血小板與中性粒細胞相互作用在血管病變中的研究進展*

冶 怡，格日力，烏仁塔娜

（青海大學(xué)高原醫(yī)學(xué)研究中心，高原醫(yī)學(xué)教育部重點實驗室，青海省高原醫(yī)學(xué)應(yīng)用基礎(chǔ)重點實驗室，青海-猶他高原醫(yī)學(xué)聯(lián)合重點實驗室，青海西寧 810001）

血小板是止、凝血與血栓形成過程中的核心成分。而中性粒細胞是人體含量最多的天然免疫細胞，是固有免疫防御的第一道防線。二者胞膜或胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和細胞因子極為豐富，通過受體介導(dǎo)的激活和釋放易于對各種刺激作出快速反應(yīng)。近年來，在多種血管病變中觀察到血小板與中性粒細胞的同時激活，包括動脈粥樣硬化，動、靜脈免疫性血栓形成，以及肺動脈高壓，二者共同作用驅(qū)動局部及全身的炎癥及免疫反應(yīng)，繼而影響心、腦血管事件的發(fā)生。本文就血小板與中性粒細胞通過配/受體的相互激活在上述疾病發(fā)生與發(fā)展中的作用進行綜述。

1 血小板與中性粒細胞相互作用方式

1.1 配/受體介導(dǎo)的直接作用 血小板活化依賴性溶酶體膜蛋白CD62P，即P-選擇素（P-selectin），通常儲存于血小板α 顆粒中，激活后則迅速表達于細胞表面，活化后血小板的P-選擇素可與中性粒細胞表達的P-選擇素糖蛋白配體1（P-selectin glycoprotein ligand-1，PSGL-1）結(jié)合，介導(dǎo)血小板-中性粒細胞相互作用，觸發(fā)中性粒細胞內(nèi)炎癥信號級聯(lián)反應(yīng)，激活中性粒細胞中的MAPK/ERK1/2 信號通路，產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS），促進NF-κB 活化及中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)（neutrophil extracellular traps，NETs）釋放，驅(qū)動炎癥反應(yīng)及血栓形成［1］。

此外，P-選擇素誘導(dǎo)中性粒細胞活化后促進中性粒細胞彈性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）和組織蛋白酶G 的分泌，同時二者又通過水解PSGL-1 蛋白末端片段下調(diào)中性粒細胞對血小板的黏附，從而形成負反饋調(diào)節(jié)，有效地平衡血小板與中性粒細胞間的相互作用［2］。

在血栓形成及炎癥狀態(tài)下，中性粒細胞表面的整合素CD11b/CD18［又稱巨噬細胞抗原1（macrophage antigen-1，Mac-1）］與血小板膜糖蛋白（glycoprotein，GP）Ibα 結(jié)合后以依賴于Akt 磷酸化的途徑驅(qū)動二者相互作用［3］。此外，Mac-1 不僅能夠與整合素αIIbβ3（GPIIb/IIIa）復(fù)合體結(jié)合，還通過結(jié)合血小板表面的第3 種受體——連接黏附分子3（junctional adhesion molecule-3，JAM-3）促進中性粒細胞聚集、彈性蛋白酶釋放、內(nèi)皮損傷、纖維蛋白沉積和血栓形成［4］。

活化的血小板通過與PSGL-1及Mac-1結(jié)合介導(dǎo)中性粒細胞向損傷部位的遷移［5］。此外，CD40 與CD40 配體（CD40 ligand，CD40L/CD154）［6］，淋巴細胞功能相關(guān)抗原1（lymphocyte function-associated antigen-1，LFA-1）與細胞間黏附分子2（intercellular adhesion molecule-2，ICAM-2）［7］，以及髓樣細胞觸發(fā)受體1（triggering receptor expressed on myeloid cells-1，TREM-1）與TREM-1L 也都能夠以配/受體直接結(jié)合的方式誘導(dǎo)下游級聯(lián)信號的相互激活，促使血小板與中性粒細胞相互作用［8-9］。例如，CD40/CD40L結(jié)合促進血小板活化并通過上調(diào)Mac-1 增強中性粒細胞的募集；LFA-1/ICAM-2 結(jié)合促進中性粒細胞與血小板的黏附；TREM-1/TREM1L 結(jié)合促進中性粒細胞ROS的產(chǎn)生、脫顆粒和NETs的釋放。

