FPR2通過ERK1/2信號通路調控炎癥狀態(tài)下滋養(yǎng)細胞生物學功能*

李淑賢，周美娟，李安娜，房振亞，郭君君，張美華

（山東省婦幼保健院國家衛(wèi)健委生育調控技術重點實驗室，濟南山東 250014）

絨毛膜羊膜炎（chorioamnionitis，CAM）是常見的宮內感染性疾病，可導致產婦發(fā)生子宮內膜炎、子宮腔內粘連和盆腔膿腫，引發(fā)死胎、早產、新生兒感染和敗血病等，影響胎兒生長發(fā)育，引起多種新生兒疾?。?-2］，是目前產科和兒科專家共同關注的焦點，探究其分子機制，尋找有效的治療新靶點，對于臨床診療具有重要意義。

甲酰肽受體2（formyl peptide receptor 2，F(xiàn)PR2）屬于G 蛋白偶聯(lián)受體家族成員，參與炎癥、神經退行性疾病、腫瘤和糖脂代謝紊亂等相關疾病的多種生理和病理過程［3-4］。研究表明，F(xiàn)PR2激活可促進炎癥反應，增加單核細胞趨化性和中性粒細胞招募［5］；Fpr2基因缺陷的小鼠通過減少炎癥反應和減輕心肌功能障礙來緩解膿毒癥［6］。另一方面，F(xiàn)PR2 也可與多種抗炎介質結合產生抗炎作用［7-8］。因此，F(xiàn)PR2是參與多種炎性疾病的細胞膜受體，是這些疾病的潛在診治靶點。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）是細胞內的一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與細胞生長、發(fā)育、增殖、死亡以及細胞間多種生化反應信號的識別、傳遞及放大等處理過程［9］，包含3 個主要通路：細胞外信號調節(jié)激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2）、c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和p38 MAPK 信號通路［10］。研究顯示MAPK 信號通路可作為FPR2的下游調控信號通路，如在早期腦損傷的研究中，F(xiàn)PR2 通過MAPK 信號通路調控小膠質細胞的炎癥反應［11］，而且FPR2基因敲除可通過MAPK信號通路減輕由脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的肺部炎癥反應［12］。但FPR2 能否通過MAPK 信號通路調控滋養(yǎng)細胞炎癥反應并參與CAM 的發(fā)生發(fā)展，目前尚不清楚。

本研究通過收集CAM患者胎盤組織，明確FPR2在其中的表達和定位；并利用LPS 建立滋養(yǎng)細胞系HTR-8/SVneo 體外炎癥模型，同時利用小干擾RNA敲減FPR2基因表達，探究炎癥條件下FPR2 對滋養(yǎng)細胞炎癥因子釋放及細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移的影響，并探究其作用的信號通路，揭示FPR2 對滋養(yǎng)細胞生物學功能的調控作用和機制，以期為CAM 的治療提供參考資料。

材料和方法

1 胎盤樣本

收集2020 年1 月～2021 年1 月在山東省婦幼保健院診療的10 例CAM 患者和10 例正常產婦胎盤組織。所有患者均簽署知情同意書，臨床樣本采集過程經山東省婦幼保健院醫(yī)學倫理委員會審核通過。胎盤剝離后分別于胎兒面及母體面各切取1 cm×1 cm×1 cm 大小的組織，立即置于預冷的PBS 中。PBS沖洗后置于做好標記的凍存管中，液氮速凍后置于-80 ℃保存。另取相同大小組織，預冷PBS漂洗后置于4%多聚甲醛中固定，用于后續(xù)組織切片的制作。

2 細胞

人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞系HTR-8/SVneo 購自ATCC。

3 主要試劑和儀器

RPMI-1640 培養(yǎng)液、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、減血清培養(yǎng)液OPTI-MEM 和轉染試劑Lipofectamine 2000購自Gibco；細菌LPS、丙酮酸鈉、青-鏈霉素混合液和FPR2小干擾RNA（siFPR2）購于Sigma；FPR2 抗體（ab63022）購自Abcam；ERK1/2 抗體（11257-1-AP）、p-ERK1/2 抗體（28733-1-AP）、p38抗體（14064-1-AP）和p-p38 抗體（28796-1-AP）購于Proteintech；JNK 抗 體（sc-7345）和p-JNK 抗體（sc-6254）購于Santa Cruz；β-actin 抗體（GB11001）和辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗IgG（G1213）購自武漢賽維爾生物科技有限公司；ELISA 試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；EdU 細胞增殖檢測試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司；annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒、基質膠和0.25%胰酶購自BD；劃痕插件購自ibidi；Transwell小室購自Corning；BCA 蛋白檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。

