乳酸菌對真菌毒素的減毒研究進(jìn)展

肖 柯，張 霖，朱寒劍，李雷兵，劉孟林，李 琴，穆 楊，汪 超，周夢舟

（湖北工業(yè)大學(xué) 發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北省食品發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430068）

真菌毒素是由鐮孢菌屬、曲霉屬和青霉屬等絲狀真菌產(chǎn)生的高毒性次級代謝產(chǎn)物。據(jù)估計(jì)，至少有300 種真菌代謝物對動物和人類有潛在毒性，會引起致癌性、遺傳毒性、致畸性、皮膚毒性、腎毒性和肝毒性[1]。食品研究領(lǐng)域主要關(guān)注的真菌毒素包括黃曲霉毒素、伏馬菌素、展青霉素、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇。研究表明，真菌毒素存在于食品和飼料生產(chǎn)的各個環(huán)節(jié)，包括農(nóng)產(chǎn)品、發(fā)酵制品和飼料的生產(chǎn)、加工和分銷階段，不僅會帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，還會對公共衛(wèi)生安全造成嚴(yán)重的威脅[2]。

防止真菌毒素的產(chǎn)生和對真菌毒素的減毒是控制真菌毒素污染的兩個主要策略。目前物理化學(xué)方法已被大量用于真菌毒素的減毒方面[3]，然而，這些方法大多成本昂貴、操作復(fù)雜、效率低，還可能破壞食品的質(zhì)構(gòu)、營養(yǎng)價值和風(fēng)味，甚至?xí)a(chǎn)生有毒衍生物。利用乳酸菌去除真菌毒素的優(yōu)點(diǎn)在于其高效、安全、成本低、適用范圍廣，并且可以改善食物的品質(zhì)，對食品、飼料和環(huán)境無污染[4]。目前，有關(guān)乳酸菌對真菌毒素減毒的研究報道很多，可能涉及的減毒機(jī)制包括：乳酸菌抑制真菌毒素的產(chǎn)生、對真菌毒素的物理吸附以及緩解體內(nèi)毒性。本文總結(jié)了近幾年乳酸菌在真菌毒素減毒領(lǐng)域的研究進(jìn)展，以期為明晰乳酸菌清除真菌毒素的潛在機(jī)制和開發(fā)新型生物防腐劑提供幫助。

1 食品中的主要真菌毒素

1.1 黃曲霉毒素

黃曲霉毒素是一類化學(xué)結(jié)構(gòu)相似的二呋喃氧雜萘鄰?fù)难苌?，主要由黃曲霉、諾氏曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生。黃曲霉毒素能在紫外線照射下產(chǎn)生熒光，根據(jù)熒光顏色不同，可將其分為B族和G族兩大類及其衍生物，目前已分離鑒定出黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）、黃曲霉毒素B2（aflatoxin B2，AFB2）、黃曲霉毒素G1（aflatoxin G1，AFG1）、黃曲霉毒素G2（aflatoxin G2，AFG2）、黃曲霉毒素P1（aflatoxin P1，AFP1）和毒醇等共18 種[5]。AFB1為毒性及致癌性最強(qiáng)的物質(zhì)，其通過脫氧核糖核酸和鳥嘌呤的交聯(lián)導(dǎo)致癌癥。與其他真菌毒素相比，黃曲霉毒素很容易被胃腸道吸收，其吸收率高達(dá)80%。當(dāng)人過量攝入黃曲霉毒素時，可引發(fā)急性中毒，出現(xiàn)急性肝炎、出血性壞死、肝細(xì)胞脂肪變性和膽管增生，即使微量攝入，也會造成慢性中毒、生長障礙、纖維性病變以及纖維組織增生[6-7]。

黃曲霉毒素存在于土壤、植物和各種堅(jiān)果中，特別是花生和核桃。在大豆、稻谷、玉米、食用油等制品中也經(jīng)常發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素。國際食品法典委員會（Codex Alimentarious Commission，CAC）規(guī)定花生中AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的總量不得超過15 μg/kg，直接供人食用的花生和其他油籽及其制品中AFB1以及AFB1、AFB2、AFG1、AFG2總量分別不得超過2 μg/kg和4 μg/kg[8]。我國對各類食品中AFB1和黃曲霉毒素M1（aflatoxin M1，AFM1）都制定了嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)GB 2761—2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》[9]的規(guī)定，AFB1在花生及其制品中的限量為20 μg/kg，在其他熟制堅(jiān)果及籽類中為5.0 μg/kg，乳及乳制品中AFB1和AFM1的限量均為0.5 μg/kg。

