補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療脊髓外傷性截癱的作用機(jī)制*

郭德華，吳成林，許 洋，張國(guó)福

（1江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西南昌 330004；2江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江西南昌 330006）

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）屬于中醫(yī)理論“體惰”、“痿癥”的范疇［1］，發(fā)生率在我國(guó)乃至全世界呈明顯上升趨勢(shì)［2］。SCI 的病理機(jī)制極其復(fù)雜，其治療及康復(fù)是醫(yī)學(xué)界的一大難點(diǎn)［3］。中醫(yī)藥治療SCI發(fā)揮了中醫(yī)整體觀念的優(yōu)勢(shì)，能通過(guò)多路徑、多層次和多靶位的機(jī)制，促進(jìn)受損脊髓微環(huán)境的修復(fù)［4］。補(bǔ)陽(yáng)還五湯（Buyang-Huanwu decoction，BYHWD）源自清代王清任《醫(yī)林改錯(cuò)·卷下·癱痿論》，是被用于改善SCI 后神經(jīng)功能的經(jīng)典方［5］，但其作用機(jī)制卻一直研究甚少。JAK2/STAT3 和PI3K/AKT 信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)傳遞途徑，與細(xì)胞凋亡和神經(jīng)再生休戚相關(guān)［6］。有研究表明，BYHWD 可能激 活JAK2/STAT3 和PI3K/AKT 信號(hào)途徑，抑制神經(jīng)元凋亡，緩解神經(jīng)損傷［7］。另外，本研究前期研究發(fā)現(xiàn)，BYHWD 促進(jìn)SCI 后運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)［8-9］；因此，我們猜想BYHWD 可通過(guò)激活PI3K/AKT 和JAK2/STAT3雙信號(hào)通路促進(jìn)脊髓功能恢復(fù)，從而達(dá)到治療SCI的作用。

材料和方法

1 試劑與儀器

BYHWD 組成：桃仁10 g，川芎10 g，當(dāng)歸10 g，生黃芪60 g，赤芍10 g，地龍10 g，紅花10 g。以上飲片均購(gòu)于江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房，均為江西江中中藥飲片有限公司產(chǎn)品，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥庫(kù)李曉芳副主任中藥師按照2015 版《中國(guó)藥典》對(duì)中藥復(fù)方BYHWD 中不同產(chǎn)地、批次每味藥材進(jìn)行水分、總灰度、浸出物、含量測(cè)定、定性鑒別等藥物質(zhì)控相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行鑒定，均符合2015 版《中國(guó)藥典》質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。按照中藥煎藥規(guī)定，將藥湯濃縮至200 mL 備用，相當(dāng)于臨床等效藥物濃度0.6 g/mL［10］。5-溴-2'-脫氧尿嘧啶核苷（5-bromo-2'-deoxyuridine，BrdU）、鼠抗人BrdU 單克隆抗體和DAB 顯色試劑盒（北京中山生物技術(shù)有限公司）；山羊抗兔β-actin、p-AKT、p-JAK2、p-STAT3、gp130 和白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）多克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司）；免疫組化試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）；熒光顯微鏡和倒置顯微鏡（OLYMPUS）。

2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

SD 大鼠27只，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)為SCXK（湘）2019-0004，雌性不限，8 周齡，200～250 g，飼養(yǎng)于潔凈環(huán)境中，溫度（23±2）℃，濕度40%～70%，自由飲食攝水，12 h 光暗交替，所有動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后開(kāi)始正式實(shí)驗(yàn)。將27只大鼠分為假手術(shù)（sham）組9 只和造模組18 只，造模成功后隨機(jī)分為2 組：模型（model）組和BYHWD治療組（BYHWD 組）。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查通過(guò)［許可證號(hào)：SYXK（贛）2017-0004］。

