重金屬鎘與氨基酸類單體相互作用的親合方式和驅(qū)動(dòng)力研究

于勁松， 周栩丹， 王晗玥， 葉 泰， 吳秀秀， 曹 慧，袁 敏， 徐 斐， 肖誠傲， 楊 琦

上海理工大學(xué) 健康科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200093

重金屬鎘是人體的非必需元素，它的特性是有毒、致癌和致突變，在國際癌癥研究機(jī)構(gòu)的致癌物清單中，它屬于I類致癌物[1, 2]。此外，鎘元素還具有蓄積特性，半衰期可達(dá)數(shù)十年以上，一旦被人體吸收則很難清除[3]。鎘進(jìn)入人體的途徑包括消化道、呼吸道等[4]?？諝庵泻械逆k可通過呼吸道被人體吸收，食物中污染的鎘可通過消化道進(jìn)入人體產(chǎn)生蓄積[5, 6]。目前，有關(guān)重金屬鎘的檢測(cè)方法最常見的有：原子吸收分光光度法(AAS)，電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)[7-9]。這兩種方法所需要的設(shè)備比較昂貴，適用于實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行相關(guān)的檢測(cè)研究。但在實(shí)際的生產(chǎn)生活中，還需要開發(fā)一些快速簡便的方法，而進(jìn)行檢測(cè)方法的開發(fā)，需要對(duì)鎘導(dǎo)致對(duì)人體產(chǎn)生危害的機(jī)理進(jìn)行研究[10, 11]。目前，已有相關(guān)的鎘導(dǎo)致人體中毒的機(jī)理研究，但是采用熱力學(xué)方法的研究內(nèi)容還較少。眾所周知，人體的組成離不開蛋白質(zhì)，而氨基酸又是構(gòu)成人體所需蛋白質(zhì)的基本物質(zhì)。因此，研究氨基酸和重金屬鎘的結(jié)合機(jī)理，對(duì)于了解鎘對(duì)人體的危害具有重要的意義[12, 13]。

等溫滴定量熱法是研究物質(zhì)結(jié)合的金標(biāo)準(zhǔn)[14-16]，本文采用該方法研究了重金屬鎘與人體必需的20種氨基酸的結(jié)合過程，并探討了環(huán)境條件(緩沖液pH、緩沖液離子強(qiáng)度、溫度)變化對(duì)鎘與氨基酸親合過程的影響。本文的研究內(nèi)容從熱力學(xué)的角度解釋了鎘與氨基酸類功能單體的親合機(jī)制，是鎘與氨基酸結(jié)合研究的重要理論補(bǔ)充，也可為鎘導(dǎo)致人體中毒機(jī)理的研究提供一定的參考，為后續(xù)鎘離子檢測(cè)方法的開發(fā)打下了基礎(chǔ)。

1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.1 材料與設(shè)備

氨基酸：苯丙氨酸、異亮氨酸、精氨酸脯氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、頡氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、絲氨酸、甘氨酸、賴氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、丙氨酸、酪氨酸、組氨酸、色氨酸，4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，氫氧化鈉，均購自國藥基團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；等溫滴定量熱儀(VPITC)(美國馬爾文儀器有限公司)，pH計(jì)(S210-K，梅特勒托利多)。

1.2 氨基酸類單體與鎘相互作用的等溫滴定量熱試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在VPITC型等溫滴定量熱儀上進(jìn)行等溫滴定試驗(yàn)，首先為確保儀器的穩(wěn)定性和未被污染，先進(jìn)行水滴水試驗(yàn)，水滴水試驗(yàn)正常后正式進(jìn)行試驗(yàn)。第一步，先將300 μL濃度為10 mmol/L的氯化鎘溶液裝入到VPITC的注射器中，然后再使用進(jìn)樣針向反應(yīng)池中注入1 448 μL一定濃度的單體溶液，試驗(yàn)中設(shè)置反應(yīng)溫度至25 ℃，控制攪拌速度控制為372 r/min，滴定間隔控制為150 s，共滴定20次。試驗(yàn)在VPITC基線穩(wěn)定后開始正式滴定，滴定試驗(yàn)結(jié)束后，使用VPITC自帶的軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行擬合分析。為扣除試驗(yàn)背景結(jié)果帶來的影響，每次試驗(yàn)后進(jìn)行氯化鎘滴定緩沖液試驗(yàn)，每個(gè)結(jié)果均扣除背景。