1.2 配/受體介導(dǎo)的間接作用 雖然不直接介導(dǎo)血小板-中性粒細胞相互作用，但許多配/受體與血小板活化有關(guān)，通過活化血小板，脫顆粒釋放相應(yīng)物質(zhì)進而促進其與中性粒細胞的相互激活。這些配/受體包括Toll 樣受體（Toll-like receptor，TLR）、補體受體C3aR、高遷移率族盒蛋白1（high mobility group box protein 1，HMGB1）、嘌呤能受體P2Y12 受體和趨化因子受體CX3CR1。

TLR 是一類能夠?qū)Σ≡w相關(guān)分子模式進行識別、結(jié)合，參與固有免疫防御的模式受體。Ren 等［10］首次通過研究血小板對循環(huán)腫瘤細胞的影響，明確血小板膜和胞漿表達的TLR4 能夠以ERK5-GPIIb/IIIa 整合素依賴性方式促進血小板與中性粒細胞的黏附，并誘導(dǎo)NETs 形成，從而促進腫瘤細胞的遠處轉(zhuǎn)移。

Sauter等［11］的研究表明，來源于血小板的補體受體C3aR 加劇了心肌梗死與缺血性腦卒中患者免疫性血栓形成和中性細胞介導(dǎo)的組織損傷。儲存在血小板α 顆粒中的趨化因子，如CCL5（C-C motif chemokine 5）/RANTES（regulated on activation，normal T cell expressed and secreted），引起急性肺損傷小鼠模型中的中性粒細胞滲出，從而導(dǎo)致進一步的組織損傷［12］。然而，阻斷心肌缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）模型中的CCL5，導(dǎo)致中性粒細胞募集與NETs 形成減少，從而顯著降低了I/R 后心肌梗死面積并保留了心功能［13］。

活化的血小板分泌的損傷相關(guān)分子模式——HMGB1 通過激活中性粒細胞膜上的晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（receptor for advanced glycation end products，RAGE），增強中性粒細胞的募集，引起免疫性血栓及NETs 形成［14］，而活化的中性粒細胞又能增強HMGB1表達，誘導(dǎo)血小板聚集。同樣，LL-37作為中性粒細胞衍生的cathelicidin 家族抗菌肽，具有直接激活血小板并促動脈血栓形成的作用［15］。Rayes 等［16］的研究表明，NE 增強組織蛋白酶G 誘導(dǎo)的血小板活化。

P2Y12 受體拮抗劑［17］的應(yīng)用能夠抑制中性粒細胞介導(dǎo)的血小板聚集和P-選擇素表達，減輕血小板與中性粒細胞的黏附和血小板依賴性ROS 的產(chǎn)生。因此，通過阻斷血小板P2Y12 受體可減少血小板與中性粒細胞的相互作用并減輕膿毒癥中的血栓炎癥。

趨化因子fractalkine 通過血小板表面表達的特異性受體CX3CR1 誘導(dǎo)血小板活化與黏附，而fractalkine/CX3CR1 軸的激活觸發(fā)中性粒細胞黏附到活化的內(nèi)皮，參與血管周圍炎癥乃至肺動脈重塑的病理過程［18］。

此外，在細胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）水平上也觀察到血小板與中性粒細胞的相互影響。血小板衍生的EVs 在膿毒癥［19］和登革熱病毒感染［20］中促進NETs 形成和促炎因子釋放，并且能夠?qū)⒄{(diào)節(jié)性RNA轉(zhuǎn)運到中性粒細胞，從而介導(dǎo)免疫識別［21］。

總之，血小板和中性粒細胞通過多種配/受體結(jié)合，趨化因子參與的信息傳遞，甚至EVs 介導(dǎo)的效應(yīng)相互作用，促進局部和全身水平的相互激活（圖1）。

