SENP3對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞泡沫化的影響*

邵路瑤，劉 媛，殷妮娜

（湖北中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北武漢 430065）

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是心血管系統(tǒng)常見(jiàn)疾病，是冠心病、腦梗死和外周血管病的主要原因［1］。近年來(lái)有學(xué)者開(kāi)始認(rèn)可斑塊本質(zhì)上是泡沫細(xì)胞、免疫細(xì)胞、膽固醇晶體和平滑肌細(xì)胞在炎癥因子影響下的增殖和積累［2］。而其中內(nèi)膜巨噬細(xì)胞聚集和泡沫細(xì)胞形成是AS 最主要的病變特征［3］，因此如何抑制泡沫細(xì)胞的形成或成為治療AS的關(guān)鍵。

小泛素樣修飾物（small ubiquitin-like modifier，SUMO）/sentrin 特異性蛋白酶3（SUMO/sentrin-specific protease 3，SENP3）是SENPs 家族的一員，介導(dǎo)去除底物的SUMO 修飾，主要偏向于去除SUMO2/3 蛋白修飾［4］。SUMO 修飾是一個(gè)動(dòng)態(tài)可逆的過(guò)程，SENPs去除底物的SUMO 修飾可以影響底物的結(jié)構(gòu)、定位和活性，從而影響其生物學(xué)效應(yīng)。SENP3 是SUMO蛋白酶家族中對(duì)氧化應(yīng)激最敏感的一種，在細(xì)胞氧化刺激（如H2O2處理）后，細(xì)胞內(nèi)SENP3 蛋白水平和分布迅速發(fā)生變化［5］，幫助調(diào)控氧化應(yīng)激后細(xì)胞內(nèi)蛋白SUMO 修飾情況。而氧化應(yīng)激也被認(rèn)為是造成細(xì)胞泡沫化的一個(gè)重要因素，大量活性氧（reactive oxygen species，ROS）使低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）發(fā)生氧化形成氧化型LDL（oxidized LDL，ox-LDL），被巨噬細(xì)胞攝取后使其成為泡沫細(xì)胞［6］。

炎癥小體是天然免疫中胞漿內(nèi)模式識(shí)別受體參與組裝的多蛋白復(fù)合物，包括核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白1［nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor（NLR）protein 1，NLRP1］、NLRP3、NLRC4（NLR family caspase recruitment domain containing 4）和AIM2（absent in melanoma 2）等可在ASC（apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain）的協(xié)調(diào)下招募pro-caspase-1激活剪切為成熟的caspase-1，進(jìn)而切割白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-18 的前體，分泌相應(yīng)的成熟炎癥因子而發(fā)揮作用［7］。細(xì)胞泡沫化過(guò)程中，炎癥小體激活和分泌產(chǎn)生的炎癥因子IL-1β發(fā)揮重要的促進(jìn)作用，而SENP3也被發(fā)現(xiàn)可以調(diào)控炎癥信號(hào)的激活，使促炎因子產(chǎn)生［8-9］。SENP3 與細(xì)胞泡沫化的關(guān)系尚未有報(bào)道，考慮到SENP3與氧化應(yīng)激、炎癥之間的聯(lián)系，那么SENP3可否影響泡沫細(xì)胞的形成？是否可能成為治療AS 的潛在研究方向？鑒于此，本研究采用ox-LDL 誘導(dǎo)小鼠RAW264.7 和人源THP-1 巨噬細(xì)胞形成泡沫細(xì)胞，觀察過(guò)表達(dá)和敲減SENP3對(duì)泡沫細(xì)胞形成的影響，同時(shí)探索可能的分子機(jī)制，試圖為AS 的治療提供參考資料。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)材料和試劑

