歐李組培快繁培養(yǎng)基的篩選

袁振，廖榮君，喬福利，馮麗花，辛欣，馮殿齊*

(1.山東一滕新材料股份有限公司，山東泰安 271000；2.山東益得來生物科技有限公司，山東泰安 271000；3.山東泰山源農(nóng)業(yè)科技有限公司，山東泰安 271000；4.泰安市園林綠化管理服務(wù)中心，山東泰安 271000；5.泰山風(fēng)景名勝區(qū)管理委員會，山東泰安 271000)

歐李(Cerasushumilis(Bge.) Sok.)為薔薇科櫻桃屬灌木植物，在中國北方14個省(市、區(qū))有原始分布。其果實營養(yǎng)價值高，鈣、硒、原花青素等的含量遠(yuǎn)高于蘋果等水果[1]，果仁是中藥材郁李仁。歐李是生態(tài)建設(shè)的優(yōu)良樹種[2]。發(fā)展歐李產(chǎn)業(yè)具有重要的生態(tài)、民生、健康意義。山東一滕新材料股份有限公司對4個歐李優(yōu)系進(jìn)行了組培試驗，研究不同組培階段的適宜培養(yǎng)基，為歐李組培快繁技術(shù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用的外植體材料包括4個歐李優(yōu)系，編號TSO-4、TSO-5、TSO-7、TSO-11，其中TSO-4、TSO-5、TSO-7由山東一滕集團(tuán)從山西農(nóng)業(yè)大學(xué)引進(jìn)，TSO-11從野生歐李種子育苗選出。分別在各優(yōu)系的嫁接苗上選取生長健壯、無病蟲害的當(dāng)年生枝條采樣，采樣時連續(xù)3天以上為晴天。

植物生長調(diào)節(jié)劑：細(xì)胞分裂素為99% 6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)，上海金穗生物科技有限公司；類生長素98% 1-萘乙酸(NAA),國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；生長素99%吲哚乙酸(IAA)，潤友化學(xué)有限公司。

組培前期(至增殖培養(yǎng))于2018年3月至2019年9月在泰安市天澤農(nóng)園組培實驗室及二代育苗溫室進(jìn)行；自生根及后續(xù)培養(yǎng)轉(zhuǎn)入泰山區(qū)花樣年華植物鈣研究院組培中心進(jìn)行。組培中心溫度25±3 ℃、光照強(qiáng)度3 000～6 000 Lx，光照時間每天12 h，相對濕度40～80%，不定期用75%酒精噴霧殺菌降塵，每天晚上開紫外線燈消毒1 h。

1.2 試驗方法

外植體預(yù)處理與消毒。取歐李嫩枝的頂芽及帶葉腋的莖段作為外植體，剪去葉片，剪成3～4 cm的帶芽莖段，洗去灰塵，流水沖洗30 min，裝入玻璃瓶備用。外植體先用75%的酒精進(jìn)行常規(guī)消毒30 s，再用0.1%的升汞消毒，升汞消毒設(shè)9個時段：3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5min，消毒完畢用無菌水沖洗3次，研究外植體接種后的成活率及生長情況，篩選適宜的升汞消毒時間。

初代培養(yǎng)。初代培養(yǎng)誘導(dǎo)外植體產(chǎn)生叢生芽。用MS作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入0.1 mg/L NAA、30 g/L蔗糖、7 g/L瓊脂粉，pH值調(diào)至5.8～6.2。加入6-BA的濃度，TSO-4設(shè)6個，為0.3、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0 mg/L；TSO-5、TSO-7、TSO-11均設(shè)3個，0.5、1.0、2.0 mg/L。培養(yǎng)基分裝于容量300 mL的玻璃瓶中，每瓶40～50 mL，高溫滅菌20 min，冷凝待用。超凈臺用75%的酒精消毒，將滅好菌的培養(yǎng)基、無菌水等放進(jìn)超凈臺，紫外燈滅菌30 min，吹風(fēng)20 min。將已消毒的外植體取出，切成1～2 cm的小段，同一激素處理的外植體接種5瓶。培養(yǎng)周期30 d。把已污染的外植體及時清理出培養(yǎng)室。研究各處理的平均出芽率和芽質(zhì)量，篩選出合適的初代培養(yǎng)基。

