• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    長鏈非編碼RNA ABHD11-AS1對結(jié)直腸癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移的影響及調(diào)控機(jī)制▲

    2022-09-01 03:05:14張雙龍閆一飛李庚鵬張國偉
    廣西醫(yī)學(xué) 2022年13期
    關(guān)鍵詞:報告基因熒光素酶直腸癌

    張雙龍 閆一飛 李庚鵬 張國偉

    (廈門醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院胃腸外科,福建省廈門市 361000)

    結(jié)直腸癌是臨床上常見的消化道惡性腫瘤,常發(fā)生在直腸和乙狀結(jié)腸交界處,具有發(fā)病特征不明顯、易發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移、患者預(yù)后差及死亡率高等特點[1-2]。目前結(jié)直腸癌的治療方法主要有手術(shù)、化療、放療等,隨著腫瘤治療技術(shù)的發(fā)展,結(jié)直腸癌的致死率降低至35%左右,但是仍然有近50%的患者死于腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[3-5]。因此,探討結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制,尋找結(jié)直腸癌治療的新靶點至關(guān)重要。

    長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA)是一類長度大于200nt的非編碼RNA,種類眾多,調(diào)控機(jī)制復(fù)雜[6]。越來越多的lncRNA被報告可調(diào)控腫瘤的發(fā)生和發(fā)展,其中l(wèi)ncRNA α/β水解酶域11反義RNA1(alpha/beta hydrolase domain-containing protein 11 antisense RNA 1,ABHD11-AS1)已經(jīng)被證實可調(diào)控多種腫瘤的生長或轉(zhuǎn)移,包括非小細(xì)胞肺癌、宮頸癌、卵巢癌、胰腺癌等腫瘤[7-8]。已有研究表明,ABHD11-AS1可調(diào)控miR-133a/SOX4軸來影響結(jié)直腸癌的發(fā)展[9]。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn),miR-133a可靶向調(diào)控真核起始因子4A1(eukaryotic initiation factor 4A1,EIF4A1)從而影響結(jié)直腸癌的發(fā)展[10]。目前關(guān)于ABHD11-AS1能否通過調(diào)控miR-133a/EIF4A1軸來影響結(jié)直腸癌的生長和轉(zhuǎn)移的研究較少。因此,本研究探討ABHD11-AS1對結(jié)直腸癌細(xì)胞生長、轉(zhuǎn)移的影響,以及其是否通過調(diào)控miR-133a/EIF4A1軸發(fā)揮作用,旨在為結(jié)直腸癌的靶向診治提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 主要材料和試劑 人結(jié)直腸癌細(xì)胞HT-29、SW480、DLD-1、HCT116、LOVO、SW620,以及正常結(jié)直腸黏膜細(xì)胞FHC、人胚腎細(xì)胞293T均購自中科院上海細(xì)胞庫。PrimeScriptTM試劑盒購自Takara公司(批號:2690A),PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix試劑盒、Lipofectamine 2000試劑盒、TRIzol試劑盒均購自美國Invitrogen公司(批號:C11730017、11668019、10296010),EvaGreen miRNA qPCR Master Mix試劑盒購自Abcam公司(批號:B11050),Effectene Transfection Reagent試劑盒購自QIAGEN公司(批號:301425),雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自漢恒生物技術(shù)有限公司(批號:hsa-cand-142),EIF4A1抗體、山羊抗兔二抗、內(nèi)參GAPDH抗體均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司(批號:PR30012、PR30036、6004-l-Ig),孔徑8 μm的Transwell小室購自康寧生命科學(xué)有限公司(批號:3422),CCK-8試劑盒、RIPA蛋白裂解液和ECL發(fā)光液購自沈陽萬類生物技術(shù)有限公司(批號:WLA074、WLA016、WLA003)。lncRNA ABHD11-AS1 siRNA、EIF4A1 siRNA、Negative Control、miR-133a inhibitor、miR-133a mimic、miR-NC由蘇州吉瑪基因股份有限公司合成。

    1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 取出經(jīng)液氮保存的結(jié)直腸癌細(xì)胞HT-29、SW480、DLD-1、HCT116、LOVO、SW620,以及正常結(jié)直腸黏膜細(xì)胞FHC、人胚腎細(xì)胞293T細(xì)胞,迅速解凍后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)皿中,使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基,置于含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),隔天更換細(xì)胞培養(yǎng)基,細(xì)胞生長至匯合率達(dá)80%~90%時進(jìn)行傳代。

    1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將HT-29細(xì)胞分為NC組(轉(zhuǎn)染Negative Control)、siABHD11-AS1組(轉(zhuǎn)染lncRNA ABHD11-AS1 siRNA)、miR-133a inhibitor組(轉(zhuǎn)染miR-133a inhibitor)、siABHD11-AS1+miR-133a inhibitor組(轉(zhuǎn)染lncRNA ABHD11-AS1 siRNA 24 h后,再轉(zhuǎn)染miR-133a inhibitor)和siABHD11-AS1+miR-133a inhibitor+siEIF4a1組(轉(zhuǎn)染lncRNA ABHD11-AS1 siRNA 24 h后再轉(zhuǎn)染miR-133a inhibitor 24 h后,再轉(zhuǎn)染EIF4A1 siRNA),使用Lipofectamine 2000試劑盒轉(zhuǎn)染lncRNA ABHD11-AS1 siRNA、EIF4A1 siRNA、Negative Control,使用Effectene Transfection Reagent試劑盒轉(zhuǎn)染miR-133a inhibitor,轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。Negative Control序列為(正向)5′-CAGAACGGGUCUAUACUUG-3′、(反向)5′-CAAGGUACCUACGGCAGU-3′;lncRNA ABHD11-AS1 siRNA序列為(正向)5′-CGUAAGCGUUCAUUAAGGC-3′、(反向)5′-CAAGGUGCGAUCUUAAUGC-3′;EIF4a1 siRNA序列為5′-CUGGCCGUGUGUUUGAUAU-3′;miR-133a inhibitor序列為5′-CAGCUGGUUGAAGGGGACCAAA-3′。