1.2 伏馬毒素

伏馬毒素是一類結(jié)構(gòu)相似的雙酯化合物，由串珠鐮刀菌、層出鐮刀菌和擬輪生鐮刀菌等真菌產(chǎn)生。到目前為止，類似結(jié)構(gòu)物有伏馬毒素B1（fumonisin B1，F(xiàn)B1）、伏馬毒素B2（fumonisin B2，F(xiàn)B2）、伏馬毒素B3（fumonisin B3，F(xiàn)B3）等28 種。其中，F(xiàn)B1的污染范圍最廣、毒性最強(qiáng)，其次是FB2[10]。伏馬毒素可以抑制神經(jīng)酰胺合成酶的活性，通過破壞神經(jīng)細(xì)胞的脂質(zhì)代謝，催化鞘氨醇合成D-鞘氨醇，最終導(dǎo)致細(xì)胞損傷和變異。伏馬毒素的毒性與人類疾病沒有明確的聯(lián)系，可能對兒童的神經(jīng)管缺陷和生長障礙產(chǎn)生作用，引發(fā)人的神經(jīng)管缺陷病，但對其他物種會引起多種不利影響，如馬腦的白質(zhì)軟化癥、豬肺水腫、雞巨噬細(xì)胞萎縮和大鼠的基因毒性[11-12]。

在世界多個地區(qū)的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，玉米被伏馬毒素污染最為嚴(yán)重?？紤]到伏馬毒素對人體健康的潛在危害，部分發(fā)達(dá)國家和地區(qū)已經(jīng)對玉米制品中伏馬毒素的限量建立了標(biāo)準(zhǔn)。CAC要求玉米中伏馬毒素（FB1+FB2）的限量為4 000 μg/kg，玉米粉與玉米制品中伏馬毒素（FB1+FB2）的限量為2 000 μg/kg[8]。我國目前對其沒有限量要求，但已將其列入風(fēng)險評估項(xiàng)目中。

1.3 展青霉素

展青霉素是一種不飽和雜環(huán)內(nèi)酯毒素，由多種青霉屬、歐青霉屬、擬青霉屬、曲霉屬和貝氏菌屬真菌產(chǎn)生[13]。產(chǎn)生展青霉素的病原菌往往在果蔬采收后的貯藏和運(yùn)輸過程中通過果實(shí)（蘋果和山楂等）的傷口或皮孔、果柄等部位侵入，在生長環(huán)境適宜的條件下使果蔬發(fā)生霉變。世界衛(wèi)生組織已將展青霉素列為第三類致癌物質(zhì)，其對人及動物均具有較強(qiáng)的毒性作用，攝入體內(nèi)的展青霉素通過誘導(dǎo)細(xì)胞膜透過性的變化，使膜內(nèi)外的物質(zhì)轉(zhuǎn)移發(fā)生異常，從而間接引起生理呼吸異常[14-15]。

制定展青霉素限量標(biāo)準(zhǔn)的國家數(shù)量在不斷增加，其限量水平基本集中在50 μg/kg。在CAC規(guī)定的食品安全標(biāo)準(zhǔn)中，供嬰幼兒食用的蘋果制品及谷物中展青霉素的限量嚴(yán)格控制在10 μg/kg[8]。我國在GB 2761—2017中規(guī)定，蘋果、山楂制品（果丹皮除外）中展青霉素的限量標(biāo)準(zhǔn)為50 μg/kg[9]。

1.4 赭曲霉毒素

赭曲霉毒素是一類由異香豆素連接到β-苯基丙氨酸上的衍生物，由赭曲霉和硫色曲霉等產(chǎn)毒菌株產(chǎn)生，分為A、B、C、D 4 種化合物，從對谷物的污染率、污染水平及對人畜的毒性考慮，赭曲霉毒素A是其中最主要的具有食品衛(wèi)生學(xué)意義的真菌代謝產(chǎn)物。赭曲霉毒素的急性毒性較強(qiáng)，其毒性與其異香豆素部分有關(guān)，能夠影響蛋白質(zhì)合成并抑制甲狀旁腺激素的產(chǎn)生，導(dǎo)致腎臟功能衰竭[16]。

赭曲霉毒素的污染范圍較廣，幾乎可污染玉米、小麥等所有的谷物。CAC和我國對谷物中赭曲霉毒素A的限量均為5.0 μg/kg，CAC對赭曲霉毒素A在谷物制品中的限量為3.0 μg/kg，而我國GB 2761—2017規(guī)定其在谷物制品中的限量為5.0 μg/kg；除此之外，我國還要求豆類及其制品、堅(jiān)果及籽類、烘焙咖啡中赭曲霉毒素A的限量為5.0 μg/kg，葡萄酒中的限量為2.0 μg/kg[8-9]。

1.5 玉米赤霉烯酮

玉米赤霉烯酮又稱F-2毒素，是一種由禾谷鐮刀菌、三線鐮刀菌等多種鐮刀菌在適宜的溫度和濕度條件下產(chǎn)生的酚類間苯二環(huán)酸內(nèi)酯。玉米赤霉烯酮及其一些衍生物（α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、單羥基或雙羥基玉米赤霉烯酮等）被認(rèn)為是內(nèi)分泌干擾物，可通過誘導(dǎo)DNA加合物形成、DNA斷裂、細(xì)胞凋亡、微核和染色體畸變從而引起雌激素效應(yīng)，產(chǎn)生生殖毒性和遺傳毒性效應(yīng)[17]。

在世界范圍內(nèi)，玉米、大麥、燕麥、小麥、水稻、高粱和黑麥等許多重要作物中都存在著天然的玉米赤霉烯酮。CAC未制定谷物中玉米赤霉烯酮的限量標(biāo)準(zhǔn)。而我國GB 2761—2017規(guī)定，玉米及其制品、小麥和小麥粉中玉米赤霉烯酮的限量標(biāo)準(zhǔn)為60 μg/kg[9]。

