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    長鏈非編碼RNA ABHD11-AS1對結(jié)直腸癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移的影響及調(diào)控機(jī)制▲

    2022-09-01 03:05:14張雙龍閆一飛李庚鵬張國偉
    廣西醫(yī)學(xué) 2022年13期
    關(guān)鍵詞:報告基因熒光素酶直腸癌

    張雙龍 閆一飛 李庚鵬 張國偉

    (廈門醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院胃腸外科,福建省廈門市 361000)

    結(jié)直腸癌是臨床上常見的消化道惡性腫瘤,常發(fā)生在直腸和乙狀結(jié)腸交界處,具有發(fā)病特征不明顯、易發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移、患者預(yù)后差及死亡率高等特點[1-2]。目前結(jié)直腸癌的治療方法主要有手術(shù)、化療、放療等,隨著腫瘤治療技術(shù)的發(fā)展,結(jié)直腸癌的致死率降低至35%左右,但是仍然有近50%的患者死于腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[3-5]。因此,探討結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制,尋找結(jié)直腸癌治療的新靶點至關(guān)重要。

    長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA)是一類長度大于200nt的非編碼RNA,種類眾多,調(diào)控機(jī)制復(fù)雜[6]。越來越多的lncRNA被報告可調(diào)控腫瘤的發(fā)生和發(fā)展,其中l(wèi)ncRNA α/β水解酶域11反義RNA1(alpha/beta hydrolase domain-containing protein 11 antisense RNA 1,ABHD11-AS1)已經(jīng)被證實可調(diào)控多種腫瘤的生長或轉(zhuǎn)移,包括非小細(xì)胞肺癌、宮頸癌、卵巢癌、胰腺癌等腫瘤[7-8]。已有研究表明,ABHD11-AS1可調(diào)控miR-133a/SOX4軸來影響結(jié)直腸癌的發(fā)展[9]。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn),miR-133a可靶向調(diào)控真核起始因子4A1(eukaryotic initiation factor 4A1,EIF4A1)從而影響結(jié)直腸癌的發(fā)展[10]。目前關(guān)于ABHD11-AS1能否通過調(diào)控miR-133a/EIF4A1軸來影響結(jié)直腸癌的生長和轉(zhuǎn)移的研究較少。因此,本研究探討ABHD11-AS1對結(jié)直腸癌細(xì)胞生長、轉(zhuǎn)移的影響,以及其是否通過調(diào)控miR-133a/EIF4A1軸發(fā)揮作用,旨在為結(jié)直腸癌的靶向診治提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 主要材料和試劑 人結(jié)直腸癌細(xì)胞HT-29、SW480、DLD-1、HCT116、LOVO、SW620,以及正常結(jié)直腸黏膜細(xì)胞FHC、人胚腎細(xì)胞293T均購自中科院上海細(xì)胞庫。PrimeScriptTM試劑盒購自Takara公司(批號:2690A),PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix試劑盒、Lipofectamine 2000試劑盒、TRIzol試劑盒均購自美國Invitrogen公司(批號:C11730017、11668019、10296010),EvaGreen miRNA qPCR Master Mix試劑盒購自Abcam公司(批號:B11050),Effectene Transfection Reagent試劑盒購自QIAGEN公司(批號:301425),雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自漢恒生物技術(shù)有限公司(批號:hsa-cand-142),EIF4A1抗體、山羊抗兔二抗、內(nèi)參GAPDH抗體均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司(批號:PR30012、PR30036、6004-l-Ig),孔徑8 μm的Transwell小室購自康寧生命科學(xué)有限公司(批號:3422),CCK-8試劑盒、RIPA蛋白裂解液和ECL發(fā)光液購自沈陽萬類生物技術(shù)有限公司(批號:WLA074、WLA016、WLA003)。lncRNA ABHD11-AS1 siRNA、EIF4A1 siRNA、Negative Control、miR-133a inhibitor、miR-133a mimic、miR-NC由蘇州吉瑪基因股份有限公司合成。

