基于高通量測序的獼猴桃根腐病根際土壤真菌群落研究

林慶柱，林芬，蔡林生 ，李振宇，朱友聰

(1.浙江亞米農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，浙江衢州 324102;2.浙江同濟科技職業(yè)學院，浙江杭州 311231)

獼猴桃(Actinidia)為獼猴桃科獼猴桃屬落葉藤本果樹，果實因營養(yǎng)豐富、特別是高維生素C含量深受消費者喜愛[1]。中國是世界上最大的獼猴桃生產(chǎn)國[2], 江山市是浙江省最大的獼猴桃生產(chǎn)區(qū)域，種植面積在1 600 hm2左右，目前獼猴桃已成為江山市縣域經(jīng)濟的優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)。近年來，獼猴桃根腐病的發(fā)生正成為困擾該區(qū)域獼猴桃生產(chǎn)的主要問題，致使樹勢變?nèi)?、產(chǎn)量降低、品質(zhì)變差[3]。

高通量測序作為第2代測序技術(shù)，具有操作簡單、成本低、結(jié)果可信度高等優(yōu)勢，一次可對幾百萬條，甚至上千萬條DNA序列分別進行測序，有助于準確分析環(huán)境中微生物的組成和分布[4]。筆者采用高通量測序的方法，研究獼猴桃根腐病植株根際土壤真菌群落多樣性和群落結(jié)構(gòu)特征，為生物防治此病害提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

獼猴桃種植園位于江山市塘源口鄉(xiāng)倉坂村，地處中亞熱帶北部濕潤季風氣候區(qū)，光照充足，降雨充沛，雨熱同期，多年平均氣溫17 ℃，無霜期249.7 d，地貌為山地丘陵。于2020年9月12日在獼猴桃種植園內(nèi)采集土壤樣品。選取面積10 m×10 m，間隔6 m的相鄰的3個小區(qū)，每小區(qū)的土壤類型、肥力水平、施肥條件以及栽培管理措施均一致。在每個小區(qū)內(nèi)隨機選取3株具有典型發(fā)病癥狀的獼猴桃植株，同時選取3株生長健康、未感病的獼猴桃植株作為對照。用無菌手套采用抖落法收集粘附在感病植株與未感病植株細根上的土壤作為土壤樣品，去除雜質(zhì)，用直徑2 mm的網(wǎng)篩過篩。取10 g土置于已消毒的自封袋中，利用冰盒保存，用于高通量測序。

1.2 土壤 DNA 提取與真菌ITS基因擴增

采用E.Z.N.A. Soil DNA Kit試劑盒法(D5625，美國Omega公司)，提取土樣的總DNA。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量，采用Nano Drop ND-1000紫外分光光度計(美國Nano Drop公司)對DNA進行定量測定。各樣品的5份DNA樣品隨機取3份等量混均，分別制成3個平行樣品，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂玫囊餅镮TS1FI2(5’-GTGARTCATCGAATCTTTG-3’)和ITS2 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)，對真菌ITS2可變區(qū)進行PCR擴增。PCR擴增產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，并對目標片段進行回收，采用 AxyPrep PCR Cleanup Kit回收試劑盒。純化后的PCR產(chǎn)物采用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit在Qbit熒光定量系統(tǒng)上對文庫進行定量，合格的文庫濃度應在2 nM以上。將合格的文庫(Index序列不可重復)梯度稀釋后，根據(jù)所需測序量按相應比例混合，并經(jīng)NaOH變性為單鏈進行上機測序，使用NovaSeq測序儀進行2×250 bp的雙端測序[5]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

經(jīng)過 QIIME( V1.8.0) 軟件過濾、拼接、去除嵌合體后，聚類為用于物種分類的OTU，并將所有樣品進行抽平。采用 RDP classifier 貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析，置信度閾值為0.7，選用Silva數(shù)據(jù)庫，得到分類學信息[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 門水平上感病與未感病植株根際土壤真菌優(yōu)勢菌群

