得力勁酒中總黃酮的測(cè)定及其應(yīng)用

周 爽， 王佳藝

上海冠生園華佗釀酒有限公司，上海 200040

《漢書(shū)·食貨志》中說(shuō) “酒，百藥之長(zhǎng)”，中國(guó)古代為治療疾病在酒中加入藥材，制成藥酒。經(jīng)過(guò)后世的發(fā)展,至今已分類(lèi)為藥品批文的藥酒、有保健品批文的保健酒和含有一些藥食兩用的藥材的普通食品露酒。露酒以蒸餾酒、發(fā)酵酒或食用酒精為酒基,加入可食用或藥食兩用(或符合相關(guān)規(guī)定)的輔料或食品添加劑,進(jìn)行調(diào)配、混合或再加工制成的,是一種已改變了其原酒基風(fēng)格的飲料酒[1]。露酒的藥味沒(méi)有藥酒和保健酒濃烈，口感的愉悅度更好，更合適在多場(chǎng)景飲用。

生物總黃酮是指黃酮類(lèi)化合物，是一大類(lèi)天然物質(zhì)，廣泛存在于植物界，是許多中草藥中的有效成分。黃酮類(lèi)化合物有抗炎、抗病毒、強(qiáng)心、鎮(zhèn)靜和抗氧化、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤等作用，具有很強(qiáng)的抗氧化和消除自由基作用。[2]

2022年6月1日實(shí)施的GB/T 17204《飲料酒術(shù)語(yǔ)和分類(lèi)》中對(duì)露酒的定義為以黃酒、白酒為酒基，加入按照傳統(tǒng)即是食品又是中藥材或特定食品原輔料或符合相關(guān)規(guī)定的物質(zhì)，經(jīng)浸提和/或復(fù)蒸餾等工藝或直接加入從食品中提取的特定成分，制成的具有特定風(fēng)格的飲料酒[3]，特別提到了中藥材，未來(lái)的露酒類(lèi)產(chǎn)品會(huì)同時(shí)兼顧傳統(tǒng)的中醫(yī)藥和中國(guó)傳統(tǒng)的酒文化方向發(fā)展。深度地研究成分、口感也將是露酒質(zhì)量控制的發(fā)展方向。中國(guó)勁酒、汾酒、瀘州老窖等酒企對(duì)旗下的露酒產(chǎn)品中的成分物質(zhì)多有研究，如中國(guó)勁酒的毛鋪?zhàn)鲜w酒就在外盒上標(biāo)出總黃酮含量。

露酒所采用的一些藥食兩用的藥材一般都經(jīng)過(guò)白酒的浸提。為了獲得更好的食用愉悅感，同時(shí)作為普通食品又沒(méi)有成分功能的要求，露酒中添加的藥材量相對(duì)藥酒和保健酒較少。本文參照《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》[4]和一些實(shí)用性文獻(xiàn)[2，5-6]，就露酒中總黃酮的含量情況做了一些研究。檢測(cè)樣品為上海冠生園華佗酒業(yè)有限公司生產(chǎn)的露酒——得力勁酒(含有枸杞，茯苓，山藥，甘草，大棗，桑椹，瑪咖(粉)，益智仁，砂仁，丁香等藥材)。同時(shí)還對(duì)其浸提液中的總黃酮進(jìn)行了測(cè)定?？傸S酮的檢測(cè)方法經(jīng)驗(yàn)證后，初步設(shè)計(jì)了浸提工藝實(shí)驗(yàn)，然后根據(jù)正交表對(duì)浸提液中的總黃酮進(jìn)行了測(cè)定，得出最優(yōu)浸提工藝。

1 儀器和材料

1.1 儀器與設(shè)備

UV-2600A型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，尤尼柯(上海)儀器有限公司；SQP電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司。

1.2 試劑

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：100080-201811)，中國(guó)藥品生物制品檢定所；甲醇，甲苯等均為分析純，聚酰胺粉(柱層析用，30目～60目)，國(guó)藥集團(tuán)。

1.3 材料

得力勁酒第一次浸提液，得力勁酒第二次浸提液，成品得力勁酒。

樣品1批號(hào)：2022-001；樣品2批號(hào)：2022-002；樣品3 批號(hào)：2022-003。

浸提工藝實(shí)驗(yàn)樣品的藥材：枸杞，茯苓，山藥，甘草，大棗，桑椹，瑪咖(粉)，益智仁，砂仁，丁香。

浸提工藝實(shí)驗(yàn)樣品的白酒酒基： 40%、50%、60%。

2 方法與結(jié)果

2.1 總黃酮檢測(cè)方法的確認(rèn)