4 主要方法

4.1 細胞培養(yǎng) HTR-8/SVneo 細胞在含10% FBS、1%丙酮酸鈉和1%青-鏈霉素混合液（包括1×105U/L青霉素和100 mg/L 鏈霉素）的RPMI-1640 培養(yǎng)液中，于37 ℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d 換液1 次。待細胞密度達80%～90%時，用0.25%胰酶消化，進行傳代培養(yǎng)做后續(xù)實驗。

4.2 細胞轉染 方法如前所述［13］。HTR-8/SVneo細胞以每孔2×105個的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)過夜，將培養(yǎng)液換成減血清培養(yǎng)液OPTI-MEM。取100μL OPTI-MEM 于EP 管中，加入4 μL Lipofectamine 2000和1 200 ng siFPR2（6μL），混勻，室溫孵育15 min 后輕柔、均勻加入到每孔中。培養(yǎng)8 h 后，換成完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，收集細胞進行后續(xù)實驗。

4.3 細胞分組 取對數(shù)生長期HTR-8/SVneo 細胞，以每孔2×105個的密度接種至6 孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞密度達60%時按以下分組進行處理：（1）正常對照（control，CON）組：HTR-8/SVneo細胞以完全培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h；（2）LPS 組：培養(yǎng)液中加入100μg/L LPS，培養(yǎng)12 h；（3）LPS+siFPPR2 組：取siFPR2轉染后的HTR-8/SVneo 細胞，待細胞密度達60%時，加入100μg/L LPS，培養(yǎng)12 h。

4.4 Western blot實驗 提取組織蛋白：取黃豆大小胎盤組織于預冷的研缽中，加入液氮，研磨至粉末狀，加入500μL 含1%PMSF 的RIPA，置于冰上反應30 min，4 ℃、12 000×g離心30 min，上清液轉移至EP管中。提取細胞蛋白：用預冷的PBS 輕柔洗滌孔板中的細胞，加入100μL 含1% PMSF 的RIPA，置于冰上反應30 min，4 ℃、12 000×g離心30 min，上清液轉移至EP 管中。提取的組織蛋白和細胞蛋白用BCA試劑盒檢測蛋白含量。取適量蛋白，加入適量上樣緩沖液，煮沸5 min使蛋白變性，進行SDS-PAGE。電泳結束后，將分離的蛋白轉移至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h；分別加入FPR2、ERK1/2、p-ERK1/2、p38、p-p38、JNK、p-JNK 和β-actin 抗體，4 ℃孵育過夜；TBST 洗膜3 次，每次10 min，加入辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗IgG，室溫孵育1 h，TBST 洗膜3次后加入增強化學發(fā)光試劑避光顯影，凝膠成像分析儀采集圖片，ImageJ 軟件分析蛋白條帶灰度值，以目標蛋白與內參照β-actin比值作為各蛋白相對含量。實驗重復3次。

4.5 免疫組織化學染色 方法如前所述［14］。胎盤組織石蠟包埋切片后，室溫放置30 min，回溫后60 ℃烘烤30 min，放入二甲苯中10 min，之后依次放入100%、95%、90%、80%、70%和50%乙醇中各5 min，最后置于PBS；將切片置于0.01 mol/L 的檸檬酸鹽緩沖液中，加熱至沸騰，保持10 min 進行抗原修復；待玻片自行冷卻后加入0.3% Triton X-100 作用20 min；PBS 沖洗后標本上加入3% H2O2，孵育10 min，隨后加入山羊血清室溫封閉60 min，滴加Ⅰ抗4 ℃封閉過夜。PBS 清洗3 次后加入Ⅱ抗室溫孵育1 h，滴加蘇木素復染5 min，流水沖洗，鹽酸乙醇分化10 s后繼續(xù)流水沖洗5 min，切片依次置于70%、80%和90%酒精中各3 min，95%乙醇5 min，100%乙醇10 min，二甲苯20 min；最后中性樹膠封片，晾干后顯微鏡下觀察拍照。