繼代培養(yǎng)。繼代培養(yǎng)用MS做繼代基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入0.1 mg/L NAA，蔗糖30 g/L、瓊脂粉7 g/L。4個歐李優(yōu)系均設(shè)5個濃度的6-BA處理：0.3、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L，調(diào)節(jié)pH值至5.8～6.2，將初代培養(yǎng)從外植體上生出的叢生芽接入繼代培養(yǎng)基中，相同激素濃度處理的叢生芽接種20瓶。培養(yǎng)周期30 d，研究叢生芽的平均增殖芽數(shù)和瓶苗生長狀況，篩選出適宜的繼代培養(yǎng)基。

生根培養(yǎng)。設(shè)置生根培養(yǎng)基6種。以1/2MS為生根基本培養(yǎng)基，加入蔗糖20 g/L，瓊脂粉7 g/L，pH調(diào)至5.8～6.2。添加生長素3個濃度NAA，(0.05、0.1、0.2 mg/L)形成3種生根培養(yǎng)基。在此基礎(chǔ)上再分別添加0.4 g/L的活性炭,又形成3種新的生根培養(yǎng)基，共6種生根培養(yǎng)基，即對歐李組培苗進(jìn)行6個處理：處理1，1/2MS+ 0.05 mg/L NAA；處理2，1/2MS+ 0.1 mg/L NAA；處理3，1/2MS+ 0.2 mg/L NAA；處理4，1/2MS+ 0.05 mg/L NAA+0.4 g/L活性炭；處理5，1/2MS+0.1 mg/L NAA+0.4 g/L活性炭；處理6，1/2MS+ 0.2 mg/L NAA+0.4 g/L活性炭。將4個歐李優(yōu)系生長健壯的無根組培苗切除基部的愈傷組織，分別接種于6種生根培養(yǎng)基上，即進(jìn)行6個處理，每一處理20瓶，每瓶4株。生根培養(yǎng)周期30 d,調(diào)查生根率。

馴化、移栽、煉苗。馴化，當(dāng)生根的歐李組培瓶苗根長2 cm左右時，置于煉苗溫室內(nèi)，自然光下封口馴化10 d，敞口馴化1 d，之后進(jìn)行移栽。移栽、煉苗，將無菌苗取出瓶,洗凈根部的培養(yǎng)基，移栽于育苗盤。在溫室大棚內(nèi)搭建小拱棚，在離地2.5 m處設(shè)置遮陽網(wǎng)，保持拱棚中溫度20～30 ℃，濕度40～80%進(jìn)行煉苗。30 d后移栽到相同基質(zhì)的塑料營養(yǎng)缽中。設(shè)5種煉苗基質(zhì)分別為沙、干苔蘚、草炭土、草炭土∶珍珠巖=1∶1、草炭土∶珍珠巖=1∶2，調(diào)查煉苗效果，統(tǒng)計成活苗數(shù)，計算移栽成活率，觀察苗的生長狀況。

日常護(hù)理。根據(jù)氣溫和濕度揭蓋拱棚的薄膜進(jìn)行通風(fēng)換氣。根據(jù)大棚空氣濕度和土壤濕度進(jìn)行水分管理。根據(jù)幼苗的生長狀況進(jìn)行施肥管理。對幼苗每周噴施1次植物營養(yǎng)液。對病蟲害以防為主，噴施殺菌劑托布津或殺蟲藥。

1.3 數(shù)據(jù)處理

成活率、增殖系數(shù)、生根率等指標(biāo)，用Excel 2007軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

成活率(%)=成活芽數(shù)/接種芽數(shù)×100。

增殖系數(shù)=∑形成芽數(shù)/接種芽數(shù)。

生根率(%)=生根苗數(shù)/接種數(shù)×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 升汞消毒時間對歐李外植體成活率的影響

由表1可見，不同的升汞消毒時間對外植體成活率影響很大。對于優(yōu)系TSO-4外植體莖段，升汞消毒5 min的成活率最高(95.2%)，消毒7.5 min的成活率最低(18%)。對于優(yōu)系TSO-5外植體莖段，消毒4.5 min的成活率最高(91.1%)，消毒 7.5min的成活率最低(12.4%)。對于優(yōu)系TSO-7外植體莖段，消毒4 min的成活率最高(85.3%)，消毒7.5 min的成活率最低(10.2%)。對于優(yōu)系TSO-11外植體莖段，消毒4 min的成活率最高(94.8%)，消毒7.5 min的成活率最低(13.3%)。

