白細胞介素33通過增強炎癥反應加重脂多糖誘導的急性腎損傷*

付 陽，董一飛

（南昌大學第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，江西南昌 330006）

急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是一種常見危重癥，是指腎功能在短時間內(nèi)突然下降引起血清肌酐（serum creatinine，SCr）和血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）顯著升高的臨床綜合征，可由多種病因引起，如膿毒癥、休克和心肌梗死等［1-3］。AKI的發(fā)病率和死亡率在世界范圍內(nèi)呈逐漸升高趨勢，每年大約有近200 萬的病死率，造成嚴重的醫(yī)療安全問題［4］。一般來說，AKI 的病程是短程的，但長時間患病會引起腎臟功能障礙，并最終發(fā)展成為慢性腎?。╟hronic kidney disease，CKD）［5］。膿毒癥（sepsis）是引起AKI 的主要原因之一，會導致微血管功能障礙、炎癥和小管損傷等許多病理改變［6-7］。目前對AKI 的病理機制研究已很透徹，但臨床治療手段有限，因此，亟需尋找新的、有效的AKI治療方法。

白細胞介素33（interleukin-33，IL-33）是新近發(fā)現(xiàn)的一種細胞因子，屬于IL-1 家族，可由上皮細胞、巨噬細胞、平滑肌細胞、樹突狀細胞、間質(zhì)成纖維細胞等多種細胞合成分泌［8-12］。當IL-33 與其受體ST2結合后，能發(fā)揮多種生物學特性［13］。有報道指出，IL-33通過增強炎癥反應和增加微血管通透性加重脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的小鼠急性肺損傷［14］。而另有其它研究顯示，IL-33 在一些炎性疾病中具有保護作用［15］。目前，對IL-33 在炎性疾病中的確切作用機制仍不清晰，有待進一步研究。

本研究擬采用LPS 構建膿毒癥所致AKI 小鼠模型，探索IL-33在AKI中的作用及其可能的機制。

材料和方法

1 動物和試劑

6～8周齡雄性C57BL/6小鼠，體重（22±3）g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司；IL-33 購自Enzo Life Sciences；LPS購自Sigma；IL-1β、IL-6和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA 試劑盒購自Invitrogen；蛋白提取試劑盒購自蘇州碧云天生物技術研究中心；抗IL-1β、IL-6、TNF-α、核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）、IL-33 和核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）抗體均購自Abcam；相應Ⅱ抗購自Proteintech。

2 動物模型

小鼠飼養(yǎng)在南昌大學江西醫(yī)學院動物管理中心，光照/黑暗周期為12 小時，飲水和食物自由。飼養(yǎng)環(huán)境溫度保持在（22±3）℃，濕度保持在（54±6）%。小鼠適應性飼養(yǎng)環(huán)境約7 d。然后將小鼠隨機分為3組：（1）control組（n=8）：小鼠在整個實驗過程中均給予腹腔注射磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS），不使用其他試劑；（2）LPS 組（n=8）：小鼠腹腔注射等體積的PBS，6 h 后再注射LPS（10 mg/kg），24 h 后處死小鼠；（3）LPS+IL-33 組（n=8）：小鼠先腹腔注射IL-33（50 μg/kg），6 h 后再注射LPS（10 mg/kg），24 h 后處死小鼠。注射試劑的方式和劑量參照以前的研究［16-17］。小鼠處理流程總結見圖1。所有小鼠的處理均經(jīng)南昌大學第二附屬醫(yī)院動物管理委員會批準，實驗均按照相關指南和規(guī)定進行。

Figure 1.A summary of treatment procedure in mice.PBS：phosphate-buffered saline；LPS：lipopolysaccharide；IL-33：interleukin-33.圖1 小鼠處理流程總結示意圖

3 SCr和BUN測定

處死小鼠后，用真空管從右心室取得全血。然后用離心機在4 ℃、4 000×g離心30 min，提取出血清。采用BS-800化學分析儀（邁瑞公司）自動檢測各組腎損傷標志物SCr和BUN水平。

4 ELISA法檢測血清中炎癥因子水平

血清中炎癥因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平的檢測采用相應的ELISA 試劑盒。具體操作流程按試劑盒提供的實驗說明進行。

5 HE染色

收集的腎組織立即用4%甲醛固定，經(jīng)酒精脫水后，采用石蠟包埋（5μm），然后用蘇木精/伊紅染色，最后用光學顯微鏡觀察組織切片。腎損傷評分用于評估腎損傷程度。