    1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 取出經(jīng)液氮保存的結(jié)直腸癌細(xì)胞HT-29、SW480、DLD-1、HCT116、LOVO、SW620,以及正常結(jié)直腸黏膜細(xì)胞FHC、人胚腎細(xì)胞293T細(xì)胞,迅速解凍后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)皿中,使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基,置于含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),隔天更換細(xì)胞培養(yǎng)基,細(xì)胞生長至匯合率達(dá)80%~90%時進(jìn)行傳代。

    1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將HT-29細(xì)胞分為NC組(轉(zhuǎn)染Negative Control)、siABHD11-AS1組(轉(zhuǎn)染lncRNA ABHD11-AS1 siRNA)、miR-133a inhibitor組(轉(zhuǎn)染miR-133a inhibitor)、siABHD11-AS1+miR-133a inhibitor組(轉(zhuǎn)染lncRNA ABHD11-AS1 siRNA 24 h后,再轉(zhuǎn)染miR-133a inhibitor)和siABHD11-AS1+miR-133a inhibitor+siEIF4a1組(轉(zhuǎn)染lncRNA ABHD11-AS1 siRNA 24 h后再轉(zhuǎn)染miR-133a inhibitor 24 h后,再轉(zhuǎn)染EIF4A1 siRNA),使用Lipofectamine 2000試劑盒轉(zhuǎn)染lncRNA ABHD11-AS1 siRNA、EIF4A1 siRNA、Negative Control,使用Effectene Transfection Reagent試劑盒轉(zhuǎn)染miR-133a inhibitor,轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。Negative Control序列為(正向)5′-CAGAACGGGUCUAUACUUG-3′、(反向)5′-CAAGGUACCUACGGCAGU-3′;lncRNA ABHD11-AS1 siRNA序列為(正向)5′-CGUAAGCGUUCAUUAAGGC-3′、(反向)5′-CAAGGUGCGAUCUUAAUGC-3′;EIF4a1 siRNA序列為5′-CUGGCCGUGUGUUUGAUAU-3′;miR-133a inhibitor序列為5′-CAGCUGGUUGAAGGGGACCAAA-3′。

    1.4 實時熒光定量PCR實驗 分別將HT-29、SW480、DLD-1、HCT116、LOVO、SW620、FHC細(xì)胞,以及NC組和siABHD11-AS1組HT-29細(xì)胞接種至6孔板中,設(shè)置5個復(fù)孔,其中將轉(zhuǎn)染24 h后的HT-29細(xì)胞培養(yǎng)至匯合率達(dá)80%~90%。按照TRIzol 試劑說明書的步驟提取細(xì)胞的總RNA,使用核酸定量儀(Thermo Scientific公司,型號:NanoDrop One)檢測總RNA含量。參照PrimeScriptTM試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,全程冰浴操作,設(shè)置反應(yīng)條件為 37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s,4 ℃保存反應(yīng)產(chǎn)物用于后續(xù)實驗操作。lncRNA的實時熒光定量PCR實驗操作參照PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix試劑盒說明書,以GAPDH作為內(nèi)參,反應(yīng)體系為包括PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix 10 μL、上游和下游各1 μL、DNA模板1 μL、滅菌水7 μL。反應(yīng)條件為:50 ℃ 2 min; 95 ℃ 2 min、95 ℃ 15 s,40個循環(huán);55 ℃ 15 s;72 ℃ 1 min。miR-133a的實時熒光定量PCR實驗操作參照EvaGreen miRNA qPCR Master Mix試劑盒說明書,以U6作為內(nèi)參,反應(yīng)體系為EvaGreen miRNA Master Mix 10 μL、上游和下游引物各0.6 μL、DNA模板0.5 μL、滅菌水8.3 μL。反應(yīng)條件為:96 ℃ 6 min; 94 ℃ 15 s、65 ℃ 45 s,60個循環(huán)。實驗重復(fù)3次,引物序列如表1。

