七氟烷對(duì)大鼠脊髓缺血再灌注損傷及Wnt/βcatenin信號(hào)通路的影響*

張 敏，康文越，邢丹丹，吳多志，林 慧

（海南省人民醫(yī)院，海南?？?570311）

脊髓缺血再灌注（spinal cord ischemia-reperfusion，SCIR）是胸腹主動(dòng)脈和脊柱手術(shù)的嚴(yán)重并發(fā)癥，可能導(dǎo)致癱瘓和截癱［1］。因此，尋找減少SCIR 損傷的策略很有必要。首先脊髓缺血造成其中的細(xì)胞缺血缺氧，隨后的再灌注導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載、炎癥反應(yīng)及氧自由基爆發(fā)，最終引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡、脊髓組織損傷及功能障礙［2］。七氟烷（sevoflurane，SEVO）為常用的麻醉誘導(dǎo)和維持藥劑［3］。近年研究顯示，SEVO 可通過抗凋亡、抑制自噬、抑制氧化應(yīng)激和抗炎等對(duì)肝［4］、大腦［5］、肺［6］及脊髓［7］等產(chǎn)生保護(hù)作用。目前，SEVO 對(duì)脊髓等中樞組織缺血性損傷的改善效果已被多項(xiàng)研究證實(shí)［5，8-9］，然而其機(jī)制主要集中于對(duì)凋亡、炎癥和氧化應(yīng)激等抑制的的探討，對(duì)脊髓中受損軸突的自我修復(fù)和再生的探討較少，而后者是神經(jīng)損傷后功能恢復(fù)的生理基礎(chǔ)［10］。Wnt/β-catenin 通路是進(jìn)化保守的經(jīng)典信號(hào)通路，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、生長、分化等過程，其活化可促進(jìn)視神經(jīng)［11］及脊髓［10］損傷后的軸突再生，實(shí)現(xiàn)對(duì)神經(jīng)損傷的緩解。然而SEVO 對(duì)SCIR 損傷后軸突再生的作用并不清楚，本研究擬采用胸主動(dòng)脈阻斷法建立SCIR 大鼠模型，觀察吸入SEVO 對(duì)SCIR 大鼠軸突再生和Wnt/β-catenin通路的影響，以探討其機(jī)制。

材料和方法

1 動(dòng)物

40 只雄性SPF 級(jí)SD 大鼠，6 周齡，體重180～200 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司［SCXK（京）-2016-0011］。在濕度為（40±5）%、溫度為（23.0±0.5）℃、光/暗循環(huán)為12 h/12 h 動(dòng)物房中飼養(yǎng)1周以適應(yīng)環(huán)境。

2 主要試劑

SEVO（吸入用）購自上海恒瑞醫(yī)藥有限公司；βcatenin 抑制劑XAV939（XAV）購自MCE；β-catenin、生長相關(guān)蛋白43（growth-associated protein 43，GAP43）和硫酸軟骨素蛋白聚糖NG2（chondroitin sulfate proteoglycan NG2，NG2）抗體購自Abcam；微管相關(guān)蛋白2（microtubule-associated protein 2，MAP2）抗體購自Invitrogen；神經(jīng)絲H（neurofilament-H，NFH）、髓磷脂堿性蛋白（myelin basic protein，MBP）、GAPDH 和lamin B 抗體，以及羊抗兔（Alexa Fluor?488、HRP）或小鼠（Alexa Fluor?594）IgG 購自Cell Signaling Technology；PVDF 膜和ECL 試劑購自Millipore；HE 試劑、TUNEL 凋亡試劑盒、Nissl 染色液、總及核蛋白提取試劑購自生工生物工程（上海）股份有限公司。小動(dòng)物生理記錄儀為iWorx產(chǎn)品。