3 主要方法

3.1 SCI 模型的建立 所有動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后開(kāi)始正式實(shí)驗(yàn)，造模采用Allen 重物打擊法制作SCI模型，保持硬膜完整性，造成大鼠脊髓重度損傷致完全性截癱。SCI 造模成功的標(biāo)志：在Allen 裝置撞擊脊髓的瞬間，動(dòng)物身體發(fā)生抖動(dòng)，大鼠雙下肢快速產(chǎn)生回縮和彈動(dòng)動(dòng)作，尾巴瞬間翹起并迅速倒下，受損脊髓局部表面呈淤紫色，術(shù)后大鼠雙下肢出現(xiàn)完全癱瘓。術(shù)后將動(dòng)物置于保溫墊上直至蘇醒。假手術(shù)組大鼠只暴露其第10 胸椎段脊髓，不撞擊該段脊髓，依次縫合肌肉、皮膚，關(guān)閉切口。

3.2 術(shù)后給藥及護(hù)理 假手術(shù)組及模型組行生理鹽水灌胃；BYHWD 組按照每次25 g/kg［10］（該劑量為課題組前期實(shí)驗(yàn)得出的最佳實(shí)驗(yàn)劑量）進(jìn)行灌胃給藥。造模結(jié)束后，將所有大鼠均置于25 ℃的動(dòng)物房?jī)?nèi)統(tǒng)一飼養(yǎng)，將墊有鋸末的平板置于大鼠籠中，以防肢體或骶部壓瘡及吸收排尿，并及時(shí)更換。手術(shù)結(jié)束后人工排尿，每天2次，各大鼠均連續(xù)排尿2周，直至大鼠恢復(fù)自主排尿時(shí)停止。

3.3 行為學(xué)觀察 采用雙盲、雙人獨(dú)立觀察記錄，在術(shù)后1、3、5 周進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分觀察，采用改良Tarlov 評(píng)分和斜板試驗(yàn)。改良Tarlov 評(píng)分：0 和1 分，沒(méi)有自主性的運(yùn)動(dòng)，只限于非反射性的髖、膝關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)；2 分，髖、膝、踝三個(gè)關(guān)節(jié)的肢體運(yùn)動(dòng)；3 分，行走時(shí)可主動(dòng)支撐體重和不協(xié)調(diào)步態(tài)或偶爾出現(xiàn)協(xié)調(diào)步態(tài)；4 分，活動(dòng)時(shí)呈現(xiàn)前后肢協(xié)調(diào)步態(tài)，行動(dòng)時(shí)有趾間關(guān)節(jié)的肢體運(yùn)動(dòng)；5 分，正常步態(tài)。斜板試驗(yàn)：在長(zhǎng)方形木板上，將大鼠頭部朝前，身體縱軸與傾斜板縱軸垂直放置，逐步增加傾斜板與水平面之間的夾角，使大鼠在原有位置上剛好保持5 s，這一夾角即為傾斜平面臨界角度。記錄各組大鼠傾斜平面臨界角度。

3.4 免疫組化檢測(cè)脊髓組織中BrdU 的水平 麻醉大鼠并開(kāi)胸，將損傷區(qū)的脊髓組織切取1.5 cm，用中性的甲醛溶液固定，石蠟包埋后制成3 μm 的切片，用免疫組化法檢測(cè)BrdU 細(xì)胞表達(dá)情況，于顯微鏡下觀察。用ImageJ軟件分析細(xì)胞BrdU吸光度。

3.5 Western blot 檢測(cè) 處死各組大鼠，取20 mg 脊髓組織，將在冰上研磨組織呈粉末狀，將裂解液加入到組織中，制成組織懸液后離心，對(duì)蛋白樣本總濃度進(jìn)行測(cè)定。轉(zhuǎn)移蛋白樣品至PVDF 膜，將入5%脫脂奶粉溶液，封閉樣品2 h。蛋白樣品中分別加入Ⅰ抗（p-AKT、p-JAK2、p-STAT3、gp130、IL-6 和內(nèi)參照βactin 抗體），孵育后洗滌蛋白樣品，將Ⅱ抗（1∶2 000）加入蛋白樣品中，室溫孵育1 h。用ECL 液顯色，ImageJ軟件觀察條帶灰度值并計(jì)算蛋白表達(dá)。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 SCI大鼠治療前后行為學(xué)結(jié)果

