蔓越莓及蔓越莓制品體外抑菌試驗(yàn)的測(cè)定與分析

張 波， 張莉敏， 張榮桂

1.棗莊市市場(chǎng)監(jiān)管綜合服務(wù)中心，山東 棗莊 277000；2.棗莊市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東 棗莊 277000

蔓越莓又稱蔓越橘，是杜鵑花科越橘屬的常綠小灌木矮蔓藤植物，主要生長(zhǎng)在北半球的涼爽地帶酸性泥炭土壤中[1]。果實(shí)為長(zhǎng)2 cm～5 cm 的卵圓形漿果，吃起來有重酸發(fā)澀的口感[2]。蔓越莓的種植主要集中在美國北部，我國黑龍江地區(qū)也有種植蔓越莓。但現(xiàn)在全球90%以上的蔓越莓產(chǎn)品仍在北美出售和消費(fèi)[3]。國內(nèi)外學(xué)者對(duì)蔓越莓成分及功能研究很多，如蔓越莓含大量的維生素C(Vc), Vc的含量為普通水果的6倍，具有抗氧化[4]、預(yù)防血小管疾病[5]、促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育、預(yù)防壞血病[6]、降血壓、預(yù)防尿道感染[7]、降低齲齒[8]、牙周炎發(fā)生率[9]、抑制胃幽門螺桿菌[10]等功能。國內(nèi)外報(bào)道的多為蔓越莓汁、蔓越莓提取物、蔓越莓壓片糖果、蔓越莓蜜餞等制劑的預(yù)防疾病功效及抑菌性概述或研究進(jìn)展之類的文章[11]，國內(nèi)少見有對(duì)蔓越莓及制品進(jìn)行體外抑菌效力檢測(cè)的試驗(yàn)科研報(bào)告。本研究選取了細(xì)菌以大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、副傷寒沙門氏菌、枯草芽孢桿菌為試驗(yàn)菌，真菌以白色念珠菌、黑曲霉為試驗(yàn)菌，厭氧菌以生孢梭菌為例，對(duì)蔓越莓漿果、蔓越莓干、蔓越莓提取物、蔓越莓蜜餞進(jìn)行體外抑菌效力檢測(cè)研究，為蔓越莓的保健預(yù)防疾病功能提供理論依據(jù)。

1 材料、儀器及方法

1.1 材料

A、蔓越莓漿果(儲(chǔ)存日期：20211022，北京市通州興貿(mào)三街冷運(yùn)庫)； B、蔓越莓干(20211112,棗莊市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心自制 )；C、蔓越莓提取物(100 g/袋，含花青素25%，批號(hào)：20211125，漢中漢溯源生物科技有限公司)；D、蔓越莓蜜餞(批號(hào)： 20210921；山東德寶食品有限公司)；E、蔓越莓蜜餞(批號(hào)：20210907.11 B，山東省棗莊市大潤(rùn)發(fā)超市)。

1.2 儀器

PGL3002電子天平，艾德姆衡器(武漢)有限公司；DHP9082電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；LRH150電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；GR60DF立式壓力滅菌器，致微(廈門)儀器有限公司；80系列離心沉淀器，上海手術(shù)器械廠；ALN-50S菌落計(jì)數(shù)器，上海昂尼儀器儀表有限公司；Sevenmulti酸度計(jì)，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；XW80A混合器，上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠；YT-761勻漿儀，杭州盈天科學(xué)儀器有限公司。上述儀器均在檢定有效期內(nèi)。

1.3 方法

1.3.1試驗(yàn)菌種 大腸埃希氏菌(批號(hào)：201209,Escherichiacoli,縮寫：Eco)；銅綠假單胞菌(批號(hào)：201117,Pseudomonasaeruginosa, 縮寫：Pae)；乙型副傷寒沙門氏菌(批號(hào)：201212,SalmonellaparatyphiB, 縮寫：Spa)；金黃色葡萄球菌(批號(hào)：201229,Staphylococcusaureus, 縮寫：Sau)；枯草芽孢桿菌(批號(hào)：201016,Bacillussubtilis, 縮寫：BSu)；生孢梭菌(批號(hào)：201030,Clostridiumsporogenes, 縮寫：Csp)；白色念珠菌(批號(hào)：201226,Candidaalbicans, 縮寫：Cal)；黑曲霉(批號(hào)：201203,Aspergillusniger, 縮寫：Ani)。以上8種試驗(yàn)菌均購自北京三藥科技開發(fā)公司，均通過中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心(CMCC)溯源檢查。以下文中內(nèi)容菌種名稱均用英文縮寫。