4.6 ELISA 各組細胞按條件處理后，吸取上清于EP管中，用ELISA試劑盒檢測白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）、IL-8 和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）含量。按說明書要求配制標準品，將標準品、樣品稀釋液和樣品各100μL 加入到酶標板孔中，加上封板膜，37 ℃反應90 min。吸除酶標板內液體，每孔加入抗體工作液100 μL，37 ℃反應60 min。1×洗滌緩沖液洗滌3 次，每次浸泡1 min 左右。將準備好的ABC 工作液按每孔100 μL 加入酶標板中，反應30 min。1×洗滌緩沖液洗滌5 次，每次浸泡1～2 分鐘。每孔加入90 mL TMB 顯色液，37 ℃避光反應15～20 min。用酶標儀在450 nm測定A值。

4.7 EdU 細胞增殖活性檢測實驗 接種各組細胞于96 孔板中，每孔5 000 個細胞。按說明書要求在100 μL 培養(yǎng)液中加入100 μL 2× EdU 工作液，37 ℃孵育2 h；去除培養(yǎng)液，每孔加入200μL 4%多聚甲醛固定液，室溫固定15 min；去除固定液，每孔用200μL PBS 洗滌細胞3 次，每次3 min；每孔加入200 μL通透液，室溫孵育15 min，去除通透液，每孔用200μL PBS 洗滌細胞3 次，每次3 min；每孔加入0.5 mL Click 反應液，室溫避光孵育20 min，去除反應液，PBS 洗滌細胞3 次，每次3 min；加入Hoechest 進行細胞核染色，避光孵育15 min 后PBS 洗滌細胞3 次，每次3 min，將96孔板置于高內涵分析儀中拍照，計數(shù)。用ImageJ軟件進行數(shù)據分析。

4.8 流式細胞術檢測細胞凋亡情況 收集不同組的HTR-8/SVneo 細胞，PBS 輕柔洗滌2 遍，1 500×g離心5 min，棄除上清液，加入100μL上樣緩沖液，吹打懸浮細胞，按說明書要求加入5 μL annexin V-FITC和5μL PI，混合均勻；室溫避光孵育15 min 后，再加入400μL 上樣緩沖液，置于冰上，1 h 內置于流式細胞儀中檢測。實驗重復3次。

4.9 劃痕實驗 方法如前所述［15］。將ibidi 劃痕插件置于6孔板中，按每孔6×104個細胞密度接種HTR-8/SVneo 細胞，培養(yǎng)過夜后用鑷子小心揭除插件，用PBS 輕柔沖洗細胞碎片，孔板內注入無血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h 后置于顯微鏡下觀察劃痕，并通過ImageJ軟件進行分析。

4.10 Transwell 實驗 方法如前所述［16］。將50 μL 1 g/L 基質膠加至上層小室中，37 ℃放置1 h 后，上層小室中接種200μL無血清培養(yǎng)液懸浮的細胞1×105，下室加入600μL 含10%血清的完全培養(yǎng)液，37 ℃培養(yǎng)24 h。用鑷子小心夾取上層小室，吸除小室中培養(yǎng)液，小室在PBS 中輕柔洗滌2 次，用棉簽小心擦拭小室內側底部，將小室放回板內，加入1 mL 4%多聚甲醛固定小室下層細胞20 min，PBS 輕柔洗滌2 次，加入0.1%結晶紫稀釋液，染色20 min，PBS 輕柔洗滌2 次后，將小室置于正置顯微鏡下，觀察小室底部細胞并拍照。

5 統(tǒng)計學處理

采用GraphPad Prism 8.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。所有實驗均進行了至少3 次重復。計量資料經正態(tài)性檢驗符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。兩組間均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。圖片數(shù)據的采集和處理用ImageJ軟件進行。

結果

1 CAM患者胎盤組織中FPR2表達情況

免疫組化結果顯示，F(xiàn)PR2在CAM患者胎盤組織中的表達量明顯高于正常產婦，且主要表達于滋養(yǎng)細胞層中，見圖1A。Western blot 檢測結果同樣顯示，CAM 患者胎盤組織中FPR2 表達量顯著增加（P＜0.01），見圖1B。利用LPS（100 μg/L）處理HTR-8/SVneo滋養(yǎng)細胞構建體外細胞炎癥模型，結果顯示自LPS 處理4 h 開始FPR2 表達量隨時間不斷增加，處理12 h 時，F(xiàn)PR2 表達量顯著增加（P＜0.01），見圖1C。因此后續(xù)實驗選取12 h 作為LPS 刺激HTR-8/SVneo細胞的作用時間。