表1 升汞消毒時間對歐李外植體成活率的影響

2.2 不同濃度的6-BA對初代培養(yǎng)誘導(dǎo)芽的效果

如表2，不同培養(yǎng)基對歐李莖段不定芽的誘導(dǎo)效果不同。TSO-4莖段，當(dāng)NAA濃度0.1 mg/L 不變，6-BA濃度為0.3～2.0 mg/L變化時，均有不定芽產(chǎn)生。6-BA濃度在0.5～1.5 mg/L變化時歐李的分化率均達(dá)90%以上。出芽質(zhì)量以6-BA濃度0.5 mg/L最好。TSO-5、TSO-7和TSO-11莖段在6-BA濃度為0.5～2.0 mg/L時，均有不定芽產(chǎn)生，分化率均達(dá)78%以上。出芽質(zhì)量以6-BA濃度0.5 mg/L最好。因此，以芽分化率和出芽質(zhì)量做評價標(biāo)準(zhǔn)，MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L為4個歐李優(yōu)系莖段誘導(dǎo)發(fā)芽的最適培養(yǎng)基。

表2 不同6-BA濃度的初代培養(yǎng)基中4個歐李優(yōu)系不定芽的誘導(dǎo)情況

2.3 不同濃度生長素和細(xì)胞分裂素對繼代培養(yǎng)增殖苗的效果

如表3，細(xì)胞分裂素6-BA濃度0.3 mg/L保持不變時，生長素NAA濃度在0.05～0.2 mg/L之間變動，4個歐李優(yōu)系組培苗生長均正常，以NAA濃度為0.1 mg/L時生長狀況最好。

表3 不同NAA濃度對4個優(yōu)系歐李組培苗苗質(zhì)的作用效果 mg/L

如表4，4個歐李優(yōu)系組培苗在0.1 mg/L生長素NAA下，培養(yǎng)30 d時，組培苗的增殖系數(shù)隨細(xì)胞分裂素6-BA濃度的升高呈先升后降變化，1.5 mg/L 6-BA時，平均增殖系數(shù)最多，TSO-4為9.48、TSO-5為9.54、TSO-7為8.01、TSO-11為7.64。其生長情況是，6-BA 1.0 mg/L時，繼代苗嚴(yán)重玻璃化，難以繼續(xù)利用。適合4個歐李優(yōu)系組培增殖生長的最適培養(yǎng)基是MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L。6-BA 0.3mg/L時，增殖系數(shù)最小。

表4 不同濃度的細(xì)胞分裂素對4個歐李優(yōu)系繼代增殖的效果

2.4 不同生根培養(yǎng)基的生根效果

如圖1，優(yōu)系TSO-4苗加活性炭(處理4、5、6)的生根率高于不加活性炭(處理1、2、3)的。處理5的生根率最高。即優(yōu)系TSO-4最適生根培養(yǎng)基配方是1/2MS+0.1 mg/L NAA + 0.4 g/L活性炭；優(yōu)系TSO-5苗加活性炭(處理4、5、6)的生根率低于不添加活性炭(處理1、2、3)的。處理1的生根率最高。即TSO-5最適生根培養(yǎng)基是1/2MS+0.05 mg/L NAA；TSO-7苗加活性炭(處理4、5)的生根率低于不加活性炭(處理1、2)的，但加活性炭(處理6)的生根率高于不加活性炭(處理3)的。處理1的生根率最高。即在6種培養(yǎng)基中，TSO-7最適生根培養(yǎng)基是1/2MS+0.05 mg/L NAA；TSO-11苗加活性炭(處理4、5、6)的生根率低于不加活性炭(處理1、2、3)的。處理2的生根率最高。即TSO-11最適生根培養(yǎng)基是1/2MS+ 0.1 mg/L NAA。

圖1 不同培養(yǎng)基對歐李莖段生根率的影響

如表5，因優(yōu)系TSO-7的生根較難，采用MS培養(yǎng)基不同濃度(1/2 MS、1/4 MS、1/8 MS)，生長素吲哚乙酸(IAA)濃度0.05 mg/L時，結(jié)果是1/8MS培養(yǎng)基的生根率高(66.7%)，生長狀況良好。TSO-7的最適生根培養(yǎng)基是1/8MS+0.05 mg/LIAA。

表5 TSO-7不同鹽濃度培養(yǎng)基對生根的影響

如表6，歐李TSO-4苗煉苗移栽時發(fā)現(xiàn)，不同基質(zhì)對組培苗移栽的成活率不同?；旌匣|(zhì)的成活率比單一基質(zhì)的好，當(dāng)基質(zhì)配比為草炭土∶珍珠巖=1∶2時，成活率高達(dá)85%。

