脂肪源性干細(xì)胞來源外泌體在特發(fā)性肺纖維化中作用機(jī)制的研究進(jìn)展*

汪望佳，王 敏，李翅翅，張 丹△

（1溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，浙江溫州 325000；2溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院整形外科，浙江溫州 325000）

特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一種持續(xù)進(jìn)展的間質(zhì)性肺病，患者通常以進(jìn)行性呼吸困難和干咳為主要臨床癥狀，臨床確診后中位生存期僅為3～5 年［1］。IPF 的病因尚不明確，但研究證實(shí)持續(xù)的炎癥反應(yīng)及上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）過程與IPF 的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，應(yīng)用激素、免疫抑制劑及抗EMT過程的藥物在臨床上發(fā)揮了一定的治療效果，然而這些藥物的使用存在其局限性。目前最有效的治療手段仍是肺移植，卻受限于轉(zhuǎn)診時(shí)機(jī)的確定和移植后的低存活率。因此進(jìn)一步研究IPF 的發(fā)生發(fā)展機(jī)制并尋求新的治療靶點(diǎn)具有重大的臨床意義。

脂肪源性干細(xì)胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）是近年來再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的研究重點(diǎn)，該細(xì)胞不僅可通過增殖、歸巢和定向分化作用直接參與受損組織的修復(fù)，還可通過旁分泌功能間接參與調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)及氧化應(yīng)激等病理生理過程［2］。相對于干細(xì)胞直接定向分化作用而言，旁分泌功能被證明具有作用范圍廣和免疫異質(zhì)性小等優(yōu)勢。其中最受關(guān)注的是攜帶各種生物活性成分的外泌體，作為細(xì)胞間信息傳遞的重要媒介已被證實(shí)是干細(xì)胞發(fā)揮調(diào)節(jié)功能的關(guān)鍵旁分泌物質(zhì)［3］。本文就ADSCs 來源的外泌體（ADSCs-derived exosomes，ADSCs-Exo）在治療IPF中的研究進(jìn)展展開綜述，討論其潛在的作用機(jī)制及應(yīng)用前景。

1 外泌體的生物學(xué)結(jié)構(gòu)及功能

外泌體是一類在大小和生物功能等方面具有高度特異性的膜性囊泡，直徑約30～100 nm［4］。外泌體來源于細(xì)胞膜內(nèi)吞形成的早期內(nèi)體，逐步成熟為富含管腔狀囊泡的多囊體（multivesicular body，MVB）也就是外泌體前體。MVB主要通過內(nèi)體分選轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體（endosomal sorting complex required for transport，ESCRT）機(jī)制形成。ESCRT 是一組胞質(zhì)蛋白復(fù)合物，其中ESCRT-0 識(shí)別和結(jié)合早期內(nèi)體表面泛素化標(biāo)記的特異性受體，在ESCRT-I和ESCRT-II協(xié)同誘導(dǎo)下，內(nèi)體膜包裹特異性物質(zhì)形成出芽小泡，隨后ESCRTIII 剪切分離囊泡和內(nèi)體膜形成MVB，最后輔助蛋白VPS4（vacuolar protein sorting 4）分離并進(jìn)入ESCRT再循環(huán)［5］。MVB 有兩個(gè)去向，大部分經(jīng)溶酶體途徑被降解，少數(shù)與細(xì)胞膜融合并向胞外釋放外泌體從而發(fā)揮作用［6］。見圖1。

Figure 1.The biological structure，formation and secretion process of exosomes.圖1 外泌體的生物學(xué)結(jié)構(gòu)、形成和釋放過程

隨著對外泌體研究的逐漸深入，研究者對其功能有了更多的認(rèn)識(shí)。在發(fā)現(xiàn)初期，大多數(shù)研究者認(rèn)為外泌體是細(xì)胞分泌的廢棄物，細(xì)胞通過外泌體將胞內(nèi)一些多余的代謝物排出到胞外以維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。隨著研究的進(jìn)展，研究者們發(fā)現(xiàn)外泌體不僅可通過運(yùn)輸?shù)鞍踪|(zhì)、核酸及脂質(zhì)等生物活性物質(zhì)進(jìn)行細(xì)胞間的相互調(diào)節(jié)，還可作為穩(wěn)定的藥物載體進(jìn)行疾病治療，并與多種疾病診斷及預(yù)后判斷密切相關(guān)［7］。