經(jīng)檢測，獼猴桃未感病植株根際土壤真菌的第一優(yōu)勢門為擔子菌門，其他依次為子囊菌門、未分類菌門和接合菌門。感病植株根際土壤真菌的第一優(yōu)勢門為子囊菌門，其他的依次為擔子菌門、未分類菌門和接合菌門。感病植株的子囊菌門的相對豐度為96.55%，比未感病植株高51.79%，為極顯著性差異(P<0.01)。感病植株的擔子菌門、接合菌門的相對豐度分別為2.71%和0.18%，比未感病植株低48.05%和0.94%，為極顯著性差異(P<0.01)。

2.2 綱水平上感病和未感病植株根際土壤真菌優(yōu)勢菌群

在綱水平上，獼猴桃根腐病感病植株根際土壤真菌的第一優(yōu)勢菌綱為糞殼菌綱，其他的依次為座囊菌綱、散囊菌綱、傘菌綱。未感病植株的第一優(yōu)勢菌綱為傘菌綱，其他的依次為糞殼菌綱、座囊菌綱、盤菌綱。感病植株的糞殼菌綱相對豐度90.22%，比未感病植株高52.64%，為極顯著性差異(P<0.01)。感病植株與未感病植株的座囊菌綱相對豐度差異不顯著。感病植株的散囊菌綱相對豐度為1.23%，比未感病植株高0.77%，為極顯著性差異(P<0.01)。感病植株的傘菌綱、盤菌綱相對豐度分別為1.20%、0.94%，比未感病植株分別低49.36%、1.76%，均為極顯著性差異(P<0.01)。

2.3 目水平上感病和未感病植株根際土壤真菌優(yōu)勢菌群

在目水平上，獼猴桃根腐病感病植株根際土壤真菌的第一優(yōu)勢菌目為肉座菌目，相對豐度84.89%，比未感病植株增加了66.24%，為極顯著性差異(P<0.01)。其他的依次為Sordariales、小囊菌目、散囊菌目。未感病植株根際土壤真菌的第一優(yōu)勢菌目為未分類的傘菌綱，其他的依次為肉座菌目、Sordariales、Trexhisporales、小囊菌目。感病植株根際土壤Sordariales的相對豐度為3.09%，比未感病植侏低了7.17%，為極顯著性差異(P<0.01)。

2.4 科水平上感病和未感病植株根際土壤真菌優(yōu)勢菌群

在科水平上，獼猴桃根腐病感病植株根際土壤真菌的第一優(yōu)勢菌科為赤殼科，相對豐度81.15%，比未感病植株高72.35%，為極顯著性差異(P<0.01)。其他依次為假散囊菌科、肉座菌科、毛球殼科、囊菌科。未感病植株根際土壤真菌的第一優(yōu)勢菌群為未分類的傘菌綱，相對豐度38.78%，其他的依次為刺孢菌科、赤殼科、毛球殼科、囊菌科。感病植株的毛球殼科、囊菌科相對豐度分別為2.38%、1.75%，比未感病植株降低6.27%、5.04%，均為極顯著性差異(P<0.01)。

圖1 科水平上感病和未感病植株根際土壤真菌優(yōu)勢群落

2.5 屬水平上感病與未感病植株根際土壤真菌優(yōu)勢菌群

在屬水平上，獼猴桃根腐病感病植株根際土壤真菌的第一優(yōu)勢菌屬為赤霉菌屬，相對豐度27.86%，比未感病植株高19.79%，為極顯著性差異(P<0.01)。其他的依次為叢赤殼屬、鐮刀菌屬、假裸囊菌屬、肉座菌屬、枝鼻菌屬。未感病植株根際土壤真菌的第一優(yōu)勢菌群為未分類菌綱，其相對豐度為38.78%，其他的依次為粗糙孔菌屬、赤霉菌屬、枝鼻菌屬、Ophiocordyceps,枝孢屬等。感病植株根際土壤叢赤殼屬、鐮刀菌屬的相對豐度分別為24.88%、6.19%，比未感病植株高857.93倍、88.43倍，為極顯著性差異(P<0.01)。