人源THP-1單核-巨噬細(xì)胞和小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞（中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心）；HEK293T 細(xì)胞（武漢普諾賽生命科技有限公司）。RPMI-1640 培養(yǎng)液和胎牛血清（Gibco）；DMEM 培養(yǎng)液（HyClone）；人源ox-LDL（廣州奕源生物科技有限公司）；佛波酯（phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA）和嘌呤霉素（北京索萊寶科技有限公司）；質(zhì)粒小提試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；脂肪酸和脂質(zhì)代謝試劑盒（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）；油紅O 染料（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）；人IL-1β ELISA試劑盒（BD）；RIPA 裂解液（弱）和BCA 蛋白含量測(cè)定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；兔抗SENP3 單克隆抗體（Cell Signaling Technology）；兔抗caspase-1 單克隆抗體（Abcam）；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）。

2 主要方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 選取被國(guó)內(nèi)外學(xué)者廣泛應(yīng)用于研究巨噬細(xì)胞相關(guān)功能的人單核細(xì)胞株THP-1 和小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7。將THP-1 細(xì)胞置于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的THP-1 細(xì)胞，用含100 μg/L PMA 的培養(yǎng)液重新鋪板于6 孔板，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中分化24 h，之后更換含10%胎牛血清的新鮮培養(yǎng)液即得人源巨噬細(xì)胞。小鼠RAW264.7 巨噬細(xì)胞則在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5%CO2條件下恒溫培養(yǎng)。

2.2 巨噬細(xì)胞泡沫化模型的構(gòu)建 將獲得的巨噬細(xì)胞更換新鮮的DMEM 培養(yǎng)液，參考文獻(xiàn)報(bào)道［10］對(duì)誘導(dǎo)THP-1 細(xì)胞泡沫化的ox-LDL 濃度實(shí)驗(yàn)結(jié)果，加入終濃度為100 mg/L 的ox-LDL，共同孵育24 h，油紅O 染色后，鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)充滿橘紅色脂滴，成功得到泡沫細(xì)胞模型。

2.3 慢病毒載體的構(gòu)建和穩(wěn)定細(xì)胞系篩選 按照課題組前期研究中的方法構(gòu)建慢病毒載體并篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系［8］。其中干擾小鼠SENP3基因表達(dá)的sh-SENP3 序列為5'-GATGCGGAAGCTCTTCAGTTTCA-3'，將sh-SENP3 和無(wú)意義對(duì)照序列sh-NC 構(gòu)建到pLKO.1 慢病毒載體上，將人源SENP3基因構(gòu)建到pLenti 慢病毒載體上，兩者分別感染RAW264.7 和THP-1 細(xì)胞，嘌呤霉素篩選后獲得穩(wěn)定敲減及過(guò)表達(dá)的細(xì)胞系。擴(kuò)增慢病毒：待HEK293T 細(xì)胞在10 cm 板生長(zhǎng)密度至70%左右，用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染質(zhì)粒（pMD2.G 2.5 μg，pSPAX2 7.5μg，構(gòu)建好的慢病毒目標(biāo)質(zhì)粒10 μg）；48 和72 h 后收集病毒上清液，離心去除細(xì)胞碎片。慢病毒感染細(xì)胞：細(xì)胞培養(yǎng)到密度為80%左右，將慢病毒上清液加入Polybrene 至終濃度為6 mg/L，感染細(xì)胞。篩選：感染后24 h 細(xì)胞換液，48 h 加入1.5 mg/L 嘌呤霉素進(jìn)行篩選；篩選的過(guò)程每隔2～3 d 換液一次，去除死細(xì)胞，維持抗生素濃度直到細(xì)胞不再死亡。篩選得到的穩(wěn)定細(xì)胞系使用含0.5 mg/L 嘌呤霉素的完全培養(yǎng)液培養(yǎng)、傳代。

細(xì)胞分為4組：pLenti-SENP3組（SENP3過(guò)表達(dá)的THP-1 細(xì)胞）、pLenti-CT 組（對(duì)照THP-1 細(xì)胞）、sh-SENP3 組（SENP3敲減的RAW264.7 細(xì)胞）和sh-NC對(duì)照組（對(duì)照RAW264.7 細(xì)胞）。在細(xì)胞泡沫化模型中，ox-LDL刺激為建立泡沫化模型，mock為未刺激。