    1.4 實時熒光定量PCR實驗 分別將HT-29、SW480、DLD-1、HCT116、LOVO、SW620、FHC細(xì)胞,以及NC組和siABHD11-AS1組HT-29細(xì)胞接種至6孔板中,設(shè)置5個復(fù)孔,其中將轉(zhuǎn)染24 h后的HT-29細(xì)胞培養(yǎng)至匯合率達(dá)80%~90%。按照TRIzol 試劑說明書的步驟提取細(xì)胞的總RNA,使用核酸定量儀(Thermo Scientific公司,型號:NanoDrop One)檢測總RNA含量。參照PrimeScriptTM試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,全程冰浴操作,設(shè)置反應(yīng)條件為 37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s,4 ℃保存反應(yīng)產(chǎn)物用于后續(xù)實驗操作。lncRNA的實時熒光定量PCR實驗操作參照PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix試劑盒說明書,以GAPDH作為內(nèi)參,反應(yīng)體系為包括PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix 10 μL、上游和下游各1 μL、DNA模板1 μL、滅菌水7 μL。反應(yīng)條件為:50 ℃ 2 min; 95 ℃ 2 min、95 ℃ 15 s,40個循環(huán);55 ℃ 15 s;72 ℃ 1 min。miR-133a的實時熒光定量PCR實驗操作參照EvaGreen miRNA qPCR Master Mix試劑盒說明書,以U6作為內(nèi)參,反應(yīng)體系為EvaGreen miRNA Master Mix 10 μL、上游和下游引物各0.6 μL、DNA模板0.5 μL、滅菌水8.3 μL。反應(yīng)條件為:96 ℃ 6 min; 94 ℃ 15 s、65 ℃ 45 s,60個循環(huán)。實驗重復(fù)3次,引物序列如表1。

    表1 ABHD11-AS1、GAPDH、miR-133a、U6的引物序列

    1.5 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?根據(jù)miRcode數(shù)據(jù)庫(http://www.mircode.org/)并參考相關(guān)文獻(xiàn)[9],預(yù)測ABHD11-AS1與miR-133a的結(jié)合位點,設(shè)計野生型和突變型的ABHD11-AS1的3′非翻譯區(qū)-熒光素酶基因表達(dá)質(zhì)粒(即WT-ABHD11-AS1和MUT-ABHD11-AS1),使用Lipofectamine 2000試劑盒將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞,培養(yǎng)24 h后,使用Effectene Transfection Reagent試劑盒分別將miR-133a mimic、miR-NC轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞,轉(zhuǎn)染24 h后,根據(jù)雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書檢測各組細(xì)胞熒光強(qiáng)度,實驗重復(fù)3次。

    根據(jù)TargetScan數(shù)據(jù)庫(https://www.targetscan.org/vert_80/)和參考相關(guān)文獻(xiàn)[10],預(yù)測miR-133a和EIF4A1的結(jié)合位點,設(shè)計野生型和突變型的EIF4A1的3′非翻譯區(qū)-熒光素酶基因表達(dá)質(zhì)粒(即WT-EIF4A1和MUT-EIF4A1),使用Lipofectamine 2000試劑盒將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞,培養(yǎng)24 h后,使用Effectene Transfection Reagent試劑盒分別將miR-133a mimic、miR-NC轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞,轉(zhuǎn)染24 h后,根據(jù)雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書檢測各組細(xì)胞熒光強(qiáng)度。實驗重復(fù)3次。

    1.6 Western blot實驗 取轉(zhuǎn)染24 h后的NC組、siABHD11-AS1組、miR-133a inhibitor組、siABHD11-AS1+miR-133a inhibitor組HT-29細(xì)胞,加入200 μL RIPA蛋白裂解液,4 ℃條件下裂解30 min,然后在4 ℃下12 000 r/min離心10 min,收集上清為總蛋白,使用二喹啉甲酸蛋白定量法測定總蛋白濃度。取10 μg蛋白溶液進(jìn)行SDS-PAGE,蛋白分離后轉(zhuǎn)膜,使用PVDF膜封閉2 h后,然后與EIF4A1一抗(1 ∶1 000)、GAPDH(1 ∶5 000)4 ℃孵育過夜,使用TBST洗膜后加入二抗(1 ∶1 000)室溫孵育1.5 h,使用TBST清洗PVDF膜后,使用ECL試劑盒配置發(fā)光液,并將PVDF膜浸入發(fā)光液中反應(yīng)30 s,曝光并拍照,以GAPDH為內(nèi)參,用ImageJ軟件對條帶灰度值進(jìn)行半定量分析。實驗重復(fù)3次。