表6 歐李TSO-4號組培苗不同基質(zhì)移栽的成活率

4 小結(jié)與討論

以歐李帶葉腋的莖段進(jìn)行組培快繁中，用清水洗去外植體表面的灰塵及污垢，在流水下沖洗30 min，75%的酒精消毒30 s，最后用0.1%升汞消毒至較好的時段為：TSO-4苗處理5 min，TSO-5苗處理4.5 min，TSO-7苗處理4 min，TSO-11苗處理4 min時，成活率分別最高。進(jìn)行腋芽誘導(dǎo)時，4個優(yōu)系歐李均在培養(yǎng)基MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA中可獲得較高的增殖系數(shù)，且苗的長勢優(yōu)。這與劉琳等[3]的研究結(jié)果符合。歐李生根的培養(yǎng)基為：TSO-4苗是1/2MS+0.1 mg/L NAA+0.4 g/L活性炭，TSO-5苗是1/2 MS+0.05 mg/L NAA，TSO-7苗是1/8MS+ 0.05 mg/L IAA，TSO-11是1/2MS+0.1 mg/L NAA。歐李TSO-4移栽煉苗時，以草炭土∶珍珠巖=1∶2為優(yōu)，成活率85%。

外植體用酒精燈烤瓶口可以顯著降低組培苗的污染率。消毒過程中，無菌水的用量不足，污染率增加。歐李有些莖段誘導(dǎo)出來的芽玻璃化嚴(yán)重的問題，可能是激素過多造成水分代謝失衡造成。這與梁偉玲等[4]的研究結(jié)果相近。玻璃化現(xiàn)象與培養(yǎng)基中6-BA的添加量有關(guān)。6-BA濃度降低，玻璃化現(xiàn)象變輕，葉子普遍變大，無再出現(xiàn)莖干畸形?；蚊缗c培養(yǎng)基里細(xì)胞分裂素濃度較高有關(guān)。

增殖培養(yǎng)中出現(xiàn)的單芽接入葉片發(fā)黃，長勢不佳，幾個芽湊成一簇接入可以避免葉片發(fā)黃，可選取芽叢進(jìn)行增殖，可在短時間內(nèi)獲得大批量叢生芽。生根培養(yǎng)時：培養(yǎng)基中無機(jī)鹽的濃度顯著影響生根效果，1/8MS>1/4MS>1/2MS。張秀麗等[1]研究表明，生根最佳配方是1/2MS+0.05 mg/L IBA。本研究預(yù)試驗中發(fā)現(xiàn)，IBA對歐李TSO-4、TSO-5、TSO-7的生根效果均不理想。這可能與歐李的基因型有關(guān)系。生根過程中也出現(xiàn)了一定量的莖尖壞死，葉黃，枯萎等現(xiàn)象。生根試驗中還發(fā)現(xiàn)，長得較高的繼代苗，把上半部分剪掉用于繼代，下半部分接入生根培養(yǎng)基能夠正常生根，但不能長出新的莖芽，葉片最后枯萎掉落。這可能是下半段組培苗本身存有一定量的營養(yǎng)，可以用于生根，生根消耗掉營養(yǎng)后，再無足夠的營養(yǎng)長出嫩芽。

瓶苗的煉苗移栽在選擇基質(zhì)種類、搭配水分、濕度、溫度、光照等方面需嚴(yán)格控制，才能提高移苗成活率。小苗木質(zhì)化程度低，易倒伏，易感染病菌，移栽后要加強(qiáng)管理，重視保溫、保濕、補(bǔ)水，必要時噴灑一定量的滅菌劑，拔除雜草，強(qiáng)光時覆蓋遮陽網(wǎng)，保持良好的生態(tài)環(huán)境。瓶苗移栽時不能直接從瓶內(nèi)取出，而是要將瓶帶苗一起拿出組培室，以逐漸適應(yīng)外界環(huán)境。煉苗要綜合考慮煉苗基質(zhì)的保水，保肥，通透性強(qiáng)的要求，合理搭配基質(zhì)，以草炭土∶珍珠巖=1∶1時，移苗成活率不高，可能是珍珠巖少，通透性差，苗易萎蔫。在給剛移栽的小苗噴水時，整個小環(huán)境也噴灑水分，提高成活率。