2.4 油紅O 染色檢測(cè)脂滴 泡沫細(xì)胞建模結(jié)束后，吸去上清液，用PBS 洗2 次。預(yù)冷的4%多聚甲醛固定15 min，PBS 洗2 次。加入新鮮配制的油紅O 染液染色15 min，再用PBS 洗2次，觀察染色情況，不佳可復(fù)染。60%異丙醇漂洗數(shù)秒，分化30 s。蘇木素復(fù)染2 min，加PBS漂洗并觀察染色結(jié)果。0.5%鹽酸乙醇分色數(shù)秒，適量PBS覆蓋底板。置顯微鏡下觀察并拍攝油紅O染色結(jié)果，細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)為紅色，胞核為藍(lán)色。

2.5 酶法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量［11］取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的SENP3過(guò)表達(dá)和對(duì)照組細(xì)胞，以每孔2×106個(gè)接種于6孔板，設(shè)置復(fù)孔；按照膽固醇酶法檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，并取適量細(xì)胞上清液用于BCA 蛋白濃度測(cè)定；使用酶標(biāo)儀測(cè)量各孔于550 nm 處的吸光度（A550）；將各標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品的A550值減去空白標(biāo)準(zhǔn)品的A550值即為校正后的A550值；以校正后的標(biāo)準(zhǔn)品A550值與其對(duì)應(yīng)的濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算各待測(cè)樣品的膽固醇濃度；用蛋白濃度校正膽固醇含量。膽固醇酯（cholesterol ester，CE）含量=總膽固醇（total cholesterol，TC）含量-游離膽固醇（free cholesterol，F(xiàn)C）含量；膽固醇酯化率（cholesterol esterification rate，CER；%）=CE/TC×100%。

2.6 Western blot 檢測(cè)細(xì)胞pro-caspase-1、caspase-1和SENP3 蛋白量 收集細(xì)胞樣品后，加入適量RIPA細(xì)胞裂解液和蛋白酶抑制劑混合物，4 ℃旋轉(zhuǎn)混合儀上旋轉(zhuǎn)裂解30 min 后，10 000×g離心10 min 吸取上清為細(xì)胞裂解液樣品。配制SDS-PAGE 膠，上樣，電泳。轉(zhuǎn)膜：將電泳后的膠取出，用1×轉(zhuǎn)膜液浸泡，置搖床搖30 min。在轉(zhuǎn)膜儀的底板上依次鋪好厚濾紙、膠、PVDF 膜和厚濾紙，95 V 轉(zhuǎn)膜75 min。封閉：取出PVDF膜，做標(biāo)記后，蛋白面朝上用1×TBST漂洗30 s，5%脫脂牛奶封閉液封閉30 min；孵育Ⅰ抗：倒掉封閉液，加入用1×TBST 稀釋的Ⅰ抗，搖床上4 ℃過(guò)夜；孵育Ⅱ抗：用1×TBST 洗膜液洗3 次，每次10 min，加入1×TBST 稀釋的Ⅱ抗室溫孵育1 h，1×TBST洗3 次×10 min；ECL 化學(xué)發(fā)光試劑顯影，凝膠成像儀系統(tǒng)呈像；以GAPDH 為內(nèi)參照，使用Image Lab 軟件進(jìn)行蛋白條帶灰度分析。

2.7 ELISA 檢測(cè)分泌IL-1β 含量 收集細(xì)胞上清，按照ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。從平衡至室溫的密封袋中取出實(shí)驗(yàn)所需板條，留空白孔。稀釋適宜濃度后加樣品于反應(yīng)孔中，置于37 ℃孵育120 min。然后洗板5 次。于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的生物素化抗體工作液0.1 mL，37 ℃孵育1 h，洗板5 次。加酶結(jié)合工作液0.1 mL，37 ℃避光孵育30 min，洗板5 次。加入0.1 mL 顯色底物液，37 ℃避光孵育15 min；于各反應(yīng)孔中加入終止液0.1 mL，混勻后即可測(cè)量A450值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 SENP3過(guò)表達(dá)抑制THP-1源性巨噬細(xì)胞泡沫化