2 ADSCs-Exo通過調(diào)節(jié)EMT 過程干預(yù)IPF 的發(fā)生發(fā)展

EMT 是正常胚胎發(fā)育和組織重建的生理過程，但其異常發(fā)生與腫瘤形成和纖維化過程相關(guān)［8］。EMT 的特征包括上皮鈣黏素（E-cadherin）表達(dá)減少，以及波形蛋白（vimentin）、I 型膠原和IV 型膠原等間充質(zhì)標(biāo)志物表達(dá)增加［9］。最近的研究表明，組織損傷后肺上皮細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)之間的通訊失調(diào)在IPF發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色，EMT通過激活與此過程相關(guān)的信號(hào)通路來促進(jìn)纖維化［10］。與此一致的是，小鼠模型實(shí)驗(yàn)以及一些IPF患者標(biāo)本檢測也同樣顯示了EMT 在IPF 中的重要作用［11］。目前ADSCs-Exo 對EMT 調(diào)控機(jī)制的研究尚不多，主要集中于轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）及Wnt/β-catenin 信號(hào)通路，已證實(shí)這兩條信號(hào)通路在EMT過程中發(fā)揮重要的正向調(diào)節(jié)作用。

2.1 ADSCs-Exo 通過調(diào)控TGF-β/Smad 相關(guān)信號(hào)通路影響EMT過程 在博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠中，敲除Smad3或轉(zhuǎn)染TGF-β 拮抗劑Smad7，可有效抑制肺纖維化程度及EMT 水平，由此表明TGF-β/Smad通路正向調(diào)控EMT過程［12］。Yao等［13］將間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體與經(jīng)TGF-β1 誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，外泌體促進(jìn)E-cadherin 表達(dá)，而降低vimentin、TGF-β1 和Smad2 表達(dá)，提示外泌體可抑制上皮細(xì)胞表型向間充質(zhì)表型轉(zhuǎn)換，其具體機(jī)制可能是通過其活性物質(zhì)直接或間接抑制TGF-β/Smad 信號(hào)通路以逆轉(zhuǎn)EMT 過程。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，外泌體中的微小RNA（microRNAs，miRNAs）在EMT 過程中起著關(guān)鍵作用，可作為胞外穿梭RNA 介導(dǎo)TGF-β/Smad信號(hào)通路以抑制EMT過程。Gao等［14］證實(shí)了ADSCs-Exo 可通過轉(zhuǎn)運(yùn)let-7d-5p 抑制I 型和IV 型膠原形成及TGF-β 和TGF-β 受體1（TGF-β receptor 1，TGFβR1）表達(dá)，從而延緩PM2.5誘導(dǎo)的EMT 和肺纖維化進(jìn)程。此外，目前研究也在ADSCs-Exo 中發(fā)現(xiàn)了一系列靶向TGF-β/Smad 信號(hào)通路的特異性miRNAs，如靶向下調(diào)TGF-β 的miR-19b［15］、靶向下調(diào)TGF-β1的miR-21［16］、靶向下調(diào)TGF-β2 的miR-200［17］等。上述miRNAs 已被證明在IPF 患者及實(shí)驗(yàn)性肺纖維化小鼠細(xì)胞及組織中表達(dá)水平下調(diào)，而通過誘導(dǎo)這些miRNAs 表達(dá)可以抑制EMT 進(jìn)而緩解甚至逆轉(zhuǎn)肺纖維化進(jìn)程［18］。另一方面，ADSCs-Exo 可通過調(diào)控Smad 非依賴的TGF-β 信號(hào)通路抑制EMT 形成。研究者們發(fā)現(xiàn)ADSCs-Exo 可釋放大量的肝細(xì)胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）和前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2），這兩種細(xì)胞因子通過阻斷TGF-β 活化抑制成纖維細(xì)胞的增殖，并以PI3K/Akt依賴的方式抑制EMT［19］。ADSCs-Exo 也可通過降低TGF-β 的表達(dá)，靶向調(diào)控ZEB1（zinc finger E-box binding homeobox 1）/miR-200 信號(hào)通路，從而抑制和逆轉(zhuǎn)EMT過程［20］。