2 血小板與中性粒細胞在血管病變中的相互作用

2.1 血小板與中性粒細胞在動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）中的相互作用 AS是指中等動脈或大動脈的動脈壁形成脂質(zhì)斑片狀沉積物，導(dǎo)致血流量減少甚至阻塞血液流出的一種疾病，是心肌梗死、缺血性心臟病和缺血性卒中發(fā)生的主要危險因素。

Figure 1.Mode of platelet-neutrophil interaction.PSGL-1：P-selectin glycoprotein ligand-1；GPIbα：glycoprotein Ibα；Mac-1：macrophage antigen-1；GPIIb/IIIa：glycoprotein IIb/IIIa；JAM-3：junctional adhesion molecules-3；CD40L：CD40 ligand；ICAM-2：intercellular adhesion molecule-2；LFA-1：lymphocyte function-associated antigen-1；TREM-1：triggering receptor expressed on myeloid cells-1；TREM-1L：TREM-1 ligand；5-HT：5-hydroxytryptamine；TLR4：Toll-like receptor 4；CCL5：chemokine C-C motif ligand 5；MPO：myeloperoxidase；NE：neutrophil elastase；ROS：reactive oxygen species；HMGB1：high mobility group box protein 1；RAGE：receptor for advanced glycation end products；EVs：extracellular vesicles；PNA：platelet-neutrophil aggregates；PNA：platelet-neutrophil aggregates；NETosis：the process of neutrophil extracellular trap formation.圖1 血小板與中性粒細胞的相互作用

Bakogiannis 首次提出血小板、白細胞與內(nèi)皮細胞三者相互作用導(dǎo)致AS 病變［22］和血栓形成［23］。趨化因子fractalkine 通過血小板表面表達的功能性fractalkine 受體（CX3CR1）誘導(dǎo)血小板活化和黏附，而fractalkine/CX3CR1 軸的激活觸發(fā)白細胞黏附到活化的內(nèi)皮，啟動AS 病變形成［24］。隨后，觀察到嗜酸性粒細胞可通過與血小板的相互作用促進AS 斑塊的形成和血栓形成，導(dǎo)致兩者相互激活［25］。在急、慢性冠狀動脈綜合征及頸動脈狹窄的患者中觀察到中性粒細胞和血小板增多以及血小板-中性粒細胞聚集體（platelet-neutrophil aggregates，PNA）增加［26］。目前已明確活動性AS 中P-選擇素與PSGL-1 相互作用促進PNA 的形成，并且在心血管疾病患者中升高的P-選擇素與主要不良心血管事件的風險呈正相關(guān)［27］。Gerdes 等［28］研究強調(diào)血小板通過CD40 刺激內(nèi)皮細胞與中性粒細胞的募集與活化，從而加劇AS，而CD40缺乏與AS病變減少有關(guān)。

此外，中性粒細胞對高斑塊負荷的AS 部位的黏附及募集與斑塊不穩(wěn)定、侵蝕和破裂有關(guān)；募集到斑塊中的活化中性粒細胞可通過NETs 形成加劇AS 形成與進展，并促進促炎性巨噬細胞表型，增加動脈內(nèi)膜損傷程度［29］。

因 此，P-選擇素/PSGL-1 和CD40/CD40L 促 進PNA 的形成，將其募集到AS 斑塊中，在AS 炎癥反應(yīng)早期，誘導(dǎo)內(nèi)皮功能障礙、促進泡沫細胞形成和炎癥反應(yīng)，加速AS 斑塊形成、發(fā)展；在AS 炎癥反應(yīng)后期，PNA 參與斑塊內(nèi)血管損傷、壞死核形成和纖維帽變薄，促進不穩(wěn)定斑塊破裂，并激活血小板，繼發(fā)血栓形成（圖2A）。