Western blot 結(jié)果顯示，pLenti-SENP3 組THP-1源性巨噬細(xì)胞SENP3 蛋白表達(dá)量約為pLenti-CT 組的6.38 倍，有顯著增加（P＜0.05），提示穩(wěn)定過(guò)表達(dá)SENP3 的細(xì)胞系構(gòu)建成功，見(jiàn)圖1A。油紅O 染色結(jié)果顯示，ox-LDL 刺激相較于mock 未刺激THP-1 源性巨噬細(xì)胞胞漿內(nèi)有顯著增多、變大的亮紅色脂滴，呈典型泡沫細(xì)胞形態(tài)，表明ox-LDL 有效誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向泡沫細(xì)胞轉(zhuǎn)化；ox-LDL 刺激后，與pLenti-CT 對(duì)照組比較，pLenti-SENP3 組THP-1 源性巨噬細(xì)胞胞漿內(nèi)紅色脂滴均顯著減少、變小，泡沫細(xì)胞陽(yáng)性率顯著降低，見(jiàn)圖1B。

2 SENP3 過(guò)表達(dá)抑制THP-1 源性巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積

Figure 1.Effect of SENP3 overexpression on foam cell formation from THP-1 macrophages.A：the expression level of SENP3 was assessed by Western blot analysis in pLenti-SENP3 and pLenti-CT groups；B：the number and volume of lipid droplets in cells were detected by oil red O staining（scale bar=50μm）.Mean±SD. n=4.*P＜0.05 vs pLenti-CT group.圖1 SENP3過(guò)表達(dá)對(duì)THP-1源性巨噬細(xì)胞泡沫化的影響

與mock 未刺激細(xì)胞相比，經(jīng)ox-LDL 刺激后pLenti-CT 組THP-1 源性巨噬細(xì)胞內(nèi)TC 含量、CE 含量及CER 均顯著升高（P＜0.01），F(xiàn)C 含量無(wú)顯著差異，且CER 大于50%，提示THP-1 源性巨噬細(xì)胞經(jīng)ox-LDL 刺激后泡沫細(xì)胞模型構(gòu)建成功；在ox-LDL 刺激后，相對(duì)于pLenti-CT 組，pLenti-SENP3 組THP-1 源性巨噬細(xì)胞內(nèi)TC 含量、CE 含量及CER 均顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01），F(xiàn)C 含量無(wú)顯著差異；而細(xì)胞未刺激時(shí)，SENP3 過(guò)表達(dá)組與對(duì)照組細(xì)胞各項(xiàng)數(shù)值均無(wú)顯著差異，見(jiàn)表1。

表1 細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量Table 1.The levels of intracellular cholesterol（Mean±SD. n=3）

3 敲減SENP3促進(jìn)RAW264.7巨噬細(xì)胞泡沫化

Western blot 結(jié)果顯示，sh-SENP3 組RAW264.7巨噬細(xì)胞SENP3 蛋白表達(dá)量較sh-NC 對(duì)照組顯著下降（P＜0.01），提示穩(wěn)定敲減SENP3表達(dá)的細(xì)胞系構(gòu)建成功，見(jiàn)圖2A。油紅O 染色結(jié)果顯示，相較于mock 未處理組，ox-LDL 刺激后RAW264.7 巨噬細(xì)胞胞漿內(nèi)有顯著增多、變大的亮紅色脂滴，呈典型泡沫細(xì)胞形態(tài)；ox-LDL 刺激后，與sh-NC 對(duì)照組比較，SENP3敲減表達(dá)后細(xì)胞胞漿內(nèi)亮紅色脂滴顯著增多、變大，見(jiàn)圖2B。