3 主要方法

3.1 SCIR 模型建立［12］術(shù)前大鼠均禁食12 h，經(jīng)腹腔注射2%戊巴比妥鈉（2 mL/kg），麻醉后仰臥固定，切開左頸肌肉暴露總動(dòng)脈，置入24G 套管針并連接肝素處理的小動(dòng)物生理記錄儀和儲(chǔ)血裝置，將24 G套管針刺入尾動(dòng)脈并連接小動(dòng)物生理記錄儀，檢測(cè)遠(yuǎn)端動(dòng)脈壓。全身肝素化后，切開腹部肌肉暴露左髂總動(dòng)脈，置入球囊套管推至胸主動(dòng)脈開口，往套管中注入0.05 mL 生理鹽水，使球囊鼓起以阻斷主動(dòng)脈。遠(yuǎn)端動(dòng)脈壓＜10 mmHg 則表明阻斷成功。隨后立即撥動(dòng)三通閥，將約6 mL 血液流入儲(chǔ)血裝置，控制體循環(huán)平均動(dòng)脈壓為40 mmHg，實(shí)現(xiàn)脊髓缺血并維持9 min后，恢復(fù)主動(dòng)脈血流，實(shí)現(xiàn)脊髓再灌注。

3.2 動(dòng)物分組及給藥 隨機(jī)數(shù)字法將SCIR 大鼠分為SCIR 組、SEVO 組、SEVO+XAV 組，每組10 只，另外選取假手術(shù)（sham）組10 只。SEVO 組造模前吸入3 h 2.4% SEVO［8］；SEVO+XAV 組在吸入SEVO 前先鞘內(nèi)注射10μL 0.5 mmol XAV［13］；sham 組和SCIR 組同步吸入空氣并鞘內(nèi)注射生理鹽水。再灌注96 h后對(duì)所有大鼠進(jìn)行BBB評(píng)分［14］。

3.3 樣本采集 評(píng)分后，各組大鼠隨機(jī)取5 只，麻醉后斷頭取L4～L6 段脊髓，-80 ℃保存；余下5 只收集L4～L6 段脊髓，浸沒在包埋劑OCT 中速凍后，用恒溫冰凍切片機(jī)制備脊髓冰凍切片（每片10 μm），加入丙酮固定10 min。

3.4 HE、Nissl 和TUNEL 染色 取3.3 的脊髓冰凍切片，經(jīng)PBS沖洗后，分別加入HE染色試劑、Nissl染色試劑和TUNEL 試劑孵育，之后洗片、封片，光鏡下觀察脊髓組織形態(tài)及細(xì)胞凋亡、壞死情況。

3.5 免疫組化染色 取3.3 的脊髓冰凍切片，經(jīng)PBS 沖洗、羊血清封閉后，滴加Ⅰ抗（兔抗大鼠NF-H或MBP，稀釋比1∶500）4 ℃孵育過夜，滴加Ⅱ抗（稀釋比1∶2 000）孵育1 h，滴加二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色、蘇木素復(fù)染后封片，光鏡下拍照并計(jì)數(shù)。

3.6 免疫熒光染色 取3.3 的脊髓冰凍切片，經(jīng)PBS 沖洗、羊血清封閉后，滴加Ⅰ抗（兔抗大鼠GAP43 或MBP 和小鼠抗大鼠β-catenin，稀釋比1∶50）孵育3 h，滴加Ⅱ抗（羊抗兔Alexa Fluor?488 或羊抗小鼠Alexa Fluor?594 IgG，稀釋比1∶1 000）避光孵育1 h，回收Ⅱ抗，滴加抗熒光淬滅封閉液封片，熒光顯微鏡下拍照并計(jì)數(shù)。

3.7 Western blot 檢測(cè) 采用試劑盒提取脊髓組織（-80 ℃）中總蛋白和細(xì)胞質(zhì)、核蛋白。定量后，各組取20μg蛋白沸水浴變性，加樣，電泳完成后，將膠中蛋白電轉(zhuǎn)印到聚偏二氟乙烯膜上，將膜依次與封閉液（5%脫脂奶粉溶液）孵育1 h、Ⅰ抗（GAPDH、lamin B、GAP43、NF-H、MAP2、NG2、MBP 和β-catenin，稀釋比1∶1 000）4 ℃孵育過夜、Ⅱ抗（稀釋比1∶3 000）孵育1 h、化學(xué)發(fā)光液作用5 min 后，放在蛋白凝膠成像儀中拍照，分析各條帶灰度值。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 8.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）描述各項(xiàng)數(shù)據(jù)。單因素方差分析行多組間比較，SNK-q檢驗(yàn)行兩兩比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 SEVO對(duì)后肢功能評(píng)分的影響