2.2 血小板與中性粒細胞在免疫性血栓形成中的相互作用 血栓性疾病是一類威脅人類健康的重大疾病，炎癥反應(yīng)是促進病理性血栓形成的重要因素。免疫性血栓形成的主要驅(qū)動因素是血小板和固有免疫細胞（主要是中性粒細胞、單核細胞與巨噬細胞）的相互作用，協(xié)同凝血系統(tǒng)與補體系統(tǒng)，共同構(gòu)建了一個連接炎癥和血栓形成的復(fù)雜過程。動脈免疫性血栓形成是AS 進展、斑塊糜爛及最終破裂的結(jié)果，主要由聚集呈珊瑚狀的血小板小梁構(gòu)成，其表面有許多中性粒細胞黏附，形成白細胞邊層，這些高度活化的血小板以Mac-1/GPIbα［30］和P-選擇素/PSGL-1［31］結(jié)合的方式募集白細胞，促進纖維蛋白（原）沉積并增強血栓穩(wěn)定性。Darbousset 等［32］利用血栓形成模型證實了中性粒細胞通過活化后表達的組織因子參與血小板誘導(dǎo)的動脈免疫性血栓形成。同樣地，Chrysanthopoulou等［33］在原發(fā)性高血壓患者及小鼠模型中證實中性粒細胞通過NETs 形成，激活血小板啟動凝血級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致血栓形成。血小板與中性粒細胞誘導(dǎo)形成的血栓加重心肌肥厚并惡化心力衰竭［34］。

此外，活化的血小板能大量釋放內(nèi)源性HMGB1，而HMGB1 蛋白通過TLR4-MyD88 軸直接引發(fā)血小板的聚集和活化，并通過中性粒細胞上的RAGE 促進NETs 形成，從而導(dǎo)致血小活化和血栓形成的級聯(lián)反應(yīng)［35］。

Dhanesha 等［36］通過建立骨髓細胞特異性的整合素α9 缺陷型小鼠α9fl/flLysMCre+，證實了中性粒細胞高表達的整合素α9β1 刺激血小板活化，而活化的血小板進而促進NETs 的釋放及動脈血栓形成。然而，通過藥物或基因敲除肽酰精氨酸脫亞氨酶4（peptidylarginine deiminase 4，PAD4）來阻斷血小板誘導(dǎo)的NETs形成，會減少動脈血栓形成［33］。

炎癥是導(dǎo)致免疫性靜脈血栓形成的主要因素，靜脈血栓形成過程中，內(nèi)皮炎癥反應(yīng)促進血小板以及單核細胞和中性粒細胞的迅速募集，形成PNA 和血小板-單核細胞聚集體（platelet-monocyte aggregates，PMA）［37］。同樣地，血小板與中性粒細胞誘導(dǎo)的靜脈血栓形成的潛在分子機制也涉及P-選擇素/PSGL-1相互作用，HMGB1誘導(dǎo)的血小板和中性粒細胞分別通過TLR4 和RAGE 激活，以及通過NETs 釋放［38］形成的免疫性血栓［39］；并且P-選擇素基因敲除、HMGB1 受體阻斷和抑制NETs 生成顯著減少了深靜脈血栓形成［40］。

因此，血小板與中性粒細胞中Mac-1/GPIbα、P-選擇素/PSGL-1、HMGB1/RAGE 和TLR4 的結(jié)合及PNA 與NETs 的形成等是血栓性疾病發(fā)病過程中的重要機制（圖2B），抑制上述作用機制，如阻斷NETs生成，能夠顯著減少血栓形成，防止疾病進展，為免疫性血栓形成，乃至心、腦血管事件的預(yù)防與治療提供新靶點。

2.3 血小板與中性粒細胞在肺動脈高壓（pulmonary hypertension，PH）中的相互作用 PH 是一種預(yù)后較差的惡性肺血管疾病，以肺血管阻力進行性升高和右心功能進行性衰竭為主要特征，其基本病理特征是肺動脈內(nèi)皮受損、血管重構(gòu)和原位血栓形成。越來越多的證據(jù)提示炎癥反應(yīng)在肺動脈高壓的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