與假手術(shù)組相比，模型組中改良Tarlov評(píng)分和斜板試驗(yàn)傾斜平面臨界角度均顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，BYHWD 干預(yù)后改良Tarlov 評(píng)分和斜板試驗(yàn)傾斜平面臨界角度均顯著上升（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

Figure 1.Behavioral results of rats with spinal cord injury before and after treatment.A：modified Tarlov score；B：inclined angle of inclined plate test.Mean±SD. n=9.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs model group.圖1 脊髓損傷大鼠治療前后行為學(xué)結(jié)果

2 免疫組化檢測(cè)大鼠脊髓組織中BrdU的水平

與假手術(shù)組相比，模型組中BrdU 含量顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，BYHWD 治療組中BrdU含量顯著上升（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

3 Western blot 法檢測(cè)大鼠脊髓組織中p-JAK2、p-STAT3、p-AKT、gp130及IL-6蛋白水平

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠脊髓組織中p-JAK2、p-STAT3、p-AKT、gp130 及IL-6 蛋白水平均顯著上調(diào)（P＜0.05）；與模型組相比，BYHWD 治療組大鼠脊髓組織中p-JAK2、p-STAT3、p-AKT、gp130 及IL-6蛋白水平均顯著下調(diào)（P＜0.05），見(jiàn)圖3。

討 論

研究表明，中醫(yī)藥在減輕SCI 癥狀，緩解SCI 并發(fā)癥等方面發(fā)揮重要作用［11-12］?，F(xiàn)代中醫(yī)認(rèn)為SCI是因?yàn)橥饬p傷督脈，致使氣亂血逆，瘀阻經(jīng)絡(luò)，氣血不能溫煦濡養(yǎng)肢體所致。BYHWD 重用補(bǔ)氣藥與少量活血藥相伍，使氣旺血行以治本，祛瘀通絡(luò)以治標(biāo)，標(biāo)本兼顧；且補(bǔ)氣而不壅滯，活血又不傷正。合而用之，則氣旺、瘀消、絡(luò)通，諸癥向愈。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，BYHWD 干預(yù)后SCI 大鼠的改良Tarlov 評(píng)分及斜板試驗(yàn)傾斜平面臨界角度明顯增加，恢復(fù)了SCI 大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能，證明了BYHWD 對(duì)SCI 具有治療作用。鑒于BYHWD 在實(shí)驗(yàn)研究［8-10，13］干預(yù)中的療效確切，本研究未設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組。

IL-6 作為炎癥細(xì)胞分化的重要影響因子，而gp130作為IL-6等多種細(xì)胞因子的信號(hào)傳導(dǎo)鏈，參與了神經(jīng)神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)過(guò)程及急性SCI 的繼發(fā)性損害［14-16］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SCI 后gp130 和IL-6 的蛋白表達(dá)水平顯著上升，BYHWD 干預(yù)后gp130 和IL-6的蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)。這表明大鼠SCI 后發(fā)生嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，而B(niǎo)YHWD 能夠緩解SCI后的炎癥反應(yīng)。究其原因，正常情況下，神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)IL-6 水平表達(dá)比較低，但一定濃度的IL-6 是維持神經(jīng)細(xì)胞正常生長(zhǎng)和生存的基礎(chǔ)，而且還會(huì)影響神經(jīng)細(xì)胞的分化、生長(zhǎng)和生存。IL-6 對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響是雙向的，不僅可以促進(jìn)激活的巨噬細(xì)胞分化和浸潤(rùn)，還可以上調(diào)其他細(xì)胞因子的表達(dá)，從而加強(qiáng)炎癥反應(yīng)。相關(guān)研究表明，IL-6 過(guò)度表達(dá)引起脊髓繼發(fā)性損傷的同時(shí)也促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化［19］。BYHWD 可能通過(guò)抑制SCI 后IL-6 過(guò)度表達(dá)，調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞的分化，從而減輕SCI。