圖2 屬水平上感病和未感病植株根際土壤真菌優(yōu)勢群落

3 小結(jié)與討論

農(nóng)田土壤中的子囊菌門包含了很多作物病原菌。謝玉清等[7]采用高通量測序法分析了新疆吉木薩爾縣大蒜根腐病發(fā)生時其植株根際土壤真菌的群落結(jié)構(gòu)變化特征，認為高豐度的子囊菌門菌群與大蒜根腐爛病害發(fā)生有著密切的關系，在根腐病發(fā)生最嚴重的大蒜抽苔期，感染根腐病的大蒜植株根際土壤維持著較高豐度的接合菌門。宋旭紅等[8]采用Illumina高通量測序技術(shù)分析了黃連根腐病根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)組成，發(fā)現(xiàn)病株土壤中子囊菌門菌群的相對豐度顯著高于健康株的，而接合菌門菌群在病株土壤中的相對豐度則顯著低于健康植株的。

本研究發(fā)現(xiàn)獼猴桃植株感染根腐病后，其根際土壤真菌子囊菌門(Ascomycota)的相對豐度比未感病植株根際土壤多115.71%，而擔子菌門(Basidiomycota)和接合菌門(Zygomcota)的相對豐度分別少94.66%和83.93%。本研究結(jié)果與上述學者[7，8]的研究結(jié)果相一致，表明獼猴桃健康植株根系分泌物能夠抑制子囊菌門的繁殖，促進接合菌門和擔子菌門的繁殖，而根腐病感病植株根系與根際土壤微生物之間的平衡互作關系遭到破壞，促進了根際土壤子囊菌門的繁殖。

本研究中獼猴桃感染根腐病植株的被孢霉屬(Mortierella)的相對豐度明顯低于未感病植株。土壤中被孢霉屬是一類益生真菌菌群，可以產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)。此外，未感病獼猴桃植株根際土壤真菌枝鼻菌屬(Cladorrhinum)、粗糙孔菌屬(Trechispora)、線蟲菌屬(Ophiocordyceps)等益生真菌屬菌群的相對豐度顯著高于感病植株的，這些菌屬很可能具有生防功能，說明感病后，根際土壤中的該真菌屬菌群遭到了破壞。

鐮刀菌屬廣泛分布于自然界，某些菌株能夠產(chǎn)生植物刺激素、植保素和類生長素等促進植物生長，也能引起很多作物發(fā)生赤霉菌病和枯萎病[9]。本研究中獼猴桃根腐病感病植株根際土壤鐮刀菌屬的相對豐度比未感病植株的高87.43倍，說明鐮刀菌屬也是引起獼猴桃根腐病的主要病菌之一。獼猴桃感染根腐病后，植株體內(nèi)產(chǎn)生的營養(yǎng)物質(zhì)可能有利于鐮刀菌屬的生長，從而導致鐮刀菌屬相對豐度增加。

本研究表明，與未感病植株相比，獼猴桃植株感染根腐病后其根際土壤真菌的群落結(jié)構(gòu)和相對豐度發(fā)生了顯著變化，打破了植物根際土壤微生態(tài)系統(tǒng)中原有的微生物拮抗平衡關系，形成了新的真菌群落關系。與未感病植株根際土壤相比，在門分類水平上，感病植株根際土壤子囊菌門相對豐度增高，而接合菌門和擔子菌門的相對豐度降低。在綱分類水平上，感病植株根際土壤糞殼菌綱的相對豐度增高，傘菌綱、盤菌綱的相對豐度降低。在目分類水平上，感病植株根際土壤肉座菌目的相對豐度增多，而Sordaihales,Trechnsporales、小殼菌目的相對豐度降低。在科分類水平上，感病植株根際土壤赤殼科的相對豐度增加，而毛球殼科、囊菌科的相對豐度降低。在屬分類水平上，感病植株根際土壤的赤霉菌屬、叢赤殼屬的相對豐度增高。與未感病植株相比，在各分類水平上感病植株根際土壤各菌群的相對豐度差異基本上都達極顯著水平。