    表1 ABHD11-AS1、GAPDH、miR-133a、U6的引物序列

    1.5 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?根據(jù)miRcode數(shù)據(jù)庫(http://www.mircode.org/)并參考相關(guān)文獻(xiàn)[9],預(yù)測ABHD11-AS1與miR-133a的結(jié)合位點,設(shè)計野生型和突變型的ABHD11-AS1的3′非翻譯區(qū)-熒光素酶基因表達(dá)質(zhì)粒(即WT-ABHD11-AS1和MUT-ABHD11-AS1),使用Lipofectamine 2000試劑盒將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞,培養(yǎng)24 h后,使用Effectene Transfection Reagent試劑盒分別將miR-133a mimic、miR-NC轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞,轉(zhuǎn)染24 h后,根據(jù)雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書檢測各組細(xì)胞熒光強(qiáng)度,實驗重復(fù)3次。

    根據(jù)TargetScan數(shù)據(jù)庫(https://www.targetscan.org/vert_80/)和參考相關(guān)文獻(xiàn)[10],預(yù)測miR-133a和EIF4A1的結(jié)合位點,設(shè)計野生型和突變型的EIF4A1的3′非翻譯區(qū)-熒光素酶基因表達(dá)質(zhì)粒(即WT-EIF4A1和MUT-EIF4A1),使用Lipofectamine 2000試劑盒將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞,培養(yǎng)24 h后,使用Effectene Transfection Reagent試劑盒分別將miR-133a mimic、miR-NC轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞,轉(zhuǎn)染24 h后,根據(jù)雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書檢測各組細(xì)胞熒光強(qiáng)度。實驗重復(fù)3次。

    1.6 Western blot實驗 取轉(zhuǎn)染24 h后的NC組、siABHD11-AS1組、miR-133a inhibitor組、siABHD11-AS1+miR-133a inhibitor組HT-29細(xì)胞,加入200 μL RIPA蛋白裂解液,4 ℃條件下裂解30 min,然后在4 ℃下12 000 r/min離心10 min,收集上清為總蛋白,使用二喹啉甲酸蛋白定量法測定總蛋白濃度。取10 μg蛋白溶液進(jìn)行SDS-PAGE,蛋白分離后轉(zhuǎn)膜,使用PVDF膜封閉2 h后,然后與EIF4A1一抗(1 ∶1 000)、GAPDH(1 ∶5 000)4 ℃孵育過夜,使用TBST洗膜后加入二抗(1 ∶1 000)室溫孵育1.5 h,使用TBST清洗PVDF膜后,使用ECL試劑盒配置發(fā)光液,并將PVDF膜浸入發(fā)光液中反應(yīng)30 s,曝光并拍照,以GAPDH為內(nèi)參,用ImageJ軟件對條帶灰度值進(jìn)行半定量分析。實驗重復(fù)3次。

    1.7 細(xì)胞增殖實驗 使用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力。取轉(zhuǎn)染24 h后的NC組、siABHD11-AS1組、siABHD11-AS1+miR-133a inhibitor組、siABHD11-AS1+miR-133a inhibitor+siEIF4A1組TH-29細(xì)胞,使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋至5×104個/mL,將HT-29細(xì)胞接種至96孔板,100 μL/孔,每組3個復(fù)孔,37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng),設(shè)置0 h、24 h、48 h、72 h時間點對應(yīng)的96孔板,在各時間點取出對應(yīng)的96孔板,每孔加入10 μL CCK-8溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,使用酶標(biāo)儀(Molecular Devices公司,型號:SpectraMax M5)檢測各孔450 nm處的吸光度值。實驗重復(fù)3次。

    1.8 細(xì)胞遷移和侵襲實驗 使用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋NC組、siABHD11-AS1組、siABHD11-AS1+miR-133a inhibitor組、siABHD11-AS1+miR-133a inhibitor+siEIF4A1組的HT-29細(xì)胞至1×105個/mL,取100 μL細(xì)胞懸液接種于Transwel小室中用于檢測細(xì)胞遷移,接種于鋪含有50 μL Matrigel的Transwell小室中用于檢測細(xì)胞侵襲,每孔1×104個細(xì)胞,每孔再加入100 μL RPMI-1640培養(yǎng)基,每組3個復(fù)孔,將小室放置于24孔板中,24孔板每孔加入600 μL含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基,并將上述24孔板轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,小室底部用PBS清洗后用無水乙醇固定30 min,然后將小室倒扣,于底部滴加結(jié)晶紫染色10 min,清洗后晾干,于顯微鏡下觀察拍照并計數(shù)。實驗重復(fù)3次。