6 Western blot法檢測相應蛋白表達變化

采用蛋白提取試劑盒提取腎組織的總蛋白溶液，按比例將總蛋白溶液和上樣緩沖液均勻混合，置于100 ℃水中10 分鐘使其變性，蛋白上樣量為50μg。使用10%的SDS-PAGE 分離總蛋白，然后將分離的蛋白通過轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜上，最后用5%的牛奶封閉該膜1 h。特定的蛋白條帶采用相應的一抗在4 ℃冰箱中孵育約24 h，取出后用相應的二抗在室溫條件下孵育約1 h。最后，使用增強型化學發(fā)光檢測試劑盒和相應的掃描儀來檢測蛋白質(zhì)條帶。

7 統(tǒng)計學分析

采用GraphPad Prism 7.0 軟件進行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1 LPS能增加腎組織中IL-33的表達

如圖2 所示，小鼠腎組織IL-33 蛋白表達水平在LPS 刺激后顯著增加。該結果證明，IL-33 的表達與LPS的刺激密切相關。

Figure 2.The protein expression of interleukin-33（IL-33）was markedly up-regulated by stimulation of lipopolysaccharide（LPS）.The protein expression of IL-33 was detected by Western blot.Mean±SD. n=8.**P＜0.01 vs control group.圖2 LPS能增加小鼠腎組織中IL-33的表達

2 IL-33預處理顯著加重LPS誘導的AKI

如圖3A、B所示，與control組相比，LPS組中小鼠BUN 和SCr 水平在LPS 刺激后顯著升高；而給予IL-33 預處理后，LPS+IL-33 組小鼠BUN 和SCr 水平進一步升高，表明IL-33 預處理可明顯加重LPS 刺激引起的AKI。同時，ELISA 檢測結果如圖3C～E 所示，血清中炎癥因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平變化與BUN 和SCr 的變化一致，說明IL-33 預處理能明顯加重LPS刺激引起的全身炎癥反應。上述結果提示，IL-33 預處理可顯著加重LPS誘導的AKI。

3 IL-33預處理加重LPS所致小鼠腎組織病理損傷

如圖4 所示，與control 組相比，LPS 組小鼠腎組織結構明顯被破壞，腎組織水腫明顯，而IL-33 預處理顯著增強了LPS 的腎損傷作用。該結果提示，IL-33 預處理能顯著加重LPS 刺激所致的腎組織病理損傷。

4 IL-33預處理通過增強炎癥反應加重LPS誘導的AKI

如圖5 所示，與control 組相比，LPS 組小鼠腎組織中炎癥因子（IL-1β、IL-6、TNF-α 和NLRP3）表達水平顯著升高，而給予IL-33 預處理后，小鼠腎組織中炎癥因子（IL-1β、IL-6、TNF-α 和NLRP3）表達水平進一步升高。上述結果表明IL-33 預處理可通過增強炎癥反應進一步加重LPS誘導的AKI。

5 IL-33預處理通過進一步激活NF-κB信號通路增強炎癥反應

如圖6 所示，與control 組相比，LPS 組小鼠腎組織NF-κB p65 磷酸化水平顯著升高，而IL-33 預處理后NF-κB p65 磷酸化水平進一步升高。這一結果表明，IL-33 預處理可能是通過進一步激活NF-κB 信號通路增強炎癥反應。

討 論

AKI 是一種以腎功能損害為特征的復雜性疾病。根據(jù)之前的研究顯示，急性腎功能衰竭（acute kidney failure，AKF）的主要病因是膿毒癥，而膿毒癥與AKI 的結合使AKF 的死亡率從45%顯著提高到70%［1，18］。此外，越來越多的證據(jù)表明AKI 患者在長期可能發(fā)展成為CKD［5］。然而，迄今為止尚無有效的AKI 治療策略，所有亟需我們進一步探索膿毒性AKI的發(fā)病機制，并研究新的預防和治療措施。

Figure 3.Pretreatment with interleukin-33（IL-33）aggravated the renal dysfunction and systemic inflammation of acute kidney injury mice induced by lipopolysaccharide（LPS）.A and B：the levels of renal injury biomarkers，blood urea nitrogen（BUN）and serum creatinine（SCr）；C，D and E：the serum levels of inflammatory cytokines，IL-1β，IL-6 and tumor nwcrosis factor-α（TNF-α），were assessed by ELISA kits.Mean±SD. n=8.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs LPS group.圖3 IL-33預處理加重LPS誘導的AKI小鼠腎功能不全和全身炎癥反應