sham 組各大 鼠BBB 評(píng)分均 為21.00；SCIR 組BBB 評(píng)分較sham 組顯著降低（P＜0.01）；SEVO 組BBB 評(píng)分較SCIR 組顯著升高（P＜0.01）；SEVO+XAV組BBB評(píng)分較SEVO組顯著降低（P＜0.01），見圖1。

Figure 1.The BBB score of the rats in each group.Mean±SD.n=10.**P＜0.01 vs sham group；△△P＜0.01 vs SCIR group；##P＜0.01 vs SEVO group.圖1 各組大鼠的BBB評(píng)分

2 SEVO對(duì)脊髓組織損傷的影響

sham 組脊髓組織中神經(jīng)纖維排列規(guī)則，未見腫脹或核固縮神經(jīng)細(xì)胞，凋亡細(xì)胞較少，尼氏小體較多；SCIR組脊髓組織有空洞，可見較多腫脹或核固縮的壞死或凋亡細(xì)胞，尼氏小體較少；SEVO 組脊髓組織損傷有所減輕，凋亡細(xì)胞減少，尼氏小體增多；SEVO+XAV 組脊髓組織損傷相比于SEVO 組加重，可見較多腫脹或核固縮的壞死或凋亡細(xì)胞，尼氏小體較少，見圖2。

Figure 2.HE staining，Nissl staining and TUNEL staining to observe the morphological changes of the spinal cord.The scale bar=100μm.圖2 HE染色、Nissl染色和TUNEL染色觀察脊髓組織形態(tài)

3 SEVO對(duì)脊髓軸突再生及髓鞘形成的影響

SCIR 組NF-H+和MBP+細(xì)胞數(shù)量顯著低于sham組（P＜0.01）；SEVO 組NF-H+和MBP+細(xì)胞數(shù)量顯著高于SCIR 組（P＜0.01）；SEVO+XAV 組NF-H+和MBP+細(xì)胞數(shù)量顯著低于SEVO組（P＜0.01），見圖3。

Figure 3.Immunohistochemical staining of spinal cord tissues.The scale bar=100 μm.A：NF-H staining（brown represents NF-H+cells）；B：MBP staining（brown represents MBP+ cells）.Mean±SD. n=10.**P＜0.01 vs sham group；△△P＜0.01 vs SCIR group；##P＜0.01 vs SEVO group.圖3 免疫組化法觀察脊髓組織再生情況

4 SEVO對(duì)軸突再生及髓鞘形成相關(guān)蛋白的影響

SCIR 組NF-H、MAP2 及MBP 蛋白水平顯著低于sham 組（P＜0.01），GAP43 和NG2 蛋白水平顯著高于sham 組（P＜0.01）；SEVO 組NF-H、MAP2、GAP43、NG2 及MBP 蛋白水平顯著高于SCIR 組（P＜0.01）；SEVO+XAV 組NF-H、MAP2、GAP43、NG2 及MBP 蛋白水平顯著低于SEVO組（P＜0.01），見圖4。

5 SEVO 調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路促進(jìn)SCIR大鼠軸突再生

免疫熒光結(jié)果顯示，β-catenin 和GAP43 基本共表達(dá)在同一細(xì)胞中，β-catenin 和MBP 也基本共表達(dá)于同一細(xì)胞。與sham 組相比，SCIR 組β-catenin+GAP43+細(xì)胞和β-catenin+MBP+細(xì)胞數(shù)量顯著減少，胞質(zhì)、胞核和總β-catenin 水平及胞核/胞質(zhì)β-catenin比例顯著降低（P＜0.01）；與SCIR組相比，SEVO組βcatenin+GAP43+細(xì)胞和β-catenin+MBP+細(xì)胞數(shù)量顯著增多，胞核和總β-catenin 水平及胞核/胞質(zhì)βcatenin 比例顯著升高（P＜0.01）；與SEVO 組相比，SEVO+XAV 組β-catenin+GAP43+細(xì)胞和β-catenin+MBP+細(xì)胞數(shù)量顯著減少，胞核和總β-catenin 水平及胞核/胞質(zhì)β-catenin 比例顯著降低（P＜0.01），見圖5、6。