2.2 ADSCs-Exo 通過調(diào)控Wnt/β-catenin 通路信號(hào)調(diào)節(jié)EMT 過程 相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，Wnt/β-catenin 信號(hào)在IPF中異常激活，降低該信號(hào)通路活化水平可以部分恢復(fù)上皮表型并抑制肺纖維化的進(jìn)展，提示W(wǎng)nt/β-catenin 介導(dǎo)的EMT 在IPF 中發(fā)揮了關(guān)鍵作用［21］。Shao 等［22］發(fā)現(xiàn)，ADSCs-Exo 中含有Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的拮抗劑分泌型糖蛋白Dickkopf-1（DKK-1），可以有效阻斷電離輻射誘導(dǎo)的EMT進(jìn)而限制放射性肺纖維化的發(fā)生。Rong 等［23］的研究表明，人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體可以下調(diào)Wnt 信號(hào)通路中的β-catenin 及WISP1（Wnt1-inducible signaling pathway protein 1）的表達(dá)，對WISP1 表達(dá)的抑制作用尤為顯著，由此不僅延緩EMT進(jìn)程，而且降低細(xì)胞外基質(zhì)沉積以抑制纖維化。另有研究發(fā)現(xiàn)，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體可通過誘導(dǎo)Yes 相關(guān)蛋白（Yes-associated protein，YAP）磷酸化而抑制Wnt/βcatenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而下調(diào)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白及I型和III 型膠原的表達(dá)［24］。YAP 信號(hào)是Hippo 信號(hào)通路的核心成分，可阻止β-catenin 核轉(zhuǎn)位并降低βcatenin 穩(wěn)定性進(jìn)而抑制Wnt 信號(hào)，Hippo 和Wnt 信號(hào)通路之間相互調(diào)控共同參與EMT 過程［25］。另外，Wnt 和TGF-β 信號(hào)通路之間也互相調(diào)節(jié)、互相影響，Wnt 已被證明與TGF-β 信號(hào)通路通過協(xié)同作用共同誘導(dǎo)EMT 過程，這些復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)在IPF 發(fā)病機(jī)制中起著重要作用［26］。Tsukasa 等［27］通過氣管內(nèi)注射人支氣管上皮細(xì)胞來源的外泌體減輕了博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化發(fā)展，并發(fā)現(xiàn)外泌體中某些高表達(dá)的miRNAs（miR-200a 和miR-26a）通過調(diào)節(jié)TGF-β-Wnt 的協(xié)同作用發(fā)揮抗纖維化作用。因此，靶向調(diào)控TGF-β 和Wnt 的相互調(diào)節(jié)節(jié)點(diǎn)可能是治療IPF 的有效策略之一。

EMT 是正常生長發(fā)育和傷口愈合的重要生理過程，但失調(diào)的EMT過程促進(jìn)組織纖維化和腫瘤形成。EMT 的穩(wěn)態(tài)通過多種信號(hào)通路調(diào)控，ADSCs-Exo 通過調(diào)控其中一個(gè)及多個(gè)信號(hào)通路影響EMT 過程（總結(jié)見表1），進(jìn)一步研究ADSCs-Exo 在EMT 進(jìn)程中的調(diào)控機(jī)制有望發(fā)現(xiàn)治療IPF的新方法。

3 ADSCs-Exo調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)影響IPF的發(fā)生發(fā)展

異常的免疫反應(yīng)是促進(jìn)IPF 發(fā)生發(fā)展的重要病因。動(dòng)物及人類相關(guān)研究結(jié)果表明，先天性和獲得性免疫過程參與了IPF形成的整個(gè)階段，并可能決定疾病進(jìn)展的速度［28］。研究者發(fā)現(xiàn)，在確診的IPF患者肺組織中，纖維化病灶中存留大量的CD4+T 細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞，并且在該類患者血清及支氣管肺泡灌洗液中可檢測到高水平的自身抗體及各種趨化因子［29］。ADSCs-Exo 具有減輕炎癥及免疫反應(yīng)的作用，已被廣泛應(yīng)用于自身免疫性疾病的研究及治療中，但在IPF 中的治療作用及機(jī)制仍處于探索階段，從現(xiàn)有的研究來看，ADSCs-Exo 免疫調(diào)節(jié)功能可能對IPF發(fā)生發(fā)展有著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用［30］。