1.6 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇又稱嘔吐毒素，是一種主要由禾谷鐮刀菌產(chǎn)生的單端孢霉烯族化合物，屬于劇毒或中等毒性物質(zhì)。研究表明，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇在體內(nèi)可能會形成一定的蓄積，但無特殊的靶器官，具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性，能夠誘導(dǎo)造血干細(xì)胞和免疫細(xì)胞凋亡。不同的動物對脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的敏感程度不一，豬對脫氧雪腐鐮刀菌烯醇最敏感，當(dāng)飲食中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇含量大于或等于1 mg/kg時，它們就會產(chǎn)生厭食行為[18]。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的毒性效應(yīng)包括嘔吐、厭食、胃腸炎、腹瀉、免疫抑制和血液病[18]。

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的污染常出現(xiàn)于小麥、大麥、玉米和飼料中。CAC和我國均對小麥、玉米等原糧中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇進(jìn)行了限定，但CAC的限定值為2 000 μg/kg，比我國GB 2761—2017高出1 倍。CAC和我國均規(guī)定以小麥、玉米等為原料制成的面粉、粗粉或麥片等成品糧脫氧雪腐鐮刀菌烯醇限量為1 000 μg/kg[8-9]。

真菌毒素、真菌來源及其易感染食物、限量和主要危害總結(jié)如表1所示。

表1 真菌毒素、真菌來源及其易感染食物、限量和主要危害Table 1 Mycotoxins, fungal sources, susceptible foods, safety limits and major hazards

2 乳酸菌對真菌毒素的作用

乳酸菌是指可以利用葡萄糖、乳糖等發(fā)酵性糖類并使之轉(zhuǎn)變成乳酸的微生物的總稱。乳酸菌自古以來就被廣泛應(yīng)用于傳統(tǒng)食品發(fā)酵中，不僅可以抑制腐敗菌的生長、清除有害物質(zhì)，還具有改善肝功能、降低血清膽固醇水平等作用，因此可作為食品和飼料的天然生物防腐劑[19]。研究表明，乳酸菌可以通過生物吸附和生物降解進(jìn)行減毒，生物吸附是指乳酸菌菌體與毒素分子以非共價方式結(jié)合，形成穩(wěn)定的菌體-毒素復(fù)合物，參與復(fù)合物形成的乳酸菌吸附能力下降，不易被生物體吸收，因而大部分復(fù)合物易排出生物體外，達(dá)到減毒的目的[20]。生物降解是指利用乳酸菌在其生長過程產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物直接或間接抑制真菌毒素的產(chǎn)生。這兩種方法不會影響食物和飼料的營養(yǎng)價值和感官特性。除此之外，與其他微生物相比，乳酸菌還具有在食品中使用更加安全、在人體腸道中能夠自然生長、能適應(yīng)多種脅迫環(huán)境等特性，因此在降解真菌毒素的微生物中應(yīng)用最廣泛[21]。

2.1 乳酸菌對真菌毒素的抑制

乳酸菌對真菌菌株生長具有抑制作用，可以直接抑制真菌毒素的生成，這是由于它們對空間和營養(yǎng)物質(zhì)的競爭以及有機(jī)酸和抗真菌代謝物的產(chǎn)生或這些因素的協(xié)同作用[22]。主要作用機(jī)制包括：1）乳酸菌利用碳水化合物產(chǎn)生有機(jī)酸如乳酸、乙酸和丙酸，能夠?qū)⑺釅A度降低到低于真菌生長和抑制代謝的水平，從而抑制真菌菌株的生長。2）乳酸菌代謝產(chǎn)生其他的抗真菌代謝產(chǎn)物，如苯乳酸使真菌的細(xì)胞壁破裂，胞內(nèi)蛋白流出而死亡；環(huán)二肽通過在細(xì)胞膜上形成孔道，增加細(xì)胞膜通透性，抑制真菌生長等。

真菌開始產(chǎn)生真菌毒素通常被認(rèn)為與其生長有關(guān)，因?yàn)檎婢舅厥窃谡婢L階段結(jié)束時開始產(chǎn)生的。因此，抑制真菌的生長通常被認(rèn)為是避免真菌毒素產(chǎn)生的最有效策略。但是，只有抑制真菌的生長到無法產(chǎn)生真菌毒素的水平時，才可能避免真菌毒素的產(chǎn)生[23]。表2總結(jié)了乳酸菌的抗真菌特性。

表2 乳酸菌抗真菌特性的研究概況Table 2 Overview of antifungal properties of lactic acid bacteria