2 結(jié)果與討論

2.1 氨基酸類功能單體與鎘相互作用的親合方式和驅(qū)動(dòng)力

進(jìn)行了一個(gè)系統(tǒng)的等溫滴定量熱法(ITC)研究，分析了重金屬鎘離子滴加到20種基本氨基酸的等溫滴定量熱曲線，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

圖1 鎘離子滴定20種氨基酸的等溫滴定量熱曲線(298 K)

將圖1中上半部分的熱量進(jìn)行積分得到下半部分的點(diǎn)圖，之后再運(yùn)用合適的模型對(duì)各點(diǎn)進(jìn)行擬合，得到親合力(K), 化學(xué)計(jì)量比(N) 和反應(yīng)焓變(ΔH)，結(jié)果如表1所示。從K值來看，半胱氨酸與鎘親和的K值最大，達(dá)到了106水平，表明氨基酸中半胱氨酸與鎘的親和力最強(qiáng)；其次是結(jié)構(gòu)中含有咪唑基團(tuán)的組氨酸，K值達(dá)到了103，之后是天冬氨酸和蘇氨酸。與上述幾個(gè)氨基酸相比，其他幾個(gè)氨基酸與鎘親合的K值、焓變(ΔH)都不高。REMELLI M等人[17]研究了Cd(II)與其他二價(jià)過渡金屬離子在與氨基酸、多肽和螯合劑形成絡(luò)合物過程中的競爭關(guān)系，其研究結(jié)果顯示：通過比較積累穩(wěn)定常數(shù)(log β110)，各氨基酸與鎘結(jié)合物的穩(wěn)定性排序?yàn)閏ys(12.82)>his(5.74)>asp(4.35)>gly(4.24)，這與本文得到的各氨基酸與鎘的親和力結(jié)果排序是一致的。

表1 鎘與氨基酸類功能單體結(jié)合的熱力學(xué)參數(shù)分析

結(jié)合表1中焓變(ΔH)和熵變(ΔS)數(shù)據(jù)，根據(jù)表2中的公式(ΔG=ΔH-TΔS)，可以得到每種氨基酸與鎘結(jié)合的驅(qū)動(dòng)力類型[18]：除半胱氨酸存在焓熵雙驅(qū)動(dòng)外，其他氨基酸與鎘結(jié)合的驅(qū)動(dòng)力都是熵驅(qū)動(dòng)。參考相關(guān)文獻(xiàn)，還可以獲知各個(gè)氨基酸與鎘的親合作用方式：除半胱氨酸與鎘存在配位作用外，其他氨基酸與鎘的結(jié)合均為靜電相互作用(注：脯氨酸與鎘不存在相互作用)。

表2 化學(xué)反應(yīng)驅(qū)動(dòng)力及自發(fā)性的判斷

為了驗(yàn)證氨基酸與鎘結(jié)合的具體基團(tuán)，研究了二硫蘇糖醇(DTT)、二水合檸檬酸三鈉(Sodium citrate)和三羥甲基氨基甲烷(Tris)與鎘的結(jié)合ITC試驗(yàn)，結(jié)果如圖2所示。