    1.7 細(xì)胞增殖實驗 使用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力。取轉(zhuǎn)染24 h后的NC組、siABHD11-AS1組、siABHD11-AS1+miR-133a inhibitor組、siABHD11-AS1+miR-133a inhibitor+siEIF4A1組TH-29細(xì)胞,使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋至5×104個/mL,將HT-29細(xì)胞接種至96孔板,100 μL/孔,每組3個復(fù)孔,37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng),設(shè)置0 h、24 h、48 h、72 h時間點對應(yīng)的96孔板,在各時間點取出對應(yīng)的96孔板,每孔加入10 μL CCK-8溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,使用酶標(biāo)儀(Molecular Devices公司,型號:SpectraMax M5)檢測各孔450 nm處的吸光度值。實驗重復(fù)3次。

    1.8 細(xì)胞遷移和侵襲實驗 使用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋NC組、siABHD11-AS1組、siABHD11-AS1+miR-133a inhibitor組、siABHD11-AS1+miR-133a inhibitor+siEIF4A1組的HT-29細(xì)胞至1×105個/mL,取100 μL細(xì)胞懸液接種于Transwel小室中用于檢測細(xì)胞遷移,接種于鋪含有50 μL Matrigel的Transwell小室中用于檢測細(xì)胞侵襲,每孔1×104個細(xì)胞,每孔再加入100 μL RPMI-1640培養(yǎng)基,每組3個復(fù)孔,將小室放置于24孔板中,24孔板每孔加入600 μL含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基,并將上述24孔板轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,小室底部用PBS清洗后用無水乙醇固定30 min,然后將小室倒扣,于底部滴加結(jié)晶紫染色10 min,清洗后晾干,于顯微鏡下觀察拍照并計數(shù)。實驗重復(fù)3次。

    1.9 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以(x±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗,兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 正常結(jié)直腸黏膜細(xì)胞與人結(jié)直腸癌細(xì)胞中ABHD11-AS1表達(dá)量的比較 與正常結(jié)直腸黏膜細(xì)胞FHC相比,人結(jié)直腸癌細(xì)胞HT-29、SW480、DLD-1、HCT116、LOVO、SW620的ABHD11-AS1表達(dá)量均升高,且HT-29細(xì)胞的ABHD11-AS1表達(dá)量最高(均P<0.05),因此取HT-29細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。siABHD11-AS1組HT-29細(xì)胞的ABHD11-AS1表達(dá)量低于NC組(P<0.05),提示轉(zhuǎn)染siABHD11-AS1可抑制TH-29細(xì)胞中ABHD11-AS1的表達(dá),可進(jìn)行后續(xù)研究。見表1、表2。

    表1 正常結(jié)直腸黏膜細(xì)胞與人結(jié)直腸癌細(xì)胞中ABHD11-AS1 mRNA相對表達(dá)量的比較(x±s)

    表2 NC組和siABHD11-AS1組HT29細(xì)胞中ABHD11-AS1相對表達(dá)量的比較(x±s)

    2.2 ABHD11-AS1與miR-133a的靶向關(guān)系 ABHD11-AS1與miR-133a的結(jié)合位點結(jié)果如圖1所示。雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染MUT-ABHD11-AS1+miR-NC的細(xì)胞和轉(zhuǎn)染MUT-ABHD11-AS1+miR-133a mimic的細(xì)胞的相對熒光強(qiáng)度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),而轉(zhuǎn)染W(wǎng)T- ABHD11-AS1+miR-133a mimic的細(xì)胞相對熒光強(qiáng)度低于轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-ABHD11-AS1+miR-NC的細(xì)胞(P<0.05),表明ABHD11-AS1可與miR-133a結(jié)合,見表3。siABHD11-AS1組HT-29細(xì)胞中miR-133a表達(dá)量高于NC組(P<0.05),見表4。

    圖1 ABHD11-AS1和miR-133a的結(jié)合位點

    表3 ABHD11-AS1與miR-133a靶向關(guān)系的雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果(x±s)

    表4 NC組和siABHD11-AS1組HT29細(xì)胞miR-133a相對表達(dá)量的比較(x±s)

    2.3 EIF4A1與miR-133a的靶向關(guān)系 miR-133a和EIF4A1的結(jié)合位點如圖2所示。雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染MUT- EIF4A1+miR-NC的細(xì)胞和轉(zhuǎn)染MUT- EIF4A1+miR-133a mimic的細(xì)胞的相對熒光強(qiáng)度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),但轉(zhuǎn)染W(wǎng)T- EIF4A1+miR-133a mimic的細(xì)胞相對熒光強(qiáng)度低于轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-EIF4A1+miR-NC的細(xì)胞(P<0.05),說明EIF4A1為miR-133a的靶基因,見表5。

    圖2 miR-133a和EIF4A1的結(jié)合位點

    表5 EIF4A1與miR-133a靶向關(guān)系的雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果(x±s)

    2.4 各組HT-29細(xì)胞EIF4A1蛋白表達(dá)量的比較 Western blot檢測結(jié)果顯示,miR-133a inhibitor組HT-29細(xì)胞EIF4A1蛋白表達(dá)量高于NC組(P<0.05)。siABHD11-AS1組HT-29細(xì)胞EIF4A1蛋白表達(dá)量低于NC組,而siABHD11-AS1+miR-133a inhibitor組HT-29細(xì)胞的EIF4A1蛋白表達(dá)量高于siABHD11-AS1組(均P<0.05)。見圖3、表6、表7。

    圖3 各組HT-29細(xì)胞EIF4A1蛋白的表達(dá)情況

    表6 NC組和miR-133a inhibitor組HT-29細(xì)胞中EIF4A1蛋白相對表達(dá)量的比較(x±s)