中性粒細胞/淋巴細胞比值（neutrophil-to-lymphocyte ratio，NLR）是反映體內(nèi)免疫平衡失調(diào)和全身炎癥性反應(yīng)的潛在生物標志物。近年來研究表明其與心血管系統(tǒng)疾病，自身免疫性疾病、惡性腫瘤及新型冠狀病毒肺炎［41］等有關(guān)。在慢性血栓栓塞性肺動脈高壓［42］和特發(fā)性動脈型肺動脈高壓（idiopathic pulmonary arterial hypertension，IPAH）中，NLR 與肺血管阻力增加及臨床預(yù)后顯著相關(guān)［43］。此外，血小板/淋巴細胞比值（platelet-to-lymphocyte ratio，PLR）作為新近的預(yù)測指標，與炎癥及血栓前狀態(tài)顯著性相關(guān)。NLR 和PLR 在伴有PH 的紫紺型先天性心臟?。?4］及結(jié)節(jié)病［45］中顯著升高并與肺動脈收縮壓升高的嚴重程度及術(shù)后不良結(jié)局相關(guān)。PH 患者體內(nèi)血小板釋放的LIGHT 和sCD40L 可以激活中性粒細胞，并且生成大量炎癥介質(zhì)（如NE），可誘導(dǎo)內(nèi)皮損傷、平滑肌細胞增殖和肺動脈血栓形成［46］。

HMGB1/HMGB1 受 體（TLR4［47］和RAGE［48］）在IPAH 和低氧誘導(dǎo)的PH 中顯著升高，誘導(dǎo)肺動脈平滑肌細胞和肺動脈內(nèi)皮細胞的增殖，促進肺血管重塑，提示PH 發(fā)病機制中潛在的血小板與中性粒細胞的相互作用。

趨化因子fractalkine 與血小板特異性受體CX3CR1 結(jié)合后，刺激中性粒細胞活化，引起血管周圍炎癥，導(dǎo)致肺小動脈異常收縮、血管重塑及肺動脈壓力增高［18］。并且，中性粒細胞趨化因子CXCL4 和CCL5 在血小板特異性降低的PH 小鼠和中顯著降低。

此外，前列環(huán)素類似物（如依前列醇、曲前列素和伊洛前列素）在PH 中誘導(dǎo)血管舒張，并抑制血小板功能。G?secka 等［49］通過前瞻性研究觀察到PH 患者在規(guī)律服用前列環(huán)素類似物后血小板及白細胞來源的EVs 顯著減少，PNA 明顯降低，血栓延遲形成且血栓面積顯著降低［50］。

盡管對PH 疾病進展中血小板與中性粒細胞相互作用的研究開展較少，目前證據(jù)強調(diào)二者介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和血栓前狀態(tài)是PH 疾病進展的重要一環(huán)（圖2C）。

3 總結(jié)與展望

綜上所述，活化后的血小板內(nèi)可溶性蛋白及顆粒內(nèi)容物重新分布至膜上，使配/受體活性或表達增加，為細胞間結(jié)合奠定物質(zhì)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)；而活化的中性粒細胞也可表達大量細胞表面受體及配體，以驅(qū)動兩者間的相互作用，參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展。

然而，除了通過細胞膜表面多種配/受體的直接作用相結(jié)合而相互激活外，血小板與中性粒細胞還能夠通過趨化因子、黏附分子及NETs 形成等參與的信息傳遞，甚至細胞外囊泡介導(dǎo)的效應(yīng)互相作用，促進局部和全身水平的相互激活，從而介導(dǎo)復(fù)雜的生理與病理反應(yīng)，影響AS、免疫性血栓形成與PH 的發(fā)生發(fā)展。

由于血小板與中性粒細胞相互作用在多種血管病變中發(fā)揮重要作用，未來冠心病、腦卒中、血栓性疾病及肺動脈高壓的藥物治療或可以在抗栓、抗凝藥物基礎(chǔ)上加用P-選擇素單克隆抗體crizanlizumab、重組DNase酶Pulmozyme 等二者相互作用的拮抗劑，以緩解急、慢性血栓事件，改善患者生活質(zhì)量。

明確血小板與中性粒細胞相互作用是否存在其他信號通路，完善其分子標記和活化產(chǎn)物改變的意義，為臨床預(yù)防及治療心、腦血管疾病及血栓性疾病提供新的靶點與方向，為盡早判斷疾病轉(zhuǎn)歸以及預(yù)后提供參考資料。