Figure 2.The BrdU positive cells in injured spinal cord tissues were detected by immunohistochemistry（×200）.Mean±SD. n=9.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs model group.圖2 免疫組化檢測(cè)各組受損脊髓組織BrdU陽(yáng)性細(xì)胞水平

目前涉及BYHWD 的信號(hào)通路有多種，其中PI3K/AKT 和JAK2/STST3 信號(hào)通路均介導(dǎo)SCI 的發(fā)生發(fā)展。目前研究發(fā)現(xiàn)，JAK2/STAT3、PI3K/AKT 信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)神經(jīng)突生長(zhǎng)和神經(jīng)元遷移，在細(xì)胞的增殖、凋亡、分化和免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要調(diào)控作用［17-19］，是近年來(lái)備受關(guān)注的細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。因此抑制JAK2/STAT3 和PI3K/AKT 信號(hào)通路被認(rèn)為可能是治療SCI 的方法之一［20-21］。多功能細(xì)胞因子IL-6 在正常腦組織中表達(dá)較少，在神經(jīng)疾病腦組織中高表達(dá)，可見(jiàn)IL-6 可介導(dǎo)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的神經(jīng)元修復(fù)；在神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)IL-6 可激活JAK2/STAT3信號(hào)通路，進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)作用；gp130 作為IL-6 等多種細(xì)胞因子受體中的共用信號(hào)傳導(dǎo)鏈，本身不具有酪氨酸激酶活性，但可通過(guò)介導(dǎo)IL-6 進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。因此，我們猜想JAK2/STAT3 和PI3K/AKT 是2條獨(dú)立的信號(hào)通路，BYHWD 可能介導(dǎo)IL-6家族共用信號(hào)傳導(dǎo)亞單位gp130下游的信號(hào)激活傳導(dǎo)雙通路。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SCI后損傷中心區(qū)域的脊髓組織中p-JAK2、p-STAT3 和p-AKT 的蛋白水平顯著上升，BYHWD 干預(yù)后p-JAK2、p-STAT3 和p-AKT 的蛋白水平顯著下調(diào)。這表明大鼠SCI 可能激活了JAK2/STAT3 和PI3K/AKT 雙信號(hào)通路，而B(niǎo)YHWD 抑 制JAK2/STAT3 和PI3K/AKT 雙信號(hào)通路的激活，從而影響SCI 的相關(guān)病理過(guò)程。我們認(rèn)為BYHWD 減輕SCI 是通過(guò)抑制PI3K/AKT 和JAK2/STAT3 信號(hào)通路磷酸化起作用的。

綜上所述，BYHWD 能夠減輕SCI，降低受損脊髓組織中g(shù)p130、IL-6、p-JAK2、p-STAT3 及p-AKT 蛋白水平，促進(jìn)大鼠脊髓外傷性截癱后運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。其作用機(jī)制可能與抑制JAK2/STAT3 和PI3K/AKT 雙信號(hào)通路及減輕SCI 后損傷中心區(qū)域的炎癥反應(yīng)有關(guān)。考慮中醫(yī)藥治療SCI具有多層次、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，我們將進(jìn)一步分析BYHWD 及其提取物對(duì)JAK2/STAT3 和PI3K/AKT 信號(hào)通路及脊髓相關(guān)細(xì)胞的影響，并深入探究其可能的作用機(jī)制。

Figure 3.Western blot was used to detect the protein levels of p-JAK2，p-STAT3，p-AKT，gp130 and IL-6 in injured spinal cord tissues at different time points.A：1 week；B：3 weeks；C：5 weeks.Mean±SD. n=9.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs model group.圖3 Western blot檢測(cè)各時(shí)點(diǎn)受損脊髓組織中p-JAK2、p-STAT3、p-AKT、gp130及IL-6蛋白水平