Figure 4.Pretreatment with interleukin-33（IL-33）aggravated the histopathological injury of kidney tissues induced by lipopolysaccharide（LPS）.Mean±SD. n=8.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs LPS group.圖4 IL-33預處理加重LPS所致腎組織病理損傷

IL-33，也被稱為IL-1F11 和NF-HEV，于2005 年首次被確定為IL-1 家族的新成員［19-20］。與傳統(tǒng)的細胞因子不同，IL-33 對炎癥反應具有雙重作用，這主要是由于IL-33 的不同存在形式（如細胞內(nèi)核因子或細胞因子）［21］。當IL-33 作為細胞內(nèi)核因子時，它可以隔離轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，從而抑制NF-κB 表達，最終減輕炎癥反應［22］。而作為細胞因子時，IL-33 可通過與ST2 受體結合來調(diào)節(jié)免疫應答。IL-33 和ST2 受體結合對不同T 細胞的分化和功能產(chǎn)生顯著影響，尤其是調(diào)節(jié)2 型免疫應答。例如，IL-33 可以增加Th2免疫細胞的數(shù)量，并促進Th2 細胞的細胞因子或趨化因子的過度表達，如IL-13、IL-9 和IL-5［23］。IL-33還可以促進Th1 細胞和CD8+細胞毒性T 淋巴細胞的擴增，表現(xiàn)出抗病毒作用［24-25］。另據(jù)報道，IL-33 可通過增強炎癥反應從而加重LPS 誘導的小鼠急性肺損傷［14］。而其他一些研究表明，IL-33 在某些炎癥性疾病中具有保護作用［15］。因此，IL-33 的確切作用機制仍不明確。在本研究中，我們探討了IL-33 對LPS 誘導的小鼠AKI的影響。

Figure 5.Pretreatment with interleukin-33（IL-33）enhanced renal inflammation induced by lipopolysaccharide（LPS）.The protein expression of IL-1β，IL-6，tumor nwcrosis factor-α（TNF-α）and nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3（NLRP3）in kidney tissues was detected by Western blot.Mean±SD. n=8.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs LPS group.圖5 IL-33預處理能增強炎癥反應，進一步加重LPS誘導的AKI

Figure 6.Pretreatment with interleukin-33（IL-33）enhanced inflammation by expediting the activation of nuclear factor-κB（NF-κB）signaling pathway.Mean±SD. n=8.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs lipopolysaccharide（LPS）group.圖6 IL-33預處理通過進一步激活NF-κB信號通路增強炎癥反應

在本研究中，我們探討了IL-33 對LPS 刺激引起AKI 的影響，并進一步深入研究了其可能存在的分子機制。多項研究表明，IL-33 的表達與LPS 的刺激密切相關，我們的研究再次證實了IL-33 的表達與LPS 的刺激密切相關。我們構建了LPS 刺激誘導的AKI模型小鼠，以IL-33預處理后，血清BUN和SCr水平進一步升高，表明IL-33 能使LPS 所致AKI 的腎功能進一步受損。同時，IL-33 預處理后，血清中IL-1β、IL-6 和TNF-α 等炎癥因子水平也進一步增加，表明IL-33 能明顯加重LPS 刺激引起全身炎癥反應。HE染色結果顯示，LPS刺激破壞了腎臟結構，腎組織出現(xiàn)水腫，而IL-33 預處理進一步增強了這種作用。我們還發(fā)現(xiàn)，IL-33 預處理顯著加重了AKI 的炎癥水平，表現(xiàn)為炎癥因子如IL-1β、IL-6、TNF-α 和NLRP3的蛋白表達水平比單純LPS 刺激增加更為顯著。最后，我們研究了IL-33 在NF-κB 信號通路中的作用，結果表明，IL-33 預處理可進一步激活NF-κB 信號通路。所有這些數(shù)據(jù)表明，IL-33 可通過增強炎癥反應加重LPS誘導的AKI，其分子機制可能是進一步激活了腎臟NF-kB信號通路。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)IL-33 對LPS 誘導的AKI具有加重損傷的作用。進一步研究提示IL-33 能通過促進炎癥反應加重LPS誘導的AKI，其分子機制可能是進一步促進了腎臟NF-kB 信號通路的激活。本研究提示IL-33 可能成為膿毒癥所致AKI 或者其他腎臟炎性疾病的新干預靶點。