Gomaa等[33]研究發(fā)現(xiàn)從埃及傳統(tǒng)乳制品中分離出的不同乳酸菌產(chǎn)生的抗真菌代謝物對黃曲霉和寄生曲霉所產(chǎn)生的AFB1具有特異性影響，此外，1.5 mg/mL的苯乳酸雖然僅降低了15%的真菌生長率，但抑制了99%黃曲霉毒素的產(chǎn)生。Guimar?es等[34]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，植物乳桿菌UM55菌株的無細(xì)胞上清液（cell-free supernatant，CFS）對黃曲霉毒素有91%的抑制作用，并認(rèn)為乳酸菌的抗黃曲霉毒素特性取決于菌株產(chǎn)生乳酸、聚乳酸、羥基聚乳酸和吲哚乳酸的能力，與CFS中過氧化氫含量、pH值以及真菌的生長情況無關(guān)。曹冬梅[35]利用彎曲乳酸桿菌進(jìn)行黃曲霉毒素減毒實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，乳酸造成的pH值降低可顯著抑制黃曲霉生長而不能抑制黃曲霉毒素產(chǎn)生；但彎曲乳酸桿菌與黃曲霉共培養(yǎng)時，黃曲霉菌量和毒素的產(chǎn)量顯著低于黃曲霉單獨(dú)培養(yǎng)時，這表明乳酸菌對黃曲霉毒素的抑制作用是其代謝產(chǎn)物的多因素作用結(jié)果。

2.2 乳酸菌對真菌毒素的降解

Zheng Xiangfeng等[36]發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌YZU01可以利用展青霉素誘導(dǎo)表達(dá)的胞外酶對展青霉素進(jìn)行降解，干酪乳桿菌YZU01與展青霉素共同培養(yǎng)24 h后能夠降解46.4%的展青霉素，48 h后能夠降解95%的展青霉素，最終降解產(chǎn)物無顯著毒性或毒性極低。一項(xiàng)關(guān)于乳酸菌對發(fā)酵奶油中赭曲霉毒素A的去除能力研究結(jié)果顯示，利用乳酸菌對奶油發(fā)酵24 h后，赭曲霉毒素A的平均去除率在32%～52%之間，植物乳桿菌LU5的CFS抑菌活性最高[37]。龔雪[38]在探索植物乳桿菌LB-11對展青霉素的去除機(jī)制中發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌LB-11細(xì)胞壁對展青霉素的去除率為3.25%，胞內(nèi)物質(zhì)對展青霉素的去除率為20.77%，均顯著低于完整細(xì)胞對展青霉毒素的去除率，推測該菌株主要是通過生物降解達(dá)到減毒毒的目的。Luz等[39]的研究證實(shí)了酶促還原也是赭曲霉毒素A的減毒機(jī)理之一，胞外酶可將赭曲霉毒素A的酰胺鍵水解為無毒的赭曲霉毒素A-α。Fuchs等[40]研究發(fā)現(xiàn)赭曲霉毒素A與嗜酸乳桿菌菌株在37 ℃培養(yǎng)4 h后，能夠使緩沖溶液中的赭曲霉毒素A水平減少95%以上，嗜酸乳桿菌的活細(xì)胞比致死細(xì)胞能夠更有效地去除赭曲霉毒素A，并可以降低赭曲霉毒素A對人體肝細(xì)胞的毒性，結(jié)果表明乳酸菌的代謝物也參與對赭曲霉毒素A的減毒。目前研究發(fā)現(xiàn)的能完全降解真菌毒素的乳酸菌較少，大部分乳酸菌都是通過生物吸附發(fā)揮減毒作用。

2.3 乳酸菌對真菌毒素的生物吸附

2.3.1 乳酸菌對黃曲霉毒素的吸附結(jié)合

目前認(rèn)為乳酸菌對黃曲霉毒素的去除主要是通過吸附作用。Bueno等[41]研究了12 個乳酸桿菌屬吸附AFB1的能力，結(jié)果表明不同乳酸菌菌株的毒素去除率為25%～61%，用磷酸鹽緩沖液和乙腈洗滌5 次吸附AFB1的乳酸菌后，仍有10%～50%的AFB1吸附在乳酸菌上；此外，該學(xué)者還檢測了不同時間乳酸菌結(jié)合和釋放毒素的百分比，結(jié)果表明這種結(jié)合是一個快速、可逆的過程。Haskard等[42]在熱或酸致死菌和活菌吸附AFB1的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，致死菌對AFB1的吸附能力增強(qiáng)，隨后添加抗疏水劑進(jìn)行處理，運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測溶液中AFB1的殘留量，結(jié)果表明胞外表面成分在吸附中起著主要作用，熱或酸處理使得細(xì)胞表層蛋白變性，從而有更多的結(jié)合區(qū)域暴露于AFB1。用高碘酸或鏈霉蛋白酶E處理的鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosusGG，LGG）可以顯著降低其與AFB1的結(jié)合量，AFB1主要與LGG的碳水化合物和蛋白質(zhì)成分結(jié)合[43-44]，即肽聚糖、磷壁酸、胞外多糖和S層蛋白（圖1）。

圖1 乳酸菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)[44]Fig. 1 Cell wall structure of lactic acid bacteria[44]