    表7 NC組、siABHD11-AS1組和siABHD11-AS1+miR-133a inhibitor組HT-29細(xì)胞EIF4A1蛋白相對表達(dá)量的比較(x±s)

    2.5 各組HT-29細(xì)胞增殖能力的比較 CCK-8檢測結(jié)果顯示,干預(yù)24 h、48 h、72 h后,siABHD11-AS1組HT-29細(xì)胞吸光度值低于NC組,siABHD11-AS1+miR-133a inhibitor組HT-29細(xì)胞吸光度值均高于siABHD11-AS1組,而siABHD11-AS1+miR-133a inhibitor+siEIF4A1組HT-29細(xì)胞吸光度值均低于siABHD11-AS1+miR-133a inhibitor組(均P<0.05)。見表8。

    表8 各組HT29細(xì)胞吸光度值的比較(x±s)

    2.6 各組HT-29細(xì)胞遷移和侵襲能力的比較 相較于NC組,siABHD11-AS1組HT-29細(xì)胞的遷移數(shù)和侵襲數(shù)均減少,siABHD11-AS1+miR-133a inhibitor組HT-29細(xì)胞的遷移數(shù)和侵襲數(shù)均多于siABHD11-AS1組,而siABHD11-AS1+miR-133a inhibitor+siEIF4A1組HT-29細(xì)胞的遷移數(shù)和侵襲數(shù)均少于siABHD11-AS1+miR-133a inhibitor組(均P<0.05)。見圖4、表9。

    圖4 各組HT29細(xì)胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)的比較(×20)

    表9 各組HT29細(xì)胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)的比較(x±s)

    3 討 論

    目前,結(jié)直腸癌主要的治療方法有手術(shù)治療、化療和放療。雖然近幾年來結(jié)直腸癌患者的預(yù)后不斷得到改善,治療后患者的生存率可提高至60%左右,但是由于結(jié)直腸癌的早期病理特征不明顯,患者在確診時即已處于中晚期,錯過了手術(shù)治療的最佳時期;同時,約20%的患者在確診時即出現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移,無法進(jìn)行手術(shù)治療;此外,手術(shù)治療后患者5年內(nèi)腫瘤復(fù)發(fā)率高達(dá)30%,化療和放療雖然可用于轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的患者,但是耐藥等問題嚴(yán)重影響治療效果[11-12]。因此,深入研究結(jié)直腸癌生長和轉(zhuǎn)移的機(jī)制,發(fā)現(xiàn)更多可用于結(jié)直腸癌診斷和治療的生物標(biāo)志物,對于改善結(jié)直腸癌患者的預(yù)后具有重要意義。

    隨著基因芯片和基因測序技術(shù)的發(fā)展,越來越多的非編碼RNA被發(fā)現(xiàn)具有調(diào)控腫瘤生長、轉(zhuǎn)移、耐藥、免疫逃逸等病理進(jìn)程的生物學(xué)功能。其中,lncRNA是一類長度大于200nt的非編碼RNA,并且lncRNA能夠參與調(diào)控機(jī)體的多種生物學(xué)功能,但調(diào)控機(jī)制復(fù)雜,其主要是作為支架或向?qū)д{(diào)控蛋白與基因之間相互作用,通過“海綿”的方式與miRNA相結(jié)合,作為增強(qiáng)子調(diào)控其下游靶基因的轉(zhuǎn)錄等。已有研究報告,在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中,lncRNA可調(diào)控多種腫瘤的增殖、侵襲、遷移等[13-14]。在結(jié)直腸癌中,lncRNA TINCR可通過調(diào)控miR-107/CD36信號軸而影響結(jié)直腸癌的增殖和凋亡[15-16],lncRNA cCSC1可通過調(diào)控miR-124-3p/CD44軸而促進(jìn)結(jié)腸癌的增殖[17]。因此,lncRNA有望成為結(jié)直腸癌的新型診斷標(biāo)志物及治療靶點。lncRNA ABHD11-AS1已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。例如,ABHD11-AS1通過調(diào)控細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)以促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖與遷移[18];ABHD11-AS1可作為早期診斷胰腺癌的指標(biāo)[19];ABHD11-AS1通過調(diào)控miR-1301-3p/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3軸和磷酸肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信號通路,從而促進(jìn)甲狀腺乳頭狀癌的進(jìn)展[20];ABHD11-AS1通過調(diào)控miR-199a-5p/溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族1成員5軸而影響甲狀腺乳頭狀癌的進(jìn)程[21]。但是,有關(guān)ABHD11-AS1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況,以及其對結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的影響的研究較少,因此,本研究探究ABHD11-AS1對結(jié)直腸癌生長和轉(zhuǎn)移的影響及可能調(diào)控機(jī)制。