討 論

Figure 4.Detection of protein levels of NF-H，MAP2，GAP43，NG2 and MBP by Western blot.Mean±SD. n=10.**P＜0.01 vs sham group；△△P＜0.01 vs SCIR group；##P＜0.01 vs SEVO group.圖4 Western blot檢測(cè)NF-H、MAP2、GAP43、NG2和MBP蛋白水平

Figure 5.Immunofluorescence staining of GAP43/MBP and β-catenin.A：immunofluorescence staining to observe the co-localization of GAP43 and β-catenin（green represents GAP43+ cells，while red represents β-catenin+ cells）；B：immunofluorescence staining to observe the co-localization of MBP and β-catenin（green represents MBP+ cells，while red represents β-catenin+cells）.Mean±SD. n=10.**P＜0.01 vs sham group；△△P＜0.01 vs SCIR group；##P＜0.01 vs SEVO group.圖5 GAP43、MBP及β-catenin免疫熒光染色

盡管SCIR 損傷的發(fā)生頻率較低，但會(huì)導(dǎo)致較高死亡率和致殘率，并降低生活質(zhì)量，因此也應(yīng)重視其防治。SCIR 時(shí)神經(jīng)元受到?jīng)_擊出現(xiàn)變性或壞死，伴隨組織損傷，表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹或核固縮變性壞死、尼氏體減少等［12］。尼氏體具有較強(qiáng)代謝功能，為神經(jīng)元功能的標(biāo)志物，當(dāng)神經(jīng)元受損時(shí)，尼氏體會(huì)減少或消失［15］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，SCIR 造成的神經(jīng)損傷還可引起后肢行為障礙［8］。本研究中，SCIR 大鼠脊髓神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)腫脹、核固縮變性壞死或凋亡，尼氏體減少等情況，且BBB 評(píng)分降低，表明成功構(gòu)建SCIR 模型。研究顯示，2.4%SEVO 預(yù)處理能有效改善SCIR大鼠神經(jīng)損傷［8］。本研究亦證實(shí)，2.4% SEVO 可顯著減輕SCIR 大鼠脊髓組織病變，提高BBB 評(píng)分，表明SEVO對(duì)SCIR神經(jīng)損傷有緩解作用。

Figure 6.Detection of protein levels of β-catenin by Western blot.Mean±SD. n=10.**P＜0.01 vs sham group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs SCIR group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs SEVO group.圖6 Western blot檢測(cè)β-catenin蛋白水平