Hernandez-Mendoza等[45]以雷氏乳桿菌NRRL14171和干酪乳桿菌Shirota為研究對象，證實(shí)了磷壁酸缺乏會顯著影響乳酸菌對AFB的吸附能力。Lahtinen等[46]從LGG提取的胞外多糖沒有表現(xiàn)出結(jié)合AFB1的能力，而去除胞外多糖的細(xì)菌保留了其有效結(jié)合AFB1的能力。用溶菌酶裂解LGG細(xì)胞，收集細(xì)胞壁物質(zhì)，經(jīng)酶消化純化，由肽聚糖組成的細(xì)胞壁分離物能夠有效地與AFB1結(jié)合，這表明AFB1的結(jié)合位點(diǎn)很可能包含在細(xì)胞壁的肽聚糖中。通過將LGG暴露于特定的蛋白水解酶和化學(xué)變性劑中，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞壁蛋白和糖蛋白不會顯著影響AFB1的結(jié)合位點(diǎn)[46]。即AFB1在乳酸菌細(xì)胞壁中主要的結(jié)合位點(diǎn)位于磷壁酸、肽聚糖、表層蛋白（圖2）。蔣采貝[47]通過實(shí)驗(yàn)測得在pH 3.0、6.0和9.0條件下，隨著pH值的下降，LGG對AFB1的結(jié)合能力顯著增強(qiáng)；隨著LGG菌體濃度的增加，LGG對AFB1的吸附率也逐漸增加，而后增加趨勢逐漸變緩，這可能與可行的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)量有關(guān)。

2.3.2 乳酸菌對伏馬毒素的吸附結(jié)合

Dawlal等[48]研究了傳統(tǒng)發(fā)酵玉米食品中的優(yōu)勢乳酸菌在體外結(jié)合FB1和FB2的能力，所有被測試的實(shí)驗(yàn)室菌株都能結(jié)合FB1和FB2，盡管FB1和FB2具有相似的結(jié)構(gòu)，但在所有實(shí)驗(yàn)中FB2的親和性均高于FB1，且溫度、pH值和不同菌株都會影響結(jié)合效率，乳酸菌-伏馬菌素（FB1和FB2）復(fù)合物在pH 2和37 ℃的培養(yǎng)條件下是穩(wěn)定的。Zhao Hongfei等[49]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了乳酸菌菌株對伏馬毒素的去除能力具有特異性，植物乳桿菌B7和戊糖乳桿菌X8與FB2的結(jié)合程度高于FB1，植物乳桿菌B7與FB1和FB2的結(jié)合率分別為52.9%和85.2%，戊糖乳桿菌X8與FB1和FB2的結(jié)合率分別為58.0%和86.5%，結(jié)合效率隨著pH值降低和溫度升高而增加，其還發(fā)現(xiàn)了肽聚糖是主要的結(jié)合位點(diǎn)，肽聚糖的結(jié)構(gòu)完整性越好，結(jié)合的伏馬毒素就越多。質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的三氯乙酸和HCl處理均提高了伏馬毒素的去除能力，而溶菌酶處理卻相反，這可能是因?yàn)橘|(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的三氯乙酸可以有效去除細(xì)胞壁的磷壁酸，并增加細(xì)胞壁的通透性。HCl可降解多糖的結(jié)構(gòu)，從而暴露更多的結(jié)合位點(diǎn)，而溶菌酶可能破壞了肽聚糖的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

圖2 AFB1與乳酸菌細(xì)胞壁成分的相互作用[20,42-45]Fig. 2 Interaction between aflatoxin B1 and cell wall components of lactic acid bacteria[20,42-45]

Romina等[50-51]在探究嗜酸乳桿菌去除FB1的機(jī)理中發(fā)現(xiàn)：1）培養(yǎng)時間不影響對FB1的去除；2）通過物理化學(xué)方法或溶菌酶等降解細(xì)菌壁多糖、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)會增加結(jié)合力，而降解肽聚糖則部分降低了結(jié)合力；3）嗜酸乳桿菌通過弱的非共價相互作用與伏馬毒素結(jié)合，這種結(jié)合過程是快速、可逆的；4）菌體和FB1濃度的變化均會影響結(jié)合效率，并且最終達(dá)到結(jié)合毒素和未結(jié)合毒素的一個平衡狀態(tài)；5）疏水相互作用在結(jié)合中起主要作用，也可能存在一定程度的靜電相互作用；6）在酸性條件下，可能由于伏馬毒素中三羧酸結(jié)構(gòu)的水解受到抑制，因此可以更好地與細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)合。

2.3.3 乳酸菌對展青霉素的吸附結(jié)合

Hatab等[52]發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌6149和雙歧桿菌6071對展青霉素均有吸附去除作用，且活菌和致死菌對展青霉素的去除率沒有明顯差異，菌株的吸附去除能力與菌體活力、展青霉素初始濃度、培養(yǎng)時間、溫度和pH值有關(guān)。Zheng Xiangfeng等[36]發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌YZU01通過細(xì)胞壁吸附去除展青霉素的過程中，肽聚糖的物理結(jié)構(gòu)不是主要影響因素，鄰位羥基和羧基對展青霉素的吸附作用也不明顯，堿性氨基酸、硫醇和酯類化合物對展青霉素的吸附具有重要影響。

Alaleh等[53]以嗜酸乳桿菌和植物乳桿菌為益生菌生產(chǎn)合生菌型蘋果汁，研究其對展青霉素的減毒作用。結(jié)果表明，蘋果汁冷藏6 周后殘留的展青霉素僅為初始濃度的8.77%，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果證實(shí)展青霉素的去除依賴于較厚的表層蛋白，細(xì)胞壁表層蛋白為益生菌細(xì)胞與展青霉素的結(jié)合位點(diǎn)。此外，Wang Ling等[54]研究發(fā)現(xiàn)除疏水相互作用有利于乳酸菌細(xì)胞對展青霉素的吸附外，靜電相互作用也參與了展青霉素的吸附，且隨著pH值的升高（4.0～6.0），靜電相互作用增強(qiáng)（圖3）。