3.1 ADSCs-Exo通過調(diào)控T細(xì)胞免疫應(yīng)答維持免疫穩(wěn)態(tài) 研究者們將缺乏CD28（一種T 細(xì)胞完全活化所必需的細(xì)胞表面共刺激分子）的小鼠用博來霉素處理后，發(fā)現(xiàn)其肺纖維化程度較野生型小鼠明顯減輕；進(jìn)一步將CD28+T 細(xì)胞轉(zhuǎn)移至CD28-/-小鼠體內(nèi)，可恢復(fù)小鼠對博來霉素的纖維化反應(yīng)，表明T 細(xì)胞對IPF 形成起驅(qū)動(dòng)作用［31］。然而T 細(xì)胞種類繁多，各亞群及其分泌的細(xì)胞因子可能于不同層面影響IPF的形成。目前的研究主要集中在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Treg）與輔助性T 細(xì)胞17（T helper 17 cells，Th17）。IPF 患者存在Treg/Th17 比例下調(diào)，研究證明Treg 減少了成纖維細(xì)胞的交聯(lián)、聚集，抑制了炎癥反應(yīng)；與此相反，Th17 通過分泌白細(xì)胞介素17A（interleukin-17A，IL-17A）促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖分化和炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，并降低成纖維細(xì)胞對Treg 免疫調(diào)節(jié)的反應(yīng)［32］。因此T 細(xì)胞亞群的動(dòng)態(tài)平衡對IPF發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要，ADSCs-Exo可通過對T細(xì)胞亞群的調(diào)控發(fā)揮其在IPF 中的調(diào)節(jié)作用。Blazquez 等［33］發(fā)現(xiàn)，ADSCs-Exo 可抑制T 細(xì)胞的功能，包括減少干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）的分泌以抑制T 細(xì)胞的激活，以及阻礙抗CD3/CD2/CD28 抗體介導(dǎo)的T 細(xì)胞向效應(yīng)-記憶細(xì)胞表型的分化。同時(shí)，Blazquez 等［33］猜測，由于缺乏MHC-II類分子和共刺激分子，ADSCs-Exo 對T 細(xì)胞可能有不依賴于抗原提呈的直接抑制作用。此外，Bolandi 等［34］發(fā)現(xiàn)，ADSCs-Exo 通過攜帶并轉(zhuǎn)移miR-10a 促進(jìn)T 細(xì)胞向Treg 轉(zhuǎn)化，并抑制其向Th17分化。ADSCs-Exo含有的眾多miRNAs 中，不僅上文提及的miR-10a，其它miRNAs 如miR-21、miR-20和miR-93也相繼被證明可提高Treg與Th17比例，它們可能是通過調(diào)節(jié)STAT3、STAT5 或TGF-β 通路實(shí)現(xiàn)的［35-36］。另有研究表明，ADSCs-Exo 中含有腫瘤壞死因子刺激基因6（tumor necrosis factor-stimulated gene 6，TSG-6）、吲哚胺2，3-雙加氧酶（indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO）和程序性死亡配體1（programmed death ligand 1，PD-L1）三種負(fù)反饋免疫調(diào)節(jié)分子，可通過控制T 細(xì)胞增殖和提高Treg 的數(shù)量及活性而抑制免疫反應(yīng)［37］。