2 敲減FPR2 可減少LPS 誘導的HTR-8/SVneo 細胞促炎因子的分泌

利用小干擾RNA 敲減HTR-8/SVneo 細胞中FPR2基因，Western blot 實驗結果顯示FPR2 蛋白表達顯著減少（P＜0.01），見圖2A。LPS 刺激HTR-8/SVneo 滋養(yǎng)細胞12 h 后，ELISA 檢測結果顯示培養(yǎng)液上清中促炎因子IL-6、IL-1β 和TNF-α 表達水平顯著升高（P＜0.01）；將LPS 作用于FPR2敲減的HTR-8/SVneo 滋養(yǎng)細胞，結果顯示促炎因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 表達水平均較LPS 組顯著下降（P＜0.05 或P＜0.01），見圖2B。

3 敲減FPR2 可減輕LPS 誘導的HTR-8/SVneo 細胞功能損傷

利用EdU 實驗檢測細胞增殖活性，結果顯示與正常組相比，LPS處理組中HTR-8/SVneo細胞增殖活性顯著降低，細胞增值率由之前的80%左右降至50%左右（P＜0.01），但FPR2敲減后，細胞增殖率增加至70%左右（P＜0.05，圖3A、3B）。流式細胞儀檢測細胞凋亡結果顯示，對照組細胞凋亡率約為8%，LPS 處理后，HTR-8/SVneo 細胞凋亡率增至25%左右（P＜0.01），當FPR2敲減后凋亡率減少到12%左右（P＜0.01，圖3C、3D）。Transwell 實驗結果顯示，LPS處理組穿透至小室底部的細胞數(shù)目顯著降低，表明LPS 可顯著抑制HTR-8/SVneo 細胞侵襲能力（P＜0.01），但FPR2敲減后，侵襲至小室底面細胞數(shù)目顯著增加（P＜0.01，圖3E、3F）。劃痕實驗結果顯示，LPS 處理24 h 后HTR-8/SVneo 細胞遷移能力較正常對照組顯著減弱，遷移面積約為正常組的20%（P＜0.01）；FPR2敲減后，遷移面積顯著增加（P＜0.01，圖3G、3H）。

4 FPR2 通過ERK1/2 信號通路調控炎癥狀態(tài)下滋養(yǎng)細胞功能

提取CON 組、LPS 組T LPS+siFPR2 組細胞的總蛋白，利用Western blot檢測細胞中ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK、p38 和p-p38 的蛋白表達水平（圖4A、4B），結果顯示ERK、JNK 和p38 表達無顯著差異，但LPS 組p-ERK1/2、p-JNK 和p-p38 蛋白表達均顯著增高（P＜0.05，P＜0.01），F(xiàn)PR2基因敲減后，p-JNK 和pp38蛋白表達與LPS處理組無顯著差異，但p-ERK 蛋白表達下降顯著（P＜0.01，圖4A、4B）。

討 論

CAM是由于胎盤組織受到病原菌入侵后引起的感染性炎癥，是早產的常見原因，可能導致多種不良妊娠結局，如胎兒生長受限、早產、新生兒感染和敗血癥等，因此臨床上常用抗炎藥物進行治療［17-18］。滋養(yǎng)細胞是構成母胎界面的關鍵細胞，其重要作用貫穿妊娠過程的始終。越來越多的證據顯示，妊娠過程中的炎癥感染會造成滋養(yǎng)細胞功能損傷、侵襲缺陷、子宮螺旋動脈重塑障礙，進而引發(fā)胎盤血管網絡生長構建不良，胎盤缺血、缺氧、過度氧化應激及代謝功能紊亂等病理改變，最終導致多種不良妊娠結局的發(fā)生［19-20］。這些研究提示CAM 可能與炎癥狀態(tài)下滋養(yǎng)細胞生物學功能受損有關，但具體作用機制尚不明確。