圖2 DTT(左)、二水合檸檬酸三鈉(中)和Tris(右)與鎘的結(jié)合ITC試驗(yàn)研究

從圖2中結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二硫蘇糖醇與鎘的結(jié)合為放熱且放熱信號(hào)明顯大于Cys，可以確認(rèn)巰基與鎘的結(jié)合為放熱；含有相當(dāng)于三個(gè)羧基的二水合檸檬酸三鈉，相比圖1中的甘氨酸和天冬氨酸，顯示的結(jié)合信號(hào)也是吸熱，但是信號(hào)更強(qiáng)，表明羧基與鎘的結(jié)合為吸熱，且吸熱強(qiáng)度與羧基的數(shù)量成正比。對(duì)于結(jié)構(gòu)中沒有羧基，只有氨基和羥基的Tris來說，它與鎘的結(jié)合信號(hào)微弱。由表3可見，結(jié)構(gòu)中含有兩個(gè)巰基的二硫蘇糖醇與鎘親合的作用方式為配位鍵，驅(qū)動(dòng)力為焓熵雙驅(qū)動(dòng)，氨基酸中只有半胱氨酸(結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)巰基)的作用方式和驅(qū)動(dòng)力與之相同，有次可以推測(cè)半胱氨酸與鎘的親合主要是通過巰基與鎘離子之間形成配位鍵實(shí)現(xiàn)的。Elena Chekmeneva等人[19]研究了結(jié)構(gòu)中也含有巰基的谷胱甘肽(GSH)與鎘離子的親合過程：在pH 7.4的Tris緩沖液中，采用5 mmol/L的鎘滴定0.2 mmol/L的GSH，其滴定圖譜同樣顯示為一個(gè)放熱過程，其放熱焓變(ΔH)為-20.8 kcal/mol。本研究中的親合反應(yīng)是在HEPES中進(jìn)行的，采用2 mmol/L的鎘液滴定0.05 mmol/L半胱氨酸溶液，其放熱焓變(ΔH)為-2.38 kcal/mol(表1)；采用2 mmol/L的鎘液滴定0.05 mmol/L二硫蘇糖醇溶液，其放熱焓變(ΔH)為-4.18 kcal/mol(表3)，雖然反應(yīng)環(huán)境不同，但含巰基單體與鎘的熱力學(xué)行為和參數(shù)是一致的。

表3 鎘與氨基酸類功能單體結(jié)合的熱力學(xué)參數(shù)分析

2.2 pH、離子強(qiáng)度、溫度等條件對(duì)鎘與半胱氨酸親合的作用方式和驅(qū)動(dòng)力影響

在前面研究的基礎(chǔ)上，以半胱氨酸為對(duì)象，研究了pH、離子強(qiáng)度、溫度等環(huán)境條件變化對(duì)鎘與半胱氨酸相互作用的親合方式和驅(qū)動(dòng)力影響。首先，采用ITC方法，考察了在25 ℃溫度下，不同pH條件下，鎘與半胱氨酸結(jié)合的差異，結(jié)果見圖3和圖4。

圖3 不同pH下(Mes緩沖液)Cd(II)與半胱氨酸結(jié)合的ITC試驗(yàn)

圖4 不同pH下(HEPES緩沖液)Cd(II)與半胱氨酸結(jié)合的ITC試驗(yàn)

從圖3可以看出，隨著pH的降低，Cd(II)與半胱氨酸結(jié)合的放熱量在逐漸降低，MES緩沖液的有效pH范圍是5.5～6.7，降低pH不利于二者的結(jié)合。進(jìn)一步采用HEPES緩沖體系考察了在pH 6.8～8.2范圍內(nèi)Cd(II)與半胱氨酸結(jié)合的情況，結(jié)果如圖4和表4所示。

表4 不同pH下Cd(II)與半胱氨酸結(jié)合的ITC試驗(yàn)數(shù)據(jù)(25 ℃)

需要說明的是，在pH8.2條件下，Cd(II)是無法長時(shí)間穩(wěn)定存在的，在若干分鐘內(nèi)即會(huì)出現(xiàn)絮狀懸浮物，這應(yīng)該是由于在該堿性pH條件下的Cd(II)與環(huán)境中的OH-結(jié)合生成Cd(OH)2不溶物造成的。在中性和酸性條件下則沒有出現(xiàn)此現(xiàn)象。由表4可見pH低于7.5時(shí)，鎘與半胱氨酸結(jié)合的作用方式為配位鍵，驅(qū)動(dòng)力為焓熵雙驅(qū)動(dòng)；pH大于等于7.5時(shí)，作用方式為兩種，增加了靜電相互作用，驅(qū)動(dòng)力也是焓熵雙驅(qū)動(dòng)和熵驅(qū)動(dòng)兩種方式?？梢?，pH的變化對(duì)于鎘與半胱氨酸的親合過程影響還是非常明顯的。

在上述pH條件研究的基礎(chǔ)上，選擇pH 6.0，研究了緩沖液離子強(qiáng)度對(duì)Cd(II) 與半胱氨酸親合過程的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 離子強(qiáng)度變化對(duì)Cd(II)與半胱氨酸結(jié)合的ITC試驗(yàn)