2.1.1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱(chēng)取5.0 mg蘆丁，加甲醇溶解并定容至100 mL，即得50 μg/mL濃度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.1.2最大波長(zhǎng)的確定

取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液在200 nm～400 nm進(jìn)行紫外波長(zhǎng)掃描尋找最大吸收波長(zhǎng)，見(jiàn)圖1，在360 nm波長(zhǎng)處，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度最高，因此選擇360 nm為最大測(cè)定波長(zhǎng)。

圖1 蘆丁的紫外光譜圖

2.1.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

準(zhǔn)確吸取50 μg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液：0 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL和5.0 mL于10 mL比色管中(含量相當(dāng)于0 μg、5 μg、10 μg、15 μg、20 μg和25 μg)，用甲醇溶液定容至刻度，搖勻，以甲醇為空白，用1 cm比色皿于波長(zhǎng)360 nm處測(cè)定吸光度A。以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。求出回歸方程為y=0.029 2x+0.001 7，r=0.999 7。標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2。

圖2 聚酰胺—UV法標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.4樣液制備及測(cè)定

試樣處理：準(zhǔn)確吸取試樣1.00 mL于蒸發(fā)皿中，加1.00 g聚酰胺粉吸附，轉(zhuǎn)入10 mL層析柱。先用25 mL甲苯洗，甲苯液棄去，然后用甲醇洗脫黃酮，定容至25 mL。甲醇為空白，取待測(cè)樣液于1 cm比色皿中在波長(zhǎng)360 nm處測(cè)定吸光度。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算試樣中總黃酮的含量[2]，見(jiàn)表1和表2。

表1 樣品的吸光度

表2 樣品總黃酮含量

2.1.5重復(fù)性試驗(yàn)

準(zhǔn)確吸取1 mL的樣品1第一次浸提液，測(cè)定其吸光度A，平行測(cè)定6次得到的試驗(yàn)重復(fù)性，得出樣酒中總黃酮含量的標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為2.852%，見(jiàn)表3。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.1.6回收率試驗(yàn)

取已測(cè)定含量的樣品2的第二次浸提液5 mL，其總黃酮含量為2.065 μg/mL, 準(zhǔn)確吸取2 mL、3 mL、4 mL濃度為50 μg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液分別加入5 mL的浸提液中，加甲醇定容至10 mL，測(cè)定回收率。結(jié)果見(jiàn)表4。其平均回收率為102.23%，RSD=3.47%(n=6)。

表4 方法回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.1.7穩(wěn)定性試驗(yàn)

選蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液中的5 μg/mL，15 μg/mL，25 μg/mL作為1#，2#，3#及樣品(得力勁酒樣品1:2022-001中成品樣)測(cè)定吸光度后，放置10 min，20 min，30 min，40 min和60 min 后，分別測(cè)定其吸光度，由表5可看出，標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品在放置20 min，30 min和60 min后，其吸光度的值比較穩(wěn)定。因此，當(dāng)有較多樣品需要檢測(cè)時(shí)，不會(huì)因?yàn)榉胖脮r(shí)間較長(zhǎng)而影響檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

表5 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.2 浸提工藝實(shí)驗(yàn)

2.2.1正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

根據(jù)生產(chǎn)過(guò)程中浸提主要涉及三個(gè)因素，即浸提液酒精度、攪拌次數(shù)、浸提時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案，正交表為L(zhǎng)9(33)，以總黃酮的含量作為指標(biāo)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，因素水平表見(jiàn)表6。

表6 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

2.2.2正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，用藥材和40%、50%、60%的白酒進(jìn)行2次、3次、4次和12 h、24 h、36 h的浸提實(shí)驗(yàn)，測(cè)定其總黃酮數(shù)據(jù)，所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果及數(shù)據(jù)可見(jiàn)表7和表8。