    本研究結(jié)果顯示,ABHD11-AS1高表達(dá)于結(jié)直腸癌細(xì)胞系HT-29、SW480、DLD-1、HCT116、LOVO、SW620(均P<0.05),這提示ABHD11-AS1可能對結(jié)直腸癌的發(fā)生具有調(diào)控作用。此外,通過轉(zhuǎn)染siRNA抑制HT-29細(xì)胞中ABHD11-AS1的表達(dá)后,結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力均下降(均P<0.05),說明ABHD11-AS1具有調(diào)控腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的功能。lncRNA的主要調(diào)控機(jī)制為,與miRNA相結(jié)合后作為增強(qiáng)子調(diào)控其下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。本研究通過數(shù)據(jù)庫預(yù)測及雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C了ABHD11-AS1可與miR-133a結(jié)合。Wang等[22]的研究表明,miR-133a的表達(dá)抑制與結(jié)直腸癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān);Dong等[23]亦發(fā)現(xiàn)miR-133a可作為結(jié)直腸癌的抑制因子。本研究中,siABHD11-AS1組HT-29細(xì)胞中miR-133a表達(dá)高于NC組(P<0.05),即抑制ABHD11-AS1的表達(dá)可上調(diào)HT-29細(xì)胞中miR-133a的表達(dá)。因此,我們推測ABHD11-AS1或可通過抑制miR-133a的表達(dá)來促進(jìn)結(jié)直腸癌的病理進(jìn)程。在本研究中,我們通過轉(zhuǎn)染siRNA抑制HT-29細(xì)胞中ABHD11-AS1的表達(dá)后再抑制miR-133a的表達(dá),發(fā)現(xiàn)HT-29細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力增強(qiáng),這進(jìn)一步表明ABHD11-AS1可通過調(diào)控miR-133a的表達(dá)而影響結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。

    miRNA是一類長度為19~24 nt的非編碼單鏈RNA,其通過堿基互補(bǔ)配對的方式與靶基因的3′-非翻譯區(qū)部分或完全互補(bǔ),剪切靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或抑制轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的翻譯,從而起到在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因表達(dá)的作用[24]。本研究通過數(shù)據(jù)庫預(yù)測了miR-133a和EIF4A1的結(jié)合位點,然后通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C了EIF4A1為miR-133a的靶基因。EIF4A1亦與腫瘤發(fā)生和進(jìn)展密切相關(guān),例如EIF4A1的表達(dá)與乳腺癌中的惡性程度和不良預(yù)后呈正相關(guān)[25]。本研究結(jié)果顯示,抑制miR-133a后HT-29細(xì)胞中的EIF4A1蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05);抑制ABHD11-AS1表達(dá)后HT-29細(xì)胞中的EIF4A1蛋白表達(dá)下調(diào),但先抑制ABHD11-AS1表達(dá)再抑制miR-133a的表達(dá),HT-29細(xì)胞中的EIF4A1表達(dá)反而上調(diào)(P<0.05)。這表明ABHD11-AS1可調(diào)控miR-133a/EIF4A1信號軸,進(jìn)而調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。

    綜上所述,ABHD11-AS1在結(jié)直腸癌細(xì)胞中呈高表達(dá),并且抑制ABHD11-AS1后,結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力均顯著下降, 其可能通過調(diào)控miR-133a/EIF4A1信號軸發(fā)揮作用。但是ABHD11-AS1在結(jié)直腸癌患者腫瘤組織中的表達(dá),以及ABHD11-AS1是否可作為結(jié)直腸癌診斷和治療的新靶點,還需要進(jìn)一步探究。

    (致謝:感謝廈門醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部李良華老師在實驗上給予的幫助)