4 巨噬細(xì)胞泡沫化過(guò)程中SENP3表達(dá)量下降

Western blot 結(jié)果顯示，與0 h 相比，THP-1 源性巨噬細(xì)胞中SENP3 的蛋白表達(dá)量在ox-LDL 刺激6 h時(shí)無(wú)顯著差異（P＞0.05），而ox-LDL 刺激12 h 和24 h時(shí)SENP3 的蛋白表達(dá)量顯著下降（P＜0.05 或P＜0.01），見(jiàn)圖3。

5 巨噬細(xì)胞泡沫化過(guò)程中SENP3 過(guò)表達(dá)抑制procaspase-1的剪切

Western blot 結(jié)果顯示，ox-LDL 刺激后，與pLenti-CT 組比較，SENP3 過(guò)表達(dá)組THP-1 源性巨噬細(xì)胞內(nèi)pro-caspase-1 表達(dá)量無(wú)顯著差異（P＞0.05），而剪切產(chǎn)生的caspase-1 剪切體（p20）的蛋白量顯著下降（P＜0.01），見(jiàn)圖4。

6 巨噬細(xì)胞泡沫化過(guò)程中SENP3 過(guò)表達(dá)抑制IL-1β的分泌

Figure 2.Effect of SENP3 knockdown on foam cell formation from RAW264.7 macrophages.A：the protein expression level of SENP3 was assessed by Western blot analysis in sh-SENP3 and sh-NC groups；B：the number and volume of lipid droplets in cells were detected by oil red O staining（scale bar=50μm）.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs sh-NC group.圖2 敲減SENP3對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞泡沫化的影響

Figure 3.Changes of SENP3 expression level during foam cell formation from THP-1 macrophages.The protein expression level of SENP3 was assessed by Western blot.Mean±SD. n=4.*P＜0.05，**P＜0.01 vs 0 h.圖3 巨噬細(xì)胞泡沫化過(guò)程中SENP3蛋白表達(dá)量的變化

ELISA 結(jié)果顯示，ox-LDL 刺激后，與plenti-CT 組比較，SENP3 過(guò)表達(dá)組THP-1 源性巨噬細(xì)胞分泌的IL-1β蛋白量顯著減少（P＜0.05），見(jiàn)圖5。

討 論

巨噬細(xì)胞脂質(zhì)代謝紊亂失衡和細(xì)胞泡沫化形成是加劇AS 發(fā)生發(fā)展的重要因素［12］。ox-LDL 是巨噬細(xì)胞泡沫化過(guò)程中膽固醇的主要來(lái)源，并且能夠加劇膽固醇在巨噬細(xì)胞內(nèi)沉積，轉(zhuǎn)化形成泡沫細(xì)胞。泡沫細(xì)胞除了促使血管局部形成脂質(zhì)池，加速AS 斑塊形成外，還可以分泌大量細(xì)胞因子等炎癥介質(zhì)，促進(jìn)斑塊局部發(fā)生炎癥反應(yīng)，降低斑塊穩(wěn)定性，引起斑塊破裂、脫落［13-14］。本研究使用100 mg/L 的ox-LDL刺激巨噬細(xì)胞24 h，通過(guò)油紅O 染色顯示模型組細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)大量紅色顆粒，表明細(xì)胞內(nèi)存在大量脂質(zhì)沉積和脂滴，符合泡沫細(xì)胞形態(tài)。同時(shí)，泡沫化的細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積增加，尤以CE 為主，一般CER 大于50%則認(rèn)為符合泡沫細(xì)胞的改變，本研究中膽固醇含量測(cè)定結(jié)果顯示模型組細(xì)胞中CER 為（62.7±1.3）%。兩項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果都顯示本研究泡沫細(xì)胞模型構(gòu)建成功，從而模擬AS 病變過(guò)程中膽固醇沉積和泡沫細(xì)胞形成這一重要早期表征。