1.3.2培養(yǎng)基 營養(yǎng)瓊脂(批號(hào)：200807)；胰酪蛋白胨瓊脂(批號(hào)：200709，縮寫TSA)；沙氏葡萄糖瓊脂(批號(hào)：210609，縮寫SDA)；生產(chǎn)廠家均為北京陸橋技術(shù)股份有限公司。其他材料：0.75% 無菌生理鹽水、0.5 mg/L 二氧化氯溶液、無菌平面皿(規(guī)格：直徑90 mm)、無菌牛津杯(內(nèi)徑6 mm，高10 mm)。

1.3.3各供試品供試液的制備 將各供試品外部清潔消毒，分別稱適量，于無菌勻漿罐內(nèi)粉碎，根據(jù)產(chǎn)品的特點(diǎn)，加適量無菌生理鹽水將各供試品進(jìn)行打漿、離心、過濾除菌后[12]，稀釋成1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶15、1∶30稀釋級(jí)的溶液(g/mL)，備用。

1.3.4菌懸液的制備 取上述8種試驗(yàn)菌，置于相應(yīng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后用無菌生理鹽水稀釋制成(1～5×106) CFU/mL濃度的菌懸液備用[13]。

1.3.5抑菌實(shí)驗(yàn) 牛津杯法[14],往9 cm的無菌平皿中傾注20 mL滅菌后的不同培養(yǎng)基，凝固后，吸取0.5 mL各試驗(yàn)菌菌懸液置于凝固后的平皿中，均勻涂布，然后平皿中等距放置3個(gè)牛津杯，其中1個(gè)牛津杯注入1∶2稀釋級(jí)的各供試品溶液；另一個(gè)牛津杯注入無菌生理鹽水做空白對(duì)照；第三個(gè)牛津杯注入0.5 mg/L 二氧化氯溶液(因其具有廣譜、高效的殺菌能力[15]，故選擇之)為陽性參照物對(duì)照；牛津杯放置在培養(yǎng)箱，37 ℃培養(yǎng)24 h，生孢梭菌用營養(yǎng)瓊脂，厭氧環(huán)境，37 ℃培養(yǎng)24 h，白色念珠菌和黑曲霉用SDA培養(yǎng)基，在25 ℃分別培養(yǎng)72 h，120 h[16]，然后取出平皿測(cè)定抑菌圈直徑。

1.3.6抑菌圈法測(cè)最小抑制濃度(MIC)[17]將1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶15、1∶30稀釋級(jí)供試品溶液同樣采用牛津杯法實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行抑菌圈直徑測(cè)定，直到牛津杯周圍沒有明顯的抑菌圈為止，確定最小抑菌濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌效果分析見表1

表1 抑菌效果比較研究*

由表1可知，1∶2稀釋級(jí)的各供試品對(duì)不同的試驗(yàn)菌都有不同程度的抑制作用，蔓越莓提取物對(duì)各種試驗(yàn)菌的抑菌能力最強(qiáng)，其次為蔓越莓漿果，蔓越莓干和蔓越莓蜜餞的抑菌作用相對(duì)較弱。

2.2 最低抑菌濃度(MIC)，結(jié)果見表2

表2 最低抑菌濃度研究比較(以抑菌圈直徑表示，mm)

由表2可知，對(duì)同種細(xì)菌的抑制作用，蔓越莓提取物抑菌效果最強(qiáng)。蔓越莓提取物對(duì)大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、乙型副傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、生孢梭菌、枯草芽孢桿菌的MIC為1∶15稀釋級(jí)；對(duì)白色念珠菌和黑曲霉的MIC為1∶10稀釋級(jí)。

2.3 對(duì)非潔凈區(qū)環(huán)境空氣中微生物的抑菌效果檢測(cè)

分別取1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶15稀釋級(jí)各供試品溶液0.5 mL,均勻涂布于TSA瓊脂、SDA平板的表面，打開平皿蓋，暴露非潔凈區(qū)環(huán)境中10 min，TSA瓊脂平板置于35 ℃培養(yǎng)24 h，SDA平板25 ℃培養(yǎng)72 h，同時(shí)以不加供試品的瓊脂平板同法做空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)，觀察菌落生長(zhǎng)情況，結(jié)果見表3。

表3 非潔凈區(qū)環(huán)境菌落數(shù)(CFU)