Figure 1.The expression of FPR2 increased in the placenta of chorioamnionitis（CAM）patients.A：the expression and location of FPR2 in the placenta tissues derived from CT（n=10）and CAM（n=10）patients were analyzed by IHC（scale bar=50μm）；B：the expression of FPR2 in the placenta tissues derived from CT and CAM patients was analyzed by Western blot（n=3）；C：Western blot was used to detect the protein levels of FPR2 in HTR-8/SVneo cells treated with 100μg/L LPS for different time（0，2，4，8，12，24 and 48 h）.Mean±SD.△△P＜0.01 vs CT group；**P＜0.01 vs 0 h group.圖1 FPR2在CAM患者胎盤組織中高表達

FPR2 屬于甲酰肽受體家族成員，是一種G 蛋白偶聯(lián)受體（人的為FPR2，小鼠為Fpr2）。FPR2 被證實參與多種炎癥引發(fā)的疾病的發(fā)生和發(fā)展，如心肌炎、風濕性關節(jié)炎、肺炎、結腸炎等［21-23］，F(xiàn)PR2通過結合配體參與人體的炎癥反應，而且根據結合配體的不同，表現(xiàn)出促炎或抑炎兩種截然相反的功能。當FPR2 與脂氧素A4（lipoxin A4，LXA4）、消退素D1（resolvin D1，RvD1）、糖皮質激素調節(jié)蛋白A 等抗炎介質結合時，可抑制炎癥反應［24-25］；另一方面，F(xiàn)PR2又可以通過增加單核細胞和中性粒細胞的趨化和募集，介導巨噬細胞M1 極化，加速炎癥反應［26］。在肺組織的炎癥模型中，F(xiàn)PR2基因敲除顯著降低了LPS誘導炎癥反應，降低促炎因子的表達［12］。研究顯示，人類胎盤組織中表達FPR2，且在子癇前期、胎兒生長受限、妊娠期糖尿病患者胎盤中表達出現(xiàn)異常［27，28］，在妊娠期糖尿病中，F(xiàn)PR2 表達顯著升高，且FPR2敲減后會逆轉高糖對滋養(yǎng)細胞功能損傷［29］。在胎兒生長受限母體胎盤中FPR2表達顯著升高，且FPR2 可影響滋養(yǎng)細胞分化和內皮細胞功能導致胎盤功能不全［30］。這些研究結果表明FPR2 對于胎盤滋養(yǎng)細胞的功能至關重要，但是在胎盤炎癥相關疾病中，F(xiàn)PR2研究較少，尤其在CAM中更是鮮有研究。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)RvD1 可以與FPR2 結合減輕LPS 導致的滋養(yǎng)細胞的炎癥反應，但FPR2 對于滋養(yǎng)細胞生物學功能的影響尚待進一步的研究和討論。

Figure 2.Knockdown of FPR2 reduced the release of pro-inflammatory cytokines in HTR-8/SVneo cells treated with LPS.A：the Western blot results showed the expression of FPR2 was down-regulated in HTR-8/SVneo cells transfected with si-FPR2（600 μg/L）；B：the concentrations of IL-6，IL-1β and TNF-α in the supernatant of HTR-8/SVneo cells treated with 100μg/L LPS and 600 μg/L siFPR2 were detected by ELISA.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs si-NC group；△△P＜0.01 vs CON group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs LPS group.圖2 敲減FPR2可減少LPS誘導的HTR-8/SVneo細胞炎癥因子的分泌

本研究表明FPR2 在CAM 胎盤組織中的表達顯著增加，提示FPR2 可能參與了CAM 的疾病進程。細菌脂多糖是革蘭氏陰性菌細胞壁外壁的主要組成成分，通過與宿主細胞上的特異性受體（Toll like receptor，TLR）結合，引發(fā)TNF-α，IL-1β 和IL-6 等炎癥因子釋放［31］。革蘭氏陰性細菌是宮內感染的主要病原菌，近些年來關于LPS 引發(fā)滋養(yǎng)細胞炎癥反應與早產、復發(fā)性流產、子癇前期以及胎兒宮內生長受限等多種不良妊娠相關的研究備受關注［32-33］。因此本研究選擇利用LPS 構建體外滋養(yǎng)細胞炎癥細胞模型。研究結果發(fā)現(xiàn)LPS 顯著提高了HTR-8/SVneo 滋養(yǎng)細胞系中FPR2 的表達，這與CAM 患者胎盤組織中FPR2 表達升高的結果相一致；另一方面，F(xiàn)PR2敲減后顯著降低了LPS 誘導的HTR-8/SVneo 滋養(yǎng)細胞中促炎因子TNF-α，IL-1β 和IL-6 的分泌，同時FPR2基因敲減改善了LPS 對HTR-8/SVneo 的增殖、凋亡、侵襲、遷移能力的影響。這些研究結果提示，F(xiàn)PR2參與炎癥條件下滋養(yǎng)細胞生物學功能的調節(jié)，起到促炎作用。本課題組之前發(fā)現(xiàn)FPR2 可以與RVD1結合減輕胎盤炎癥反應的研究結果，由此推測在CAM 發(fā)展過程中，胎盤炎癥受多種因素調節(jié)，在CAM 早期階段，胎盤受多種外來病原菌感染，誘發(fā)FPR2 產生促炎作用，但隨著疾病發(fā)展，多種抗炎物質如RVD1 和LXA4 等分泌增加，F(xiàn)PR2 與之結合產生抑炎作用，協(xié)助機體消除炎癥反應。當然，這些假設需要更多的研究進行證實。