2.3.4 乳酸菌對赭曲霉毒素的吸附結(jié)合

目前普遍認(rèn)為赭曲霉毒素A吸附到乳酸菌細(xì)胞壁是乳酸菌減毒的主要機(jī)制，這不僅受到細(xì)胞壁的疏水相互作用影響，還受到電子供體-受體和Lewis酸堿相互作用的影響。Piotrowska[55]的研究結(jié)果表明，27 株植物乳桿菌清除赭曲霉毒素A的作用存在明顯的菌株特異性。采用吸附能力最強(qiáng)的3 株植物乳桿菌開展清除赭曲霉毒素A的研究時發(fā)現(xiàn)，熱失活菌株和活性菌株對赭曲霉毒素A的吸附能力差異不顯著。這是因?yàn)轸髑苟舅谹結(jié)構(gòu)中含有羥基，而熱處理后的菌體疏水能力增強(qiáng)。同樣，Piotrowska等[56]證實(shí)，嗜酸乳桿菌和鼠李糖乳桿菌在37 ℃條件下處理赭曲霉毒素A 5 d后，1 mg/L的赭曲霉毒素A分別下降了70%和87%，在磷酸鹽緩沖液或乙腈水溶液洗滌下均存在大量的赭曲霉毒素A解吸附現(xiàn)象，這表明毒素與細(xì)胞壁的結(jié)合是可逆的。趙琳等[57]采用植物乳桿菌清除赭曲霉毒素A的研究結(jié)果證實(shí)，30 ℃和37 ℃是植物乳桿菌吸附赭曲霉毒素A的最佳溫度，同時起始菌體濃度、赭曲霉毒素A濃度、培養(yǎng)時間都會影響對赭曲霉毒素A的吸附效果。

2.3.5 乳酸菌對玉米赤霉烯酮的吸附結(jié)合

María等[58]考察了4 株分離自豬直腸拭子的乳桿菌屬和一株商用菌株（鼠李糖乳桿菌）對玉米赤霉烯酮的吸附能力，結(jié)果表明，玉米赤霉烯酮吸附量均在40%以上。Król等[59]通過動力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌與玉米赤霉烯酮的結(jié)合是一個快速的過程，在培養(yǎng)期間，前720 min玉米赤霉烯酮的吸附效率迅速提高，約88%的玉米赤霉烯酮被吸附到細(xì)菌細(xì)胞壁上，之后體系達(dá)到一個平衡狀態(tài)。?vek等[60]證明了LGG和植物乳桿菌A1對玉米赤霉烯酮有明顯的結(jié)合作用，這與培養(yǎng)基中細(xì)菌濃度和培養(yǎng)時間有關(guān)。隨著培養(yǎng)時間延長，玉米赤霉烯酮的吸附率增加，當(dāng)達(dá)到一定時間后，部分結(jié)合的玉米赤霉烯酮被釋放回培養(yǎng)基中，說明毒素與細(xì)菌細(xì)胞的黏附反應(yīng)是可逆的。

圖3 FB1和展青霉素與乳酸菌細(xì)胞壁成分的相互作用[20,53-54]Fig. 3 Interaction of fumonisin B1 and penicillin with cell wall components of lactic acid bacteria[20,53-54]

Zhao Lin等[61]分離的27 株乳酸菌菌株對玉米赤霉烯酮的清除能力差異較大，清除能力在1.72%～47.80%之間。除細(xì)菌濃度外，玉米赤霉烯酮的去除還取決于培養(yǎng)基中毒素的濃度、細(xì)菌的活力和培養(yǎng)溫度。這一結(jié)論與El-Nezami等[62]的研究結(jié)果一致，并且后者發(fā)現(xiàn)，活的、熱處理和酸處理的LGG與玉米赤霉烯酮均具有很高的結(jié)合性能，但經(jīng)高碘酸鹽處理后，其與玉米赤霉烯酮的結(jié)合效果顯著降低，表明玉米赤霉烯酮主要與LGG細(xì)胞壁中的碳水化合物結(jié)合。用鏈霉蛋白酶E對活乳酸菌進(jìn)行酶處理不會降低乳酸菌株結(jié)合玉米赤霉烯酮及其衍生物的能力。然而，同一種酶對熱滅活和酸滅活乳酸菌的結(jié)合能力具有顯著影響，這表明在熱或酸處理后暴露的新結(jié)合位點(diǎn)是蛋白質(zhì)，同時疏水相互作用參與了結(jié)合作用。此外，Niderkorn等[63]報道了非活菌結(jié)合玉米赤霉烯酮的量高于活菌，表明熱滅活處理引起的細(xì)胞壁構(gòu)象的變化有利于結(jié)合位點(diǎn)的修飾或增加了結(jié)合位點(diǎn)的可及性。