    1.9 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以(x±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗,兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 正常結(jié)直腸黏膜細(xì)胞與人結(jié)直腸癌細(xì)胞中ABHD11-AS1表達(dá)量的比較 與正常結(jié)直腸黏膜細(xì)胞FHC相比,人結(jié)直腸癌細(xì)胞HT-29、SW480、DLD-1、HCT116、LOVO、SW620的ABHD11-AS1表達(dá)量均升高,且HT-29細(xì)胞的ABHD11-AS1表達(dá)量最高(均P<0.05),因此取HT-29細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。siABHD11-AS1組HT-29細(xì)胞的ABHD11-AS1表達(dá)量低于NC組(P<0.05),提示轉(zhuǎn)染siABHD11-AS1可抑制TH-29細(xì)胞中ABHD11-AS1的表達(dá),可進(jìn)行后續(xù)研究。見表1、表2。

    表1 正常結(jié)直腸黏膜細(xì)胞與人結(jié)直腸癌細(xì)胞中ABHD11-AS1 mRNA相對表達(dá)量的比較(x±s)

    表2 NC組和siABHD11-AS1組HT29細(xì)胞中ABHD11-AS1相對表達(dá)量的比較(x±s)

    2.2 ABHD11-AS1與miR-133a的靶向關(guān)系 ABHD11-AS1與miR-133a的結(jié)合位點結(jié)果如圖1所示。雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染MUT-ABHD11-AS1+miR-NC的細(xì)胞和轉(zhuǎn)染MUT-ABHD11-AS1+miR-133a mimic的細(xì)胞的相對熒光強(qiáng)度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),而轉(zhuǎn)染W(wǎng)T- ABHD11-AS1+miR-133a mimic的細(xì)胞相對熒光強(qiáng)度低于轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-ABHD11-AS1+miR-NC的細(xì)胞(P<0.05),表明ABHD11-AS1可與miR-133a結(jié)合,見表3。siABHD11-AS1組HT-29細(xì)胞中miR-133a表達(dá)量高于NC組(P<0.05),見表4。

    圖1 ABHD11-AS1和miR-133a的結(jié)合位點

    表3 ABHD11-AS1與miR-133a靶向關(guān)系的雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果(x±s)

    表4 NC組和siABHD11-AS1組HT29細(xì)胞miR-133a相對表達(dá)量的比較(x±s)

    2.3 EIF4A1與miR-133a的靶向關(guān)系 miR-133a和EIF4A1的結(jié)合位點如圖2所示。雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染MUT- EIF4A1+miR-NC的細(xì)胞和轉(zhuǎn)染MUT- EIF4A1+miR-133a mimic的細(xì)胞的相對熒光強(qiáng)度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),但轉(zhuǎn)染W(wǎng)T- EIF4A1+miR-133a mimic的細(xì)胞相對熒光強(qiáng)度低于轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-EIF4A1+miR-NC的細(xì)胞(P<0.05),說明EIF4A1為miR-133a的靶基因,見表5。

    圖2 miR-133a和EIF4A1的結(jié)合位點

    表5 EIF4A1與miR-133a靶向關(guān)系的雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果(x±s)

    2.4 各組HT-29細(xì)胞EIF4A1蛋白表達(dá)量的比較 Western blot檢測結(jié)果顯示,miR-133a inhibitor組HT-29細(xì)胞EIF4A1蛋白表達(dá)量高于NC組(P<0.05)。siABHD11-AS1組HT-29細(xì)胞EIF4A1蛋白表達(dá)量低于NC組,而siABHD11-AS1+miR-133a inhibitor組HT-29細(xì)胞的EIF4A1蛋白表達(dá)量高于siABHD11-AS1組(均P<0.05)。見圖3、表6、表7。

    圖3 各組HT-29細(xì)胞EIF4A1蛋白的表達(dá)情況

    表6 NC組和miR-133a inhibitor組HT-29細(xì)胞中EIF4A1蛋白相對表達(dá)量的比較(x±s)

    表7 NC組、siABHD11-AS1組和siABHD11-AS1+miR-133a inhibitor組HT-29細(xì)胞EIF4A1蛋白相對表達(dá)量的比較(x±s)

