zhuǎn)化等過程中起重要作用。有證據(jù)表明，在高壓氧的刺激條件下，可通過調(diào)節(jié)PKC/JNK通路，促進(jìn)骨折部位招募骨細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)骨細(xì)胞增殖［14］。MAPK14又稱p38絲裂原活化蛋白激酶（p38），MAPK1又稱細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK2），通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)添加p38、ERK2抑制劑后，小鼠胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞（MC3T3-E1）增殖作用明顯減弱［15］，JNK、p38、ERK2可通過MAPK通路中的不同分支起到促進(jìn)骨細(xì)胞增殖，進(jìn)而促進(jìn)骨折愈合的作用。EGF可作用于EGFR，促進(jìn)EGFR信息通路，在許多研究中均證實(shí)EGFR是骨代謝的重要調(diào)節(jié)器，可通過調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的凋亡與增殖來控制成骨細(xì)胞數(shù)量，以及通過增加間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）數(shù)量來刺激骨骼形成，由此可反應(yīng)EGFR在骨折愈合中起到不可或缺的作用［16］。

GO富集分析結(jié)果顯示，“桃紅四物湯”參與調(diào)節(jié)、促進(jìn)骨折愈合的主要涉及response to oxidative stress、response to extracellular stimulus、cellular response to chemical stress、response to drug、response to nutrient levels等。KEGG富集分析示，“桃紅四物湯”促進(jìn)骨折愈合主要涉及PI3KAkt信號通路、AGE-RAGE信號通路、IL-17信號通路、TNF信號通路等。PI3K-Akt信號通路作為細(xì)胞內(nèi)主要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一，在細(xì)胞分化、代謝、炎癥以及癌癥中均發(fā)揮著重要作用。PI3K參與細(xì)胞生長以及細(xì)胞骨架重塑，同時(shí)具有抗凋亡調(diào)節(jié)作用［17］。它可被上游信號如EGFR，引起二聚體構(gòu)象改變而被激活，活化的PI3K可改變Akt的蛋白結(jié)構(gòu)，磷酸化可使其激活或抑制其下游底物，如CASP3、CASP9、NF-κB、mTOR等，從而參與細(xì)胞凋亡或代謝過程。動物實(shí)驗(yàn)也證明通過添加外源性Apelin-13，大鼠骨痂組織中PI3K p85、p-Akt蛋白表達(dá)水平增加，使得大鼠股骨骨密度、組織礦物質(zhì)密度、骨體積分?jǐn)?shù)、骨痂直徑等均增加，從而促進(jìn)大鼠股骨骨折愈合［18］。AGE-RAGE信號通路可激活下游通路，同時(shí)活化IL-6、NF-κB信號通路、半胱天冬蛋白酶3、基質(zhì)金屬蛋白酶等的表達(dá)，促進(jìn)炎癥因子的表達(dá)導(dǎo)致炎癥反應(yīng)［19-20］。IL-17已被確定為骨折修復(fù)期間骨再生的重要調(diào)節(jié)器，可作用于軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等，并可誘導(dǎo)其他炎癥因子如TNF-α，IL-1β，IL-6，GM-CSF等的表達(dá)，從而發(fā)揮其致炎作用。在小鼠研究中發(fā)現(xiàn)，IL-17F和IL-17Ra/c作為直接配體受體相互作用，依賴Wnt通路和β-Cateni信號激活骨細(xì)胞生成［21-22］。有研究［23］表明通過誘導(dǎo)Wnt/β-Catenin信號通路激活，使β-Catenin轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，啟動下游成骨基因轉(zhuǎn)錄，如c-myc可促進(jìn)大鼠骨細(xì)胞的分化及骨移植物的礦化。通過抑制Wnt/β-Catenin信號通路，可使c-myc蛋白表達(dá)水平大大降低，進(jìn)而抑制成纖維細(xì)胞的生存能力、礦化和骨質(zhì)化［24］。TNF信號通路與炎癥介導(dǎo)有關(guān)，研究［25-26］表明TNF-α的釋放可改善大鼠髖部骨折處的骨體積分?jǐn)?shù)與骨表面積/體積比，并且在骨折部位注射TNF-α可以提高軟骨細(xì)胞分化進(jìn)而改善骨折修復(fù)，這一修復(fù)過程可能與AMPK信號有關(guān)。因此，可以預(yù)測“桃紅四物湯”促進(jìn)骨折愈合可能更多與炎癥反應(yīng)以及細(xì)胞凋亡的調(diào)控密切相關(guān)。

綜上所述，“桃紅四物湯”治療骨折具有多靶點(diǎn)、多途徑、多通路的特點(diǎn)。影響骨折愈合的因素紛繁復(fù)雜，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析從分子層面進(jìn)一步預(yù)測了“桃紅四物湯”治療骨折的分子作用機(jī)制，為后續(xù)臨床規(guī)范診療提供了一些思路。但由于靶點(diǎn)眾多、通路相互交錯等因素以及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的自身局限性，研究結(jié)果可能存在偏差，有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)論證。