由圖5和表5可見，在相同pH(6.0)、相同反應(yīng)溫度(25 ℃)的情況下，改變離子強(qiáng)度，半胱氨酸與Cd(II)的相互作用強(qiáng)度沒有明顯的差異。隨著離子強(qiáng)度的升高，相互作用的焓變略微增加，但二者親合的作用方式和驅(qū)動(dòng)力并未發(fā)生變化?？傮w來說，該范圍內(nèi)離子強(qiáng)度的變化對(duì)二者的結(jié)合影響很小。

表5 不同離子強(qiáng)度下Cd(II)與半胱氨酸結(jié)合的ITC試驗(yàn)數(shù)據(jù)(25 ℃)

在前述研究的的基礎(chǔ)上，采用離子強(qiáng)度為25 mmol/L pH 6.0的Mes緩沖體系，考察了不同溫度下(25 ℃、35 ℃和45 ℃)鎘與半胱氨酸結(jié)合的差異，結(jié)果見圖6。

圖6 不同溫度下(25 ℃、35 ℃和45 ℃)Cd(II)與半胱氨酸結(jié)合的ITC試驗(yàn)

從圖6和表6中可見，隨著溫度逐漸升高，二者的結(jié)合產(chǎn)生的熱量值(ΔH)有逐漸變小的趨勢(shì)，親合力K值也是逐漸降低。推測(cè)升高溫度，不利于二者的結(jié)合。此外，溫度變化(25 ℃～40 ℃)并未改變鎘離子與半胱氨酸親合時(shí)的作用方式和驅(qū)動(dòng)力，仍為配位鍵結(jié)合和焓熵雙驅(qū)動(dòng)方式。

表6 不同溫度下Cd(II)與半胱氨酸結(jié)合的ITC試驗(yàn)數(shù)據(jù)(pH=6.0)

3 結(jié)論

本文采用等溫滴定量熱法，研究了重金屬鎘與氨基酸類單體相互作用的親合方式、驅(qū)動(dòng)力，并探討了環(huán)境條件變化對(duì)二者親合的影響。結(jié)果顯示：除脯氨酸外，其它氨基酸與鎘離子都可以相互親合。

各氨基酸在與鎘的結(jié)合過程中，巰基為放熱結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合能力最強(qiáng)；羧基為吸熱結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合能力次之；氨基為微弱的吸熱位點(diǎn)，結(jié)合能力最差，基本無結(jié)合。組氨酸中的咪唑基團(tuán)與鎘的結(jié)合作用，要明顯大于羧基；咪唑基團(tuán)與鎘離子的結(jié)合是一個(gè)吸熱結(jié)合。半胱氨酸與鎘離子的親合能力最強(qiáng)，二者的作用方式為配位鍵和靜電相互作用，驅(qū)動(dòng)力為焓熵雙驅(qū)動(dòng)和熵驅(qū)動(dòng)兩種；其他氨基酸與鎘的作用方式均為靜電相互作用，驅(qū)動(dòng)力為熵驅(qū)動(dòng)，所有的親合過程均是可以自發(fā)進(jìn)行的。

在pH 5.5～8.2范圍內(nèi)，低pH 5.5和高pH 8.2不利于Cd(II)與半胱氨酸的結(jié)合，酸性環(huán)境有利于Cd(II)的穩(wěn)定存在，偏堿的條件Cd(II)易與環(huán)境中的OH-結(jié)合生成Cd(OH)2不溶物。pH 6.0～7.5范圍利于Cd(II)與半胱氨酸的結(jié)合。升高溫度(25 ℃、35 ℃和45 ℃)，并不有利于Cd(II)與半胱氨酸的放熱結(jié)合。離子強(qiáng)度的變化(25 mmol/L～100 mmol/L)對(duì)Cd(II)與半胱氨酸的結(jié)合影響很小。

本文從熱力學(xué)的角度解釋了鎘與氨基酸類功能單體的親合機(jī)制，明確了氨基酸和鎘親合的親合方式和驅(qū)動(dòng)力，是鎘與氨基酸結(jié)合過程研究的重要理論補(bǔ)充，也為重金屬導(dǎo)致人體中毒機(jī)理的機(jī)理研究提供一定的參考。此外，氨基酸類功能單體與鎘親合過程的探索，有助于有關(guān)重金屬鎘的檢測(cè)過程中的識(shí)別元件的制備研究，為后續(xù)鎘離子檢測(cè)方法的開發(fā)提供重要的試驗(yàn)和理論指導(dǎo)。