本研究同時探究了炎癥狀態(tài)下FPR2 調控滋養(yǎng)細胞功能的相關信號通路。研究表明，LPS可與細胞膜上的Toll 樣受體相互作用，觸發(fā)多種信號通路。在多種滋養(yǎng)細胞系如HTR-8/SVneo 和JEG3 等中LPS激活細胞膜上Toll 樣受體4（Toll like receptor 4，TLR-4），進一步激活下游信號通路如MAPK、NF-κB和STAT 等，促進炎癥反應的發(fā)生和擴大。其中MAPK（絲裂原活化蛋白激酶）信號通路是調控細胞生長、分化、炎癥和應激等多種重要生理效應的經典信號通路［34-35］，主要包括三個分支：ERK、JNK、p38/MAPK。Western blot 結果顯示加入LPS 后，HTR-8/SVneo 中p-ERK1/2、p-p38 和p-JNK 表達均有顯著增加，但加入siFPR2 后p-ERK1/2 表達顯著降低，p-p38和p-JNK 表達沒有顯著變化。由此推測FPR2 可能通過MAPK/ERK 信號通路調控LPS 對滋養(yǎng)細胞的作用。有研究報道在蛛網膜下出血研究中FPR2 可與外源性LXA4 結合抑制p38 信號通路表達以此緩解炎癥反應［36］。但在本研究中，F(xiàn)PR2基因敲除并不改變p38 信號通路表達，這可能是因為不存在配體LXA4的原因。以后的研究將進一步探究FPR2配體與FPR2 間的相互作用在CAM 中的作用及作用機制。明確FPR2 調控滋養(yǎng)細胞生物學功能的信號通路，將為CAM的治療提供新的靶點。

目前本研究還存在一定的局限性，如缺乏CAM的動物模型，無法通過體內實驗探究FPR2的作用機制，另外缺少在原代滋養(yǎng)細胞中進行FPR2功能分析的數(shù)據。這些內容將在以后的研究中對這些方面進行進一步的探究。

Figure 3.The effects of LPS on proliferation，apoptosis，invasion and migration of HTR-8/SVneo cells were attenuated after FPR2 was knocked down.A：EdU assay showed that the proliferation of HTR-8/SVneo cells transfected with si-FPR2 was increased（the nuclei were stained with Hoechest in blue and the cells in the proliferation stage were stained with EdU in red）；B：annexin V-FITC/PI staining and flow cytometry were used to determine the percentage of apoptotic cells treated with LPS and LPS+siFPR2；C：representative images of the transwell invasion assay at 12 h in different groups and statistical analysis；D：representative images of wound healing assay of HTR-8/SVneo cells under different conditions at 0 h and 24 h（scale bar=200μm）and statistical analysis. Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs CON group；△△P＜0.01 vs LPS group.圖3 敲減FPR2減弱LPS對HTR-8/SVneo細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移的影響

Figure 4.The expression of ERK1/2，JNK and p38 signaling pathway-related proteins detected by Western blot.Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs CON group；##P＜0.01 vs LPS group.圖4 ERK1/2、JNK和p38信號通路相關蛋白表達情況

綜上所述，F(xiàn)PR2 通過MAPK/ERK 信號通路影響滋養(yǎng)細胞生物學功能，在CAM 中發(fā)揮重要作用，抑制FPR2的表達可以減輕滋養(yǎng)細胞的炎癥損傷，這可為臨床CAM的診治提供參考資料。