3.2 ADSCs-Exo 通過誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2 型極化調(diào)節(jié)免疫反應(yīng) 巨噬細(xì)胞作為非特異性免疫的重要組成部分，具有多樣性和可塑性特征，在環(huán)境刺激或不同的生理病理?xiàng)l件下可通過M1（促炎）/M2（抗炎）表型轉(zhuǎn)換參與炎癥調(diào)控及組織修復(fù)過程［38］。有文獻(xiàn)報(bào)道M2 型巨噬細(xì)胞不僅通過分泌IL-10 發(fā)揮抗炎作用，同時(shí)分泌基質(zhì)金屬蛋白酶并通過細(xì)胞內(nèi)途徑降解膠原參與細(xì)胞外基質(zhì)重塑［39］。在矽肺和肺損傷模型小鼠中，研究者們也發(fā)現(xiàn)M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量的增加可延緩肺纖維化發(fā)展。Heo 等［39］將ADSCs-Exo 和巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后檢測后者的表型變化，發(fā)現(xiàn)外泌體下調(diào)了M1 型標(biāo)志物TNF-α 和iNOS 表達(dá)，并使M2型標(biāo)志物Arg-1、IL-10 和CCL22 表達(dá)上調(diào)，表明ADSCs-Exo 可促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2 型極化。同樣，Shang 等［40］在ADSCs 和巨噬細(xì)胞的共培養(yǎng)中驗(yàn)證了外泌體從ADSCs到巨噬細(xì)胞的單向轉(zhuǎn)移并誘導(dǎo)其向M2 型極化，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)缺乏p-STAT3 的ADSCs-Exo 不能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞高表達(dá)Arg-1，而巨噬細(xì)胞中STAT3的敲除對ADSCs-Exo 觸發(fā)的Arg-1 高表達(dá)無明顯影響，表明ADSCs-Exo 通過攜帶的p-STAT3 激活A(yù)rg-1 進(jìn)而誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2 型極化。此外，相關(guān)研究表明，ADSCs-Exo 在心肌梗死模型中可通過激活S1P/SK1/S1PR1 及AKT1/AKT2 信號(hào)通路來促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞極化，從而減輕心肌梗死后炎癥及纖維化反應(yīng)［41-42］。ADSCs-Exo 也可通過釋放某些參與免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)的miRNAs 進(jìn)而調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞向M2 型極化，如靶向上調(diào)PI3K/Akt 信號(hào)的miR-21［43］、靶向下調(diào)TLR4/NF-κB 信號(hào)的miR-181c［44］、同時(shí)靶向調(diào)節(jié)2條信號(hào)通路的miR-182［45］等。PI3K/Akt和TLR4/NF-κB 信號(hào)通路是巨噬細(xì)胞極化機(jī)制中研究最廣泛的，兩者之間的相互作用機(jī)制復(fù)雜，ADSCs-Exo 如何通過轉(zhuǎn)運(yùn)miRNAs 調(diào)節(jié)這2 條信號(hào)通路的平衡尚需進(jìn)行深入研究。

先天性和獲得性免疫反應(yīng)參與了IPF 形成的各個(gè)階段，在其發(fā)病機(jī)制中占據(jù)重要地位。ADSCs-Exo通過控制T細(xì)胞增殖分化、Treg細(xì)胞活性和巨噬細(xì)胞極化發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用（總結(jié)見表1），有望成為IPF潛在的治療藥物。

表1 ADSCs-Exo攜帶的蛋白及RNAs在調(diào)節(jié)IPF中的作用機(jī)制Table 1.The mechanism of ADSCs-Exo-secreted proteins or RNAs in mediating idiopathic pulmonary fibrosis

4 小結(jié)和前景

IPF 病理過程復(fù)雜，目前尚缺乏有效的防治措施，發(fā)病率和病死率仍呈升高趨勢。本文中，我們介紹了目前ADSCs-Exo 在IPF 治療方面的一些主要國內(nèi)外研究成果。我們發(fā)現(xiàn)，盡管ADSCs-Exo 在治療IPF中的研究尚處于起步階段，但目前僅有的研究結(jié)果顯示其對IPF 具有潛在的臨床治療作用及價(jià)值。然而將外泌體用于治療IPF仍存在諸多挑戰(zhàn)。首先，外泌體提取方式、保存條件、給藥途徑及劑量方面尚無標(biāo)準(zhǔn)化，此方面有待深入的研究；其次，目前的研究多集中于ADSCs-Exo 中miRNAs 的探討，對其分泌的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和其他非編碼RNA 的生物潛能知之甚少；最后，ADSCs-Exo 應(yīng)用于IPF 治療的研究尚處于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，需進(jìn)一步探究其臨床治療的安全性及可行性。隨著未來研究的不斷深入，肺纖維化的發(fā)病機(jī)制和ADSCs-Exo 對肺纖維化的調(diào)控作用及其機(jī)制將被逐漸闡明，ADSCs-Exo 有望成為未來臨床治療IPF的重要手段。