    猜你喜歡
    報告基因熒光素酶直腸癌
    日本落葉松內(nèi)源GUS基因鑒定及其酶活性分析
    NNMT基因啟動子雙熒光素酶報告系統(tǒng)的構(gòu)建及其與SND1靶向關(guān)系的驗證
    不同雙熒光素酶方法對檢測胃癌相關(guān)miRNAs靶向基因TIAM1的影響
    重組雙熒光素酶報告基因質(zhì)粒psiCHECK-2-Intron構(gòu)建轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染細(xì)胞螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶表達(dá)
    腹腔鏡下直腸癌前側(cè)切除術(shù)治療直腸癌的效果觀察
    直腸癌術(shù)前放療的研究進(jìn)展
    COXⅠ和COX Ⅲ在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及其臨床意義
    啟動子陷阱技術(shù)在植物啟動子克隆研究中的應(yīng)用
    報告基因標(biāo)記在干細(xì)胞治療急性心肌梗死中的應(yīng)用進(jìn)展
    GRP及GRPR在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及意義
    黑人欧美特级aaaaaa片| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 免费人成在线观看视频色| 性高湖久久久久久久久免费观看| 欧美日韩视频精品一区| 黄色怎么调成土黄色| 水蜜桃什么品种好| 久久婷婷青草| av.在线天堂| 国产一区二区在线观看av| 亚洲精品国产色婷婷电影| 精品一区二区三区视频在线| 精品人妻在线不人妻| 99国产综合亚洲精品| 26uuu在线亚洲综合色| 一级二级三级毛片免费看| 亚洲欧美一区二区三区国产| 国产精品人妻久久久久久| 久久99一区二区三区| 国产成人91sexporn| xxxhd国产人妻xxx| 国产爽快片一区二区三区| 国产不卡av网站在线观看| 国产成人精品无人区| 成人国产av品久久久| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 热99久久久久精品小说推荐| 久久免费观看电影| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 曰老女人黄片| 日韩欧美一区视频在线观看| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 美女xxoo啪啪120秒动态图| av女优亚洲男人天堂| 午夜影院在线不卡| 人妻夜夜爽99麻豆av| 日韩中文字幕视频在线看片| 久久久久网色| 两个人免费观看高清视频| 高清黄色对白视频在线免费看| 亚洲精品乱久久久久久| 免费日韩欧美在线观看| 日韩一区二区视频免费看| 午夜福利网站1000一区二区三区| √禁漫天堂资源中文www| 久久久久网色| 久久久欧美国产精品| 交换朋友夫妻互换小说| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 欧美日韩av久久| 免费人成在线观看视频色| 亚洲av日韩在线播放| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 精品久久久精品久久久| 精品亚洲成a人片在线观看| 99精国产麻豆久久婷婷| 国产成人91sexporn| 成人无遮挡网站| 十八禁高潮呻吟视频| 欧美最新免费一区二区三区| 欧美精品国产亚洲| 九色亚洲精品在线播放| 精品少妇黑人巨大在线播放| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 在线观看免费高清a一片| 亚洲精品国产av蜜桃| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 观看美女的网站| 婷婷色av中文字幕| 久久精品国产亚洲av涩爱| 国产一区二区三区av在线| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 建设人人有责人人尽责人人享有的| a级片在线免费高清观看视频| av在线观看视频网站免费| 亚洲国产精品一区三区| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 免费av不卡在线播放| 精品久久久久久电影网| 老司机亚洲免费影院| 天天影视国产精品| 午夜福利网站1000一区二区三区| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 婷婷成人精品国产| 夫妻性生交免费视频一级片| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 久久久久网色| 伦精品一区二区三区| 日本午夜av视频| 日日摸夜夜添夜夜爱| 自线自在国产av| 亚洲成人av在线免费| 久久久久久久久大av| 最后的刺客免费高清国语| 免费黄频网站在线观看国产| 一级,二级,三级黄色视频| 青春草亚洲视频在线观看| 美女视频免费永久观看网站| 波野结衣二区三区在线| 久久人人爽人人爽人人片va| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 99re6热这里在线精品视频| av免费观看日本| 国产精品久久久久久av不卡| 免费少妇av软件| 母亲3免费完整高清在线观看 | 日产精品乱码卡一卡2卡三| 国产精品女同一区二区软件| 久久久久久久国产电影| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 亚洲av免费高清在线观看| 精品一品国产午夜福利视频| 日本av免费视频播放| av在线播放精品| 久久精品国产a三级三级三级| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| av一本久久久久| 日本黄色片子视频| 99国产综合亚洲精品| 亚洲国产欧美在线一区| 啦啦啦啦在线视频资源| 国产av码专区亚洲av| 爱豆传媒免费全集在线观看| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 国产成人freesex在线| 亚洲美女视频黄频| 欧美日韩av久久| 国产毛片在线视频| 亚洲av男天堂| 99热这里只有是精品在线观看| 久久精品国产亚洲av涩爱| 搡女人真爽免费视频火全软件| 亚洲精品国产av成人精品| h视频一区二区三区| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 国产黄片视频在线免费观看| 天天影视国产精品| av免费观看日本| 能在线免费看毛片的网站| 夜夜爽夜夜爽视频| 日本色播在线视频| 亚洲四区av| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 国产精品.