表7 浸提實(shí)驗(yàn)表

表8 極差結(jié)果分析

根據(jù)表8極差結(jié)果分析，C的極差R最大，其次是B，A。極差越大，該因素對(duì)總黃酮含量的影響程度越高。因此，在浸提過(guò)程中，以總黃酮含量為指標(biāo)，3個(gè)因素對(duì)總黃酮含量的主次影響順序?yàn)椋篊>B>A，即浸提時(shí)間>攪拌次數(shù)>乙醇濃度。從各因素水平看(K值分析)，A因素為K3>K2>K1，B因素為K3>K2>K1，C因素為K3>K2>K1。由上述分析可以確定最佳浸提工藝條件為A3B3C3，即乙醇濃度為60%，攪拌次數(shù)為4次，浸提時(shí)間為36 h。

3 分析與結(jié)論

根據(jù)以上數(shù)據(jù)，使用聚酰胺UV法檢測(cè)得力勁酒及浸提液中的總黃酮含量，重復(fù)性、穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性均符合要求。當(dāng)然,得力勁酒中的總黃酮物質(zhì)含量相對(duì)于藥酒和保健酒較低，但作為日常飲用可以少量補(bǔ)充總黃酮物質(zhì)，對(duì)人體還是有益的。

從數(shù)據(jù)中還可以看出，第一次浸提液含有較多總黃酮，第二次浸提液總黃酮含量減少，這是由于浸提中使用的白酒體積約占成品體積的20%，說(shuō)明第一次浸提基本將大部分總黃酮提取出來(lái)了，但第二次浸提也是有一定貢獻(xiàn)的。最后的工藝決定了成品的總黃酮含量較第一次浸提液也有所減少。

以總黃酮含量作為參考值，開(kāi)展正交試驗(yàn)對(duì)浸提時(shí)間、攪拌次數(shù)、浸提液濃度三因素進(jìn)行分析后，發(fā)現(xiàn)浸提時(shí)間對(duì)總黃酮的提取影響最大，同時(shí)高濃度提取液對(duì)總黃酮的提取優(yōu)于低濃度，攪拌次數(shù)的增加有利于總黃酮的提取。

4 討論

露酒工藝中的浸提工序是確保浸提物質(zhì)質(zhì)量的關(guān)鍵。露酒國(guó)標(biāo)GB/T 27588—2011中對(duì)成品有干浸出物的要求，得力勁酒屬于動(dòng)植物類(lèi)露酒，干浸出物(g/L)≥0.5，對(duì)該酒的多年質(zhì)量跟蹤完全可以滿足這一要求，但干浸出物無(wú)法作為成分指標(biāo)的依據(jù)。本文采用保健食品中總黃酮含量的測(cè)定方法——直接紫外法對(duì)露酒得力勁酒中的總黃酮的含量進(jìn)行了測(cè)定，并對(duì)該方法在得力勁酒中總黃酮的測(cè)定的重復(fù)性和穩(wěn)定性進(jìn)行了驗(yàn)證。

通過(guò)對(duì)得力勁酒中總黃酮的測(cè)定，初步考察了目前該酒的成分情況，為以后深度開(kāi)發(fā)升級(jí)產(chǎn)品提供了指標(biāo)依據(jù)。就目前而言，對(duì)現(xiàn)有的浸提工藝方法可以進(jìn)行再組合優(yōu)化，從時(shí)間、浸提酒基、攪拌次數(shù)等多方面出發(fā)，將總黃酮指標(biāo)作為參照指標(biāo)，更科學(xué)的為浸提有效成分做合理的工藝設(shè)計(jì)。同時(shí)，為控制產(chǎn)品的穩(wěn)定性，也可以通過(guò)對(duì)總黃酮含量的測(cè)定，控制浸提過(guò)程的質(zhì)量，以提升和穩(wěn)定產(chǎn)品的品質(zhì)。

對(duì)總黃酮的測(cè)定還有比色法等其他方法，對(duì)樣品的前處理也有超聲波等不同的幾種方法，由于中藥材本身所含的物質(zhì)比較復(fù)雜，醇提法對(duì)中藥材里面多數(shù)物質(zhì)都具有較好的提取效果，但是傳統(tǒng)的發(fā)酵白酒也是含有比較復(fù)雜物質(zhì)成分，因此后面還可以應(yīng)用不同的方法對(duì)得力勁酒中的總黃酮進(jìn)行測(cè)定，不同方法的提取處理和最終數(shù)值的差異情況進(jìn)行比對(duì)和分析，從而確定最適合該類(lèi)露酒的總黃酮測(cè)定方法。