    2.5 各組HT-29細(xì)胞增殖能力的比較 CCK-8檢測結(jié)果顯示,干預(yù)24 h、48 h、72 h后,siABHD11-AS1組HT-29細(xì)胞吸光度值低于NC組,siABHD11-AS1+miR-133a inhibitor組HT-29細(xì)胞吸光度值均高于siABHD11-AS1組,而siABHD11-AS1+miR-133a inhibitor+siEIF4A1組HT-29細(xì)胞吸光度值均低于siABHD11-AS1+miR-133a inhibitor組(均P<0.05)。見表8。

    表8 各組HT29細(xì)胞吸光度值的比較(x±s)

    2.6 各組HT-29細(xì)胞遷移和侵襲能力的比較 相較于NC組,siABHD11-AS1組HT-29細(xì)胞的遷移數(shù)和侵襲數(shù)均減少,siABHD11-AS1+miR-133a inhibitor組HT-29細(xì)胞的遷移數(shù)和侵襲數(shù)均多于siABHD11-AS1組,而siABHD11-AS1+miR-133a inhibitor+siEIF4A1組HT-29細(xì)胞的遷移數(shù)和侵襲數(shù)均少于siABHD11-AS1+miR-133a inhibitor組(均P<0.05)。見圖4、表9。

    圖4 各組HT29細(xì)胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)的比較(×20)

    表9 各組HT29細(xì)胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)的比較(x±s)

    3 討 論

    目前,結(jié)直腸癌主要的治療方法有手術(shù)治療、化療和放療。雖然近幾年來結(jié)直腸癌患者的預(yù)后不斷得到改善,治療后患者的生存率可提高至60%左右,但是由于結(jié)直腸癌的早期病理特征不明顯,患者在確診時即已處于中晚期,錯過了手術(shù)治療的最佳時期;同時,約20%的患者在確診時即出現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移,無法進(jìn)行手術(shù)治療;此外,手術(shù)治療后患者5年內(nèi)腫瘤復(fù)發(fā)率高達(dá)30%,化療和放療雖然可用于轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的患者,但是耐藥等問題嚴(yán)重影響治療效果[11-12]。因此,深入研究結(jié)直腸癌生長和轉(zhuǎn)移的機(jī)制,發(fā)現(xiàn)更多可用于結(jié)直腸癌診斷和治療的生物標(biāo)志物,對于改善結(jié)直腸癌患者的預(yù)后具有重要意義。

    隨著基因芯片和基因測序技術(shù)的發(fā)展,越來越多的非編碼RNA被發(fā)現(xiàn)具有調(diào)控腫瘤生長、轉(zhuǎn)移、耐藥、免疫逃逸等病理進(jìn)程的生物學(xué)功能。其中,lncRNA是一類長度大于200nt的非編碼RNA,并且lncRNA能夠參與調(diào)控機(jī)體的多種生物學(xué)功能,但調(diào)控機(jī)制復(fù)雜,其主要是作為支架或向?qū)д{(diào)控蛋白與基因之間相互作用,通過“海綿”的方式與miRNA相結(jié)合,作為增強(qiáng)子調(diào)控其下游靶基因的轉(zhuǎn)錄等。已有研究報告,在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中,lncRNA可調(diào)控多種腫瘤的增殖、侵襲、遷移等[13-14]。在結(jié)直腸癌中,lncRNA TINCR可通過調(diào)控miR-107/CD36信號軸而影響結(jié)直腸癌的增殖和凋亡[15-16],lncRNA cCSC1可通過調(diào)控miR-124-3p/CD44軸而促進(jìn)結(jié)腸癌的增殖[17]。因此,lncRNA有望成為結(jié)直腸癌的新型診斷標(biāo)志物及治療靶點。lncRNA ABHD11-AS1已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。例如,ABHD11-AS1通過調(diào)控細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)以促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖與遷移[18];ABHD11-AS1可作為早期診斷胰腺癌的指標(biāo)[19];ABHD11-AS1通過調(diào)控miR-1301-3p/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3軸和磷酸肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信號通路,從而促進(jìn)甲狀腺乳頭狀癌的進(jìn)展[20];ABHD11-AS1通過調(diào)控miR-199a-5p/溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族1成員5軸而影響甲狀腺乳頭狀癌的進(jìn)程[21]。但是,有關(guān)ABHD11-AS1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況,以及其對結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的影響的研究較少,因此,本研究探究ABHD11-AS1對結(jié)直腸癌生長和轉(zhuǎn)移的影響及可能調(diào)控機(jī)制。