久久久| 日韩大片免费观看网站| a级毛色黄片| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 亚洲精品日本国产第一区| 赤兔流量卡办理| 制服诱惑二区| 日韩亚洲欧美综合| 久久av网站| 日本wwww免费看| 在现免费观看毛片| 国产在线视频一区二区| 精品久久久久久久久av| 久久久久久久国产电影| 熟女电影av网| 少妇人妻久久综合中文| 亚洲高清免费不卡视频| 日韩一区二区视频免费看| 哪个播放器可以免费观看大片| 性色avwww在线观看| 在线观看免费视频网站a站| 91aial.com中文字幕在线观看| 亚洲高清免费不卡视频| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 日韩三级伦理在线观看| 亚洲av综合色区一区| 色网站视频免费| 黑人猛操日本美女一级片| 亚洲av不卡在线观看| 国产男女超爽视频在线观看| 午夜久久久在线观看| 欧美 日韩 精品 国产| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 国产高清国产精品国产三级| 丁香六月天网| 欧美日韩精品成人综合77777| 最近手机中文字幕大全| 国产伦理片在线播放av一区| 极品人妻少妇av视频| a级毛片黄视频| 精品少妇黑人巨大在线播放| 美女国产视频在线观看| 一本大道久久a久久精品| 两个人免费观看高清视频| 天堂中文最新版在线下载| 日韩中文字幕视频在线看片| 国产爽快片一区二区三区| 欧美精品一区二区大全| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| kizo精华| 啦啦啦在线观看免费高清www| 丰满饥渴人妻一区二区三| 色网站视频免费| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 十八禁高潮呻吟视频| 亚洲精品亚洲一区二区| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 国产一区二区三区av在线| videossex国产| 考比视频在线观看| 97超视频在线观看视频| 久久久久久久大尺度免费视频| 亚洲欧美精品自产自拍| 精品少妇内射三级| 亚洲性久久影院| 日本vs欧美在线观看视频| 99热全是精品| 国产有黄有色有爽视频| 久久青草综合色| 日韩视频在线欧美| 日日撸夜夜添| 热re99久久精品国产66热6| 成人亚洲欧美一区二区av| 男女高潮啪啪啪动态图| 国产成人精品一,二区| 国产 一区精品| 亚洲精品日本国产第一区| 岛国毛片在线播放| 777米奇影视久久| 飞空精品影院首页| 国产黄色免费在线视频| 最后的刺客免费高清国语| 尾随美女入室| 有码 亚洲区| 高清毛片免费看| 久久久午夜欧美精品| 好男人视频免费观看在线| 国产成人午夜福利电影在线观看| 亚洲国产欧美在线一区| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 18在线观看网站| 春色校园在线视频观看| 久久久久久久久久久免费av| 日本爱情动作片www.在线观看| 亚洲丝袜综合中文字幕| 七月丁香在线播放| 18禁观看日本| 一级,二级,三级黄色视频| 天美传媒精品一区二区| 国产午夜精品一二区理论片| 在线观看三级黄色| 久久久久久久国产电影| 国产精品一国产av| 国产乱来视频区| 欧美xxⅹ黑人| 一本久久精品| 色94色欧美一区二区| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产精品久久久久久久久免| 久久久久久久久久久免费av| 黑人高潮一二区| 超碰97精品在线观看| 国产免费福利视频在线观看| 国产在视频线精品| 免费大片黄手机在线观看| 国产精品三级大全| 一级爰片在线观看| av福利片在线| 天堂俺去俺来也www色官网| 寂寞人妻少妇视频99o| 久久 成人 亚洲| 考比视频在线观看| 精品久久国产蜜桃| 精品一区二区三卡| 大码成人一级视频| 在线观看人妻少妇| 亚洲国产av新网站| 亚洲人成网站在线播| 亚洲一区二区三区欧美精品| 一本一本综合久久| 全区人妻精品视频| 精品卡一卡二卡四卡免费| 欧美激情国产日韩精品一区| 一级毛片电影观看| 青春草视频在线免费观看| 国产一区二区在线观看av| 蜜桃国产av成人99| 午夜av观看不卡| 午夜激情福利司机影院| 边亲边吃奶的免费视频| 女性被躁到高潮视频| 黑丝袜美女国产一区| 亚洲精品久久午夜乱码| 欧美+日韩+精品| 97在线视频观看| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 日韩中字成人| 最近的中文字幕免费完整| 免费看光身美女| 国产一区亚洲一区在线观看| 亚洲美女搞黄在线观看| 26uuu在线亚洲综合色| 青春草国产在线视频| 国产免费一级a男人的天堂| 成人无遮挡网站| www.av在线官网国产| 欧美性感艳星| 欧美激情 高清一区二区三区| 一级片'在线观看视频| 丁香六月天网| 最近最新中文字幕免费大全7| 国产爽快片一区二区三区| 亚洲美女黄色视频免费看| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 欧美日本中文国产一区发布| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 欧美激情 高清一区二区三区| 夫妻午夜视频| 久热这里只有精品99| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 99热这里只有精品一区| 亚洲欧洲国产日韩| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 日本色播在线视频| 欧美 日韩 精品 国产| 国产精品偷伦视频观看了| 最近的中文字幕免费完整| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 人妻人人澡人人爽人人| 全区人妻精品视频| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 99精国产麻豆久久婷婷| 亚洲欧美清纯卡通| av.在线天堂| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 久久久久久久精品精品| 亚洲精品美女久久av网站| 在线观看美女被高潮喷水网站| 熟女av电影| 国产亚洲最大av| 在线观看免费视频网站a站| 777米奇影视久久| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 久久久久久久久大av| 亚洲av在线观看美女高潮| 视频区图区小说| 18禁动态无遮挡网站| 亚洲熟女精品中文字幕| 婷婷成人精品国产| 亚洲天堂av无毛| 亚洲精品中文字幕在线视频| av免费观看日本| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 2022亚洲国产成人精品| 啦啦啦啦在线视频资源| 亚洲精品亚洲一区二区| 国产精品嫩草影院av在线观看| 精品少妇黑人巨大在线播放| a级毛片免费高清观看在线播放| 青春草视频在线免费观看| 日韩中文字幕视频在线看片| 免费黄频网站在线观看国产| 各种免费的搞黄视频| videos熟女内射| 成人国产麻豆网| 亚洲国产成人一精品久久久| 国产国语露脸激情在线看| 特大巨黑吊av在线直播| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 久久久久网色| 色94色欧美一区二区| 国产综合精华液| av线在线观看网站| 在线观看免费日韩欧美大片 | 国产av精品麻豆| 精品国产国语对白av| 亚洲经典国产精华液单| 精品国产国语对白av| 亚洲人成77777在线视频| 国产免费一区二区三区四区乱码| 精品国产露脸久久av麻豆| 午夜影院在线不卡| 大码成人一级视频| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 久久综合国产亚洲精品| 国产欧美亚洲国产| 午夜福利视频精品| 高清午夜精品一区二区三区| 亚洲av免费高清在线观看| 满18在线观看网站| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 一边摸一边做爽爽视频免费| 91国产中文字幕| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 日本黄色片子视频| 美女主播在线视频| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 国产精品成人在线| 精品国产国语对白av| 青春草视频在线免费观看| 国产一区二区在线观看av| 91精品国产九色| 这个男人来自地球电影免费观看 | www.