2.3.6 乳酸菌對脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的吸附結(jié)合

Zhai Yaoyao等[64]對液體培養(yǎng)物中50 μg/mL脫氧雪腐鐮刀菌烯醇進(jìn)行去除，結(jié)果表明，副干酪乳桿菌LHZ-1細(xì)胞壁對其去除率高達(dá)40.7%，而細(xì)胞培養(yǎng)上清液和細(xì)胞裂解液對脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的去除率分別只有10.5%和8.9%。與活的、非熱滅活的細(xì)胞相比，熱滅活乳酸菌細(xì)胞在液體培養(yǎng)基中顯示出更強(qiáng)的降低脫氧雪腐鐮刀菌烯醇水平的潛力。但在穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)活細(xì)胞與脫氧雪腐鐮刀菌烯醇之間的結(jié)合力可能比熱滅活細(xì)胞更強(qiáng)。鄒忠義等[65]發(fā)現(xiàn)脫氧雪腐鐮刀菌烯醇不僅能被植物乳桿菌菌株LP102的活細(xì)胞清除，還能被LP102的細(xì)胞壁、加熱和酸處理的細(xì)胞清除；并且在培養(yǎng)過程中未檢測到脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的代謝物，這說明植物乳桿菌菌株LP102去除脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的方式是物理結(jié)合，而不是生物轉(zhuǎn)化。Niderkorn等[66]在探究乳酸菌-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的結(jié)合機(jī)制中發(fā)現(xiàn)，物理化學(xué)方法或溶菌酶等降解細(xì)菌壁多糖、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)會促進(jìn)結(jié)合，而降解肽聚糖則會部分抑制結(jié)合，說明肽聚糖在吸附過程中起著主要作用。

胡杉杉[67]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明熱或酸滅活副干酪乳桿菌菌株比活菌對脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的去除效果更好，但活菌-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇復(fù)合物的穩(wěn)定性強(qiáng)于滅活菌株，而且副干酪乳桿菌對毒素的吸附是可逆的，主要的作用部位是細(xì)胞壁上的肽聚糖。副干酪乳桿菌經(jīng)尿素處理后，對脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的去除率降低至18.80%，這表明復(fù)合物結(jié)合和疏水相互作用有關(guān)。乳酸菌菌株的特異性以及不同真菌毒素本身的結(jié)構(gòu)差異都會影響乳酸菌細(xì)胞壁對真菌毒素的結(jié)合能力。

不同乳酸菌細(xì)胞壁對真菌毒素的吸附作用總結(jié)如表3所示。

表3 乳酸菌細(xì)胞壁對真菌毒素的吸附作用Table 3 Adsorption of mycotoxins by the cell wall of lactic acid bacteria

2.4 乳酸菌對真菌毒素的體內(nèi)減毒作用

目前，有關(guān)乳酸菌與真菌毒素相互作用的研究主要集中于體外實(shí)驗(yàn)，關(guān)于乳酸菌體內(nèi)減毒作用的報道較少。Gratz等[68]先前報道了在腸道黏液存在的情況下，益生菌混合物（LGG和鼠李糖乳桿菌LC）與AFB1結(jié)合的能力較差，并且更容易受到腸道內(nèi)干擾因素的影響，認(rèn)為這可能是AFB1在動物體內(nèi)結(jié)合效果較差的原因。之后，Gratz等[69]研究發(fā)現(xiàn)LGG能調(diào)節(jié)大鼠對AFB1的攝取，減輕AFB1相關(guān)的生長停滯和肝損傷。此外，由于LGG-AFB1的結(jié)合，乳桿菌處理的大鼠糞便中AFB1含量增加。

Kumara等[70]研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵乳桿菌（LC5/a）可以用于小鼠體內(nèi)AFB1的結(jié)合和減毒，在LC5/a治療的小鼠組織病理學(xué)檢查中，天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶和超氧化物歧化酶水平降低，小鼠血清中促炎性細(xì)胞因子（腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-12、IL-6）水平也降低，使得受AFB1損傷的肝細(xì)胞質(zhì)得到明顯的改善并接近正常的組織水平。Hela等[71]研究發(fā)現(xiàn)，從突尼斯傳統(tǒng)黃油中分離的植物乳桿菌MON03（LP）對玉米赤霉烯酮引起的小鼠細(xì)胞毒性和遺傳毒性具有保護(hù)作用，與單純給予玉米赤霉烯酮組相比，LP與玉米赤霉烯酮同時灌胃可減少多染紅細(xì)胞微核的數(shù)量和染色體畸變的頻率，增加骨髓細(xì)胞的多色紅細(xì)胞數(shù)量。此外，LP還成功地減輕了DNA斷裂和這些基因及其靶蛋白表達(dá)的干擾。Garcia等[72]研究發(fā)現(xiàn)，鼠李糖乳桿菌RC007作為飼料添加劑可以降低脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的腸道毒性。斷奶仔豬攝入脫氧雪腐鐮刀菌烯醇后，6 種炎性細(xì)胞因子（巨噬細(xì)胞炎性蛋白-3α、IL-10、IL-1β、TNF-α、IL-8和IL-22）的mRNA表達(dá)水平均顯著增加，從而降低脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的生物利用度，并有助于維持胃腸道健康。