SCIR可破壞脊髓神經(jīng)元軸突，影響神經(jīng)傳導(dǎo)，且可對(duì)鄰近組織造成級(jí)聯(lián)的繼發(fā)性傷害，進(jìn)一步導(dǎo)致傷害加重［15］。而促進(jìn)軸突生長、伸長和髓鞘再生，不僅有利于神經(jīng)元軸突的自我修復(fù)與再生，而且可重構(gòu)神經(jīng)傳導(dǎo)，恢復(fù)神經(jīng)功能［16］。Sachdeva 等［17］研究表明，增加生長相關(guān)蛋白GAP43的表達(dá)，可誘導(dǎo)軸突出芽、伸長，促進(jìn)軸突分支的生長，并引導(dǎo)新生軸突向損傷區(qū)域生長，重建損傷區(qū)軸突結(jié)構(gòu)和功能。在急性脊髓損傷中的研究顯示，NF-H 表達(dá)與髓軸突計(jì)數(shù)同步降低［18］，推測(cè)NF-H 可作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元軸突的標(biāo)志物，在軸突徑向生長中發(fā)揮作用。MAP2則特異性表達(dá)在軸突微管中，參與軸突伸長與分支［19］。另外，缺血等損傷后，少突膠質(zhì)祖細(xì)胞迅速增殖、分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞，向缺血損傷處遷移，包繞在新生軸突外緣形成髓鞘，對(duì)軸突具有支持和絕緣作用，有利于軸突連接的重建［20］。NG2 為少突膠質(zhì)祖細(xì)胞的標(biāo)志物，可反映髓鞘的再生程度，MBP為髓鞘的重要結(jié)構(gòu)蛋白，可反映髓鞘厚度。本研究中，SCIR 大鼠脊髓NF-H、MAP2 及MBP 蛋白水平降低，GAP43 和NG2 蛋白水平增高，提示SCIR 可造成大鼠脊髓神經(jīng)元軸突減少和髓鞘損傷，進(jìn)而減弱或消除神經(jīng)元之間的信號(hào)傳遞，導(dǎo)致后肢運(yùn)動(dòng)障礙，且軸突具有一定自我修復(fù)能力，但作用有限，不足以抵抗SCIR 損傷。而SEVO 干預(yù)可進(jìn)一步提高脊髓GAP43和NG2 蛋白水平，同時(shí)提高NF-H、MAP2、及MBP 蛋白水平，提示SEVO還可能通過促進(jìn)軸突和髓鞘的再生，實(shí)現(xiàn)對(duì)SCIR大鼠神經(jīng)功能的保護(hù)。

經(jīng)典Wnt/β-catenin 通路的活化通過β-catenin 核易位介導(dǎo)，β-catenin 在細(xì)胞中積累并轉(zhuǎn)移入核，可活化啟動(dòng)靶基因表達(dá)，提高神經(jīng)系統(tǒng)軸突分支、生長和重塑能力，是中樞神經(jīng)損傷后的自我修復(fù)機(jī)制［21］。研究［11］顯示，激活Wnt/β-catenin 通路可促進(jìn)小鼠視神經(jīng)的軸突再生和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活，促進(jìn)神經(jīng)恢復(fù)。Seo 等［22］在脊髓損傷中也觀察到Wnt/β-catenin 通路的這種神經(jīng)保護(hù)作用［22］。本研究中，SCIR 組βcatenin 和GAP43 基本共表達(dá)在同一細(xì)胞，β-catenin和MBP 也基本共表達(dá)于同一細(xì)胞，部分β-catenin+細(xì)胞未見GAP43或MBP表達(dá)，可能與SCIR造成神經(jīng)細(xì)胞軸突損傷，軸突標(biāo)記蛋白GAP43 或MBP 無法成功染色有關(guān)。且與sham 組相比，SCIR 組β-catenin+GAP43+細(xì)胞和β-catenin+MBP+細(xì)胞數(shù)量減少，胞質(zhì)、胞核及總β-catenin 水平降低，胞核/胞質(zhì)β-catenin 比例也降低，表明Wnt/β-catenin 通路活化程度較低，不能抵抗SCIR 造成的神經(jīng)細(xì)胞軸突損傷。藥物干預(yù)可激活Wnt/β-catenin 信號(hào)通路，促進(jìn)軸突再生，保護(hù)SCIR 損傷后的神經(jīng)傳導(dǎo)［23-24］。本研究觀察到SEVO具有類似作用，表現(xiàn)為增加β-catenin+GAP43+細(xì)胞和β-catenin+MBP+細(xì)胞數(shù)量，升高胞質(zhì)、胞核及總βcatenin 水平，胞核/胞質(zhì)β-catenin 比例也增高，且βcatenin 抑制劑XAV 可減弱SEVO 促軸突和髓鞘再生的作用及其對(duì)SCIR 后受損神經(jīng)的保護(hù)作用，提示激活Wnt/β-catenin 通路可能是SEVO 減輕SCIR 損傷的作用機(jī)制，有待更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)淖C明。

綜上所述，SEVO 可促進(jìn)軸突和髓鞘再生，緩解大鼠SCIR 神經(jīng)損傷，其機(jī)制可能與激活Wnt/βcatenin通路有關(guān)。