    本研究結(jié)果顯示,ABHD11-AS1高表達(dá)于結(jié)直腸癌細(xì)胞系HT-29、SW480、DLD-1、HCT116、LOVO、SW620(均P<0.05),這提示ABHD11-AS1可能對結(jié)直腸癌的發(fā)生具有調(diào)控作用。此外,通過轉(zhuǎn)染siRNA抑制HT-29細(xì)胞中ABHD11-AS1的表達(dá)后,結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力均下降(均P<0.05),說明ABHD11-AS1具有調(diào)控腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的功能。lncRNA的主要調(diào)控機(jī)制為,與miRNA相結(jié)合后作為增強(qiáng)子調(diào)控其下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。本研究通過數(shù)據(jù)庫預(yù)測及雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C了ABHD11-AS1可與miR-133a結(jié)合。Wang等[22]的研究表明,miR-133a的表達(dá)抑制與結(jié)直腸癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān);Dong等[23]亦發(fā)現(xiàn)miR-133a可作為結(jié)直腸癌的抑制因子。本研究中,siABHD11-AS1組HT-29細(xì)胞中miR-133a表達(dá)高于NC組(P<0.05),即抑制ABHD11-AS1的表達(dá)可上調(diào)HT-29細(xì)胞中miR-133a的表達(dá)。因此,我們推測ABHD11-AS1或可通過抑制miR-133a的表達(dá)來促進(jìn)結(jié)直腸癌的病理進(jìn)程。在本研究中,我們通過轉(zhuǎn)染siRNA抑制HT-29細(xì)胞中ABHD11-AS1的表達(dá)后再抑制miR-133a的表達(dá),發(fā)現(xiàn)HT-29細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力增強(qiáng),這進(jìn)一步表明ABHD11-AS1可通過調(diào)控miR-133a的表達(dá)而影響結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。

    miRNA是一類長度為19~24 nt的非編碼單鏈RNA,其通過堿基互補(bǔ)配對的方式與靶基因的3′-非翻譯區(qū)部分或完全互補(bǔ),剪切靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或抑制轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的翻譯,從而起到在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因表達(dá)的作用[24]。本研究通過數(shù)據(jù)庫預(yù)測了miR-133a和EIF4A1的結(jié)合位點,然后通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C了EIF4A1為miR-133a的靶基因。EIF4A1亦與腫瘤發(fā)生和進(jìn)展密切相關(guān),例如EIF4A1的表達(dá)與乳腺癌中的惡性程度和不良預(yù)后呈正相關(guān)[25]。本研究結(jié)果顯示,抑制miR-133a后HT-29細(xì)胞中的EIF4A1蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05);抑制ABHD11-AS1表達(dá)后HT-29細(xì)胞中的EIF4A1蛋白表達(dá)下調(diào),但先抑制ABHD11-AS1表達(dá)再抑制miR-133a的表達(dá),HT-29細(xì)胞中的EIF4A1表達(dá)反而上調(diào)(P<0.05)。這表明ABHD11-AS1可調(diào)控miR-133a/EIF4A1信號軸,進(jìn)而調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。

    綜上所述,ABHD11-AS1在結(jié)直腸癌細(xì)胞中呈高表達(dá),并且抑制ABHD11-AS1后,結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力均顯著下降, 其可能通過調(diào)控miR-133a/EIF4A1信號軸發(fā)揮作用。但是ABHD11-AS1在結(jié)直腸癌患者腫瘤組織中的表達(dá),以及ABHD11-AS1是否可作為結(jié)直腸癌診斷和治療的新靶點,還需要進(jìn)一步探究。

    (致謝:感謝廈門醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部李良華老師在實驗上給予的幫助)

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