3 乳酸菌對真菌毒素減毒的應(yīng)用

食物鏈中真菌毒素的污染不僅會給工業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失，還會危及人和動物的健康，為此，工業(yè)上需要大量的新型真菌抑制劑。目前乳酸菌菌株已被證實(shí)具有足夠的潛力，可作為抗真菌保護(hù)劑，安全地在果汁、乳及乳制品、谷物及其制品、堅(jiān)果以及動物飼料等多種食品中使用。某些定義明確的益生菌菌株（如干酪乳桿菌、植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌）具有雙重功能，它們不僅能在適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵條件下降解真菌毒素或從食物或飼料表面吸附真菌毒素，而且在食物或飼料中其還具有其他生物活性，可以為人和動物帶來更多的健康益處。

3.1 乳酸菌對飼料中真菌毒素的降解

AFB1會使青貯飼料貯藏前3 d的pH值下降，21 d后丁酸濃度和最終pH值升高，在青貯飼料中添加適當(dāng)?shù)闹参锶闂U菌作為微生物接種劑能夠降低這些負(fù)面影響，并且AFB1濃度在青貯后3 d線性下降[73]。Zielińska等[74]的實(shí)驗(yàn)證明了4 種乳酸菌菌株（布氏乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、植物乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌）之間的協(xié)同相互作用可以導(dǎo)致玉米青貯飼料中的赭曲霉毒素A含量降低80%，從而提高飼料的安全性。

3.2 乳酸菌對食品中真菌毒素的降解

有關(guān)乳酸菌抑制堅(jiān)果中真菌產(chǎn)毒能力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，人工感染黃曲霉的杏仁接種克氏乳桿菌FR7培養(yǎng)7 d后，AFB1和AFB2的含量分別下降了85.27%和83.94%。人工感染的花生接種該菌株后，赭曲霉毒素A含量降低到接種前的25%[75]。篩自開菲爾酸奶中的kefirib菌株能夠從牛奶中去除100%的玉米赤霉烯酮，但從乳酸菌培養(yǎng)基中只消除了60%的玉米赤霉烯酮[76]。從自然經(jīng)過蘋果酸-乳酸發(fā)酵的杜羅葡萄酒中分離到的小球菌可將葡萄汁中赭曲霉毒素A轉(zhuǎn)化為無毒的副產(chǎn)物赭曲霉毒素-α[77]。Elsanhoty等[78]將乳酸菌添加到含有50 μg/L AFM1的原奶中進(jìn)行發(fā)酵，最終使AFM1質(zhì)量濃度降到11.3 μg/L，達(dá)到了酸奶AFM1的安全限量水平。Ademola等[79]發(fā)現(xiàn)經(jīng)過乳酸菌發(fā)酵制得的玉米產(chǎn)品比其他方法生產(chǎn)的產(chǎn)品中總黃曲霉毒素平均水平低，這證明了采用傳統(tǒng)食品發(fā)酵加工方法減少真菌毒素具有可行性。

4 結(jié) 語

乳酸菌作為食品級菌株，因其功能性與安全性，已成為緩解食品或飼料真菌毒素污染的理想菌株?，F(xiàn)有研究主要集中在真菌毒素的抑制和吸附方面，乳酸菌對真菌毒素的吸附作用有以下特點(diǎn)：1）菌株與真菌毒素的結(jié)合是一個可逆的過程，結(jié)合程度依賴于菌株和毒素劑量；2）菌株-毒素復(fù)合物的穩(wěn)定性與菌株受到的環(huán)境條件、處理方式有關(guān)；3）由于菌株本身和真菌毒素結(jié)構(gòu)的差異，不同菌株對同一真菌毒素的結(jié)合具有特異性，同一菌株也會對不同真菌毒素有不同的清除效率；4）細(xì)胞活性、菌體細(xì)胞起始濃度、真菌毒素濃度、培養(yǎng)時間和溫度都是影響乳酸菌吸附真菌毒素的關(guān)鍵因素。然而有一些關(guān)鍵問題還有待闡明，如當(dāng)菌株-毒素復(fù)合物通過胃腸道時，受胃腸道環(huán)境的影響，攝入的結(jié)合毒素復(fù)合物是否會釋放，與未結(jié)合形式相比，結(jié)合毒素的毒性還需進(jìn)一步研究。除此之外，以下幾點(diǎn)在未來乳酸菌對真菌毒素的減毒研究中需要重點(diǎn)關(guān)注：1）乳酸菌抑制真菌毒素生成的代謝產(chǎn)物及其抑制的分子機(jī)制的闡明；2）在體內(nèi)緩解真菌毒素毒性的乳酸菌篩選及其作用的分子機(jī)制；3）在食品生產(chǎn)過程中降解真菌毒素的乳酸菌的篩選及應(yīng)用。以上幾點(diǎn)研究的開展與加強(qiáng)能夠補(bǔ)全與促進(jìn)乳酸菌對真菌毒素從產(chǎn)品應(yīng)用到體內(nèi)減毒的全鏈條應(yīng)用（圖4），將有利于拓展乳酸菌作為真菌毒素清除劑和功能性膳食補(bǔ)充劑工業(yè)化與產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。

圖4 乳酸菌對真菌毒素的清除全鏈條應(yīng)用Fig. 4 Full-chain application of mycotoxin degradation by lactic acid bacteria