表3表明不同稀釋級(jí)的各供試品對(duì)空氣中的微生物也有一定的抑菌性。蔓越莓提取物的抑菌效果最好，其次為蔓越莓漿果。

表格說明① 表1、表2、表3、表4中的A為蔓越莓漿果，B為蔓越莓干，C為蔓越莓提取物，D為蔓越莓蜜餞(20210921)，E為蔓越莓蜜餞(20210907)，F(xiàn)為0.5 mg/L二氧化氯溶液，G為0.75%無菌生理鹽水；② 表格里的1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、 1∶10、1∶15、1∶30指的是各供試品稀釋倍數(shù)，換算成濃度(單位：g/mL)相應(yīng)為0.5、0.25、0.125、0.166 7、0.1、0.066 7、0.033 3, 四個(gè)表格里數(shù)值均為3次平行試驗(yàn)的平均值；③ 表1和表2中各抑菌圈直徑數(shù)值包含牛津杯的直徑6 mm。“-”指未測(cè)定；表4中測(cè)pH的室溫為25 ℃，生理鹽水為稀釋液；④ 表格里的TSA、SDA均為培養(yǎng)基縮寫。

3 討論

在本研究中，蔓越莓提取物對(duì)各種試驗(yàn)菌的抑菌能力最強(qiáng)，這可能和它的低pH有關(guān)(見表4)。試驗(yàn)測(cè)定蔓越莓提取物在1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶15稀釋級(jí)的pH約為2.3～2.7，同稀釋級(jí)蔓越莓其他制品pH約為2.4～3.2。據(jù)報(bào)道，(1) 極低的pH值可以抑制大部分致病菌的生長(zhǎng)[18]；(2) 有觀點(diǎn)認(rèn)為A型原花青素是蔓越莓果中的主要抗菌成份，抗菌機(jī)制可能為：①A型原花青素與鐵離子螯合抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，②阻斷其他金屬離子的作用影響細(xì)菌的代謝，③抑制氧化磷酸化，影響細(xì)胞膜的穩(wěn)定性[19]。也有研究者發(fā)現(xiàn)原花青素在體外能有效抑制細(xì)菌黏附作用[20]，抗黏附濃度為≥60 μg/mL[21]，從而起到抑菌作用。有作者聲稱質(zhì)量?jī)?yōu)良的100 g蔓越莓漿果中含原花青素約62.7 mg。但原花青素性質(zhì)不穩(wěn)定，易被氧化[22]，溫度、pH值、光照、糖等外在因素都會(huì)對(duì)它產(chǎn)生影響[23]。其中溫度影響最大[24]，一般情況下，天然色素在低溫或干燥狀態(tài)下較穩(wěn)定，升溫或加熱易氧化變色[25]。因此含花青素的食品如果儲(chǔ)存、加工方式不當(dāng)，花青素含量會(huì)降低[26]。蔓越莓提取物中純花青素含量比較高，所以抑菌能力強(qiáng)于其他制品，蔓越莓漿果因未經(jīng)過加工處理，花青素成分未被破壞，所以抑菌能力也比其他制品強(qiáng)。但從總體上看，蔓越莓提取物及蔓越莓制品對(duì)各種試驗(yàn)菌都有不同程度的抑制作用，因此未來蔓越莓也可能成為一種天然的抗菌劑。在我國，有大量的天生帶有抑菌能力的特殊植物[27]，隨著我國對(duì)營養(yǎng)與食品、藥品安全的關(guān)注度越來越高，人們也越來越傾向于食用天然的、安全的功能型食品或藥品。利用蔓越莓的抑菌性，可以將蔓越莓開發(fā)成多系列產(chǎn)品，如用作天然防腐劑、天然酸堿調(diào)節(jié)劑、抗菌藥物、保健食品或添加劑等,但仍需要更多的研究驗(yàn)證。

表4 不同稀釋級(jí)各供試品的pH值

另外，從本次實(shí)驗(yàn)可知，在對(duì)有過強(qiáng)的酸性、堿性或強(qiáng)抑菌性的食品進(jìn)行微生物檢驗(yàn)時(shí)，除了對(duì)食品的酸性、堿性進(jìn)行中和外，也有必要按國家藥典委員會(huì)規(guī)定的方法對(duì)食品的抑菌性進(jìn)行去除[28]，對(duì)該類食品的微生物檢驗(yàn)方法進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，以確認(rèn)所采用的方法適合該產(chǎn)品的微生物計(jì)數(shù)，這樣得到的檢驗(yàn)數(shù)據(jù)才真實(shí)準(zhǔn)確。