色视频.com| 伊人久久国产一区二区| 日韩三级伦理在线观看| h视频一区二区三区| 国产精品三级大全| 蜜桃在线观看..| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 久久人人爽人人爽人人片va| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 看十八女毛片水多多多| 最后的刺客免费高清国语| 精品国产露脸久久av麻豆| 国产在线免费精品| 精品国产国语对白av| 亚洲成人av在线免费| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 亚洲av日韩在线播放| 欧美精品亚洲一区二区| 制服诱惑二区| 高清在线视频一区二区三区| 国产男人的电影天堂91| 另类亚洲欧美激情| av在线播放精品| 亚洲人成77777在线视频| 国产精品久久久久成人av| 男女免费视频国产| 丝袜脚勾引网站| 久久久亚洲精品成人影院| a级毛色黄片| av福利片在线| 国产一区有黄有色的免费视频| 亚洲内射少妇av| 国产又色又爽无遮挡免| 日日摸夜夜添夜夜爱| 精品国产露脸久久av麻豆| 亚洲国产色片| 久久99蜜桃精品久久| 18禁观看日本| 亚洲国产欧美在线一区| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 色网站视频免费| 国产片特级美女逼逼视频| 久久免费观看电影| 香蕉精品网在线| 亚洲怡红院男人天堂| 久久久a久久爽久久v久久| 男女边吃奶边做爰视频| 美女福利国产在线| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 美女cb高潮喷水在线观看| 美女大奶头黄色视频| 韩国高清视频一区二区三区| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 日本欧美视频一区| 久久综合国产亚洲精品| 免费高清在线观看日韩| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 亚洲熟女精品中文字幕| 免费黄频网站在线观看国产| 国产高清国产精品国产三级| 久久久国产精品麻豆| 亚洲四区av| 久久久午夜欧美精品| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 国产精品人妻久久久影院| 蜜桃在线观看..| 国产免费视频播放在线视频| 久久99一区二区三区| 国产视频内射| 国产成人91sexporn| h视频一区二区三区| 日韩成人av中文字幕在线观看| 波野结衣二区三区在线| 国产精品99久久99久久久不卡 | 夜夜爽夜夜爽视频| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 色94色欧美一区二区| 精品一区二区三区视频在线| 亚洲熟女精品中文字幕| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 国产一区二区三区av在线| 伊人久久国产一区二区| 男女高潮啪啪啪动态图| 女人久久www免费人成看片| 热99国产精品久久久久久7| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 99热这里只有精品一区| 精品久久久久久久久av| 黄色配什么色好看| 国产老妇伦熟女老妇高清| av在线观看视频网站免费| 亚洲av在线观看美女高潮| 亚洲欧洲日产国产| 岛国毛片在线播放| 美女国产高潮福利片在线看| 欧美日韩精品成人综合77777| 欧美精品高潮呻吟av久久| 亚洲国产精品一区三区| 最近中文字幕2019免费版| 国产精品99久久99久久久不卡 | 国产淫语在线视频| 久久精品久久精品一区二区三区| 欧美三级亚洲精品| 免费看av在线观看网站| 日韩三级伦理在线观看| 99re6热这里在线精品视频| 亚洲欧美清纯卡通| 91国产中文字幕| 国产亚洲精品第一综合不卡 | 性色av一级| 极品人妻少妇av视频| 午夜视频国产福利| 毛片一级片免费看久久久久| 日韩av不卡免费在线播放| 亚洲美女搞黄在线观看| 久久久精品94久久精品| 亚洲经典国产精华液单| 在线免费观看不下载黄p国产| 精品国产乱码久久久久久小说| 夜夜爽夜夜爽视频| 国产高清有码在线观看视频| 交换朋友夫妻互换小说| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 亚洲av福利一区| 国产在线视频一区二区| 美女国产高潮福利片在线看| 少妇被粗大猛烈的视频| 秋霞伦理黄片| 99久久综合免费| 视频在线观看一区二区三区| av黄色大香蕉| 亚洲情色 制服丝袜| 99国产综合亚洲精品| 国产精品国产三级国产专区5o| 亚洲av男天堂| 麻豆成人av视频| 99久久精品国产国产毛片| 欧美日韩在线观看h| 天天影视国产精品| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 两个人的视频大全免费| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 国产在线视频一区二区| 男人爽女人下面视频在线观看| av福利片在线| 两个人免费观看高清视频| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 18在线观看网站| 日本91视频免费播放| 18禁在线播放成人免费| 中文字幕人妻丝袜制服| 亚洲精品456在线播放app| 欧美精品国产亚洲| 女人久久www免费人成看片| 最近的中文字幕免费完整| 少妇人妻久久综合中文| 人妻一区二区av| 色婷婷久久久亚洲欧美| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 赤兔流量卡办理| 午夜老司机福利剧场| 91aial.com中文字幕在线观看| 国产色婷婷99| 国产免费视频播放在线视频| 亚洲精品视频女| 涩涩av久久男人的天堂| a级毛片在线看网站| 国产乱人偷精品视频| 黑人欧美特级aaaaaa片| 久久99一区二区三区| 国产爽快片一区二区三区| 亚洲精品国产色婷婷电影| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 国产一级毛片在线| 九色成人免费人妻av| 免费大片黄手机在线观看| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 久久久久久伊人网av| 99国产精品免费福利视频| 精品一区二区三区视频在线| 草草在线视频免费看| 国产伦理片在线播放av一区| 在线 av 中文字幕| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 赤兔流量卡办理| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 精品少妇内射三级| 大香蕉久久成人网| 久久狼人影院| 国产免费一区二区三区四区乱码| 中文欧美无线码| 成人综合一区亚洲| 美女内射精品一级片tv| 超色免费av| 男人添女人高潮全过程视频| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 丝袜美足系列| 一区二区三区精品91| 亚洲三级黄色毛片| 国模一区二区三区四区视频| 亚洲精品日韩av片在线观看| 赤兔流量卡办理| 亚洲四区av| 亚洲国产av新网站| 一个人看视频在线观看www免费| 51国产日韩欧美|