SENP3 作為SENPs 家族成員之一，其作用至關(guān)重要，國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道其在腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，同時(shí)對(duì)神經(jīng)疾病及心肌缺血再灌注也有影響，SENP3基因敲除可造成小鼠早期胚胎的死亡［15-16］。SENP3 與巨噬細(xì)胞泡沫化及AS 的關(guān)系此前未有報(bào)道，本研究中初次驗(yàn)證SENP3 對(duì)巨噬細(xì)胞泡沫化有顯著抑制作用，在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)水平上提供了SENP3 在AS 中可能發(fā)揮作用的證據(jù)，但是仍然缺乏更有依據(jù)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究。本課題組下一步擬通過(guò)小鼠尾部注射慢病毒sh-SENP3敲減SENP3表達(dá)，觀察SENP3 對(duì)小鼠AS 疾病模型的影響，進(jìn)一步探索SENP3是否有望成為治療AS的潛在靶點(diǎn)。

Figure 4.Effect of SENP3 overexpression on caspase-1（Casp-1）cleavage during foam cell formation from THP-1 macrophages.The protein levels of SENP3，pro-Casp-1 and Casp-1（p20）were assessed by Western blot.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs pLenti-CT ox-LDL group.圖4 巨噬細(xì)胞泡沫化過(guò)程中SENP3過(guò)表達(dá)對(duì)caspase-1剪切的影響

Figure 5.Effect of SENP3 overexpression on IL-1β secretion during foam cell formation from THP-1 macrophages.The secretion of IL-1β in the cell culture supernatants was analyzed by ELISA.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs pLenti-CT ox-LDL group.圖5 巨噬細(xì)胞泡沫化過(guò)程中SENP3 過(guò)表達(dá)對(duì)IL-1β 分泌的影響

膽固醇在細(xì)胞內(nèi)以FC 及CE 兩種形式存在，二者存在著動(dòng)態(tài)平衡，多余的FC 將轉(zhuǎn)化為CE 并儲(chǔ)存于細(xì)胞內(nèi)的脂滴中，從而避免過(guò)量的FC 對(duì)細(xì)胞造成損傷，減少CE 在胞內(nèi)的沉積是抑制泡沫細(xì)胞形成的關(guān)鍵［17］。本研究中SENP3可顯著降低巨噬細(xì)胞泡沫化過(guò)程中胞內(nèi)TC 含量，對(duì)胞內(nèi)CE 含量的抑制則更加顯著，從而降低CER，但對(duì)于FC 含量沒(méi)有顯著影響，說(shuō)明SENP3主要通過(guò)抑制CE 沉積抑制巨噬細(xì)胞泡沫化。

SENP3 在細(xì)胞內(nèi)的濃度水平受ROS 的調(diào)控，少量的ROS 誘導(dǎo)SENP3 發(fā)生細(xì)胞內(nèi)功能增強(qiáng)［5］，而大量的ROS 可造成SENP3 活性喪失［18］。本研究中SENP3 蛋白表達(dá)量隨ox-LDL 刺激時(shí)間增加顯著下降。大量ROS 造成SENP3 活性喪失，同時(shí)可以使LDL 發(fā)生氧化形成ox-LDL，ox-LDL 刺激則又可以抑制SENP3 的表達(dá)。在體內(nèi)ROS 或ox-LDL 誘導(dǎo)的泡沫細(xì)胞形成過(guò)程中，SENP3 很有可能作為一種抑制性因子被下調(diào)表達(dá)或被抑制活性。

炎癥小體的激活產(chǎn)生炎癥因子IL-1β 和IL-18，由此造成的慢性炎癥可以加速細(xì)胞泡沫化：IL-1β 通過(guò)抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)分解代謝可促進(jìn)泡沫細(xì)胞的形成［9］；抑制NLRP3炎癥小體激活可以抑制巨噬細(xì)胞ox-LDL 的攝取，并增強(qiáng)膽固醇流出以減少泡沫細(xì)胞形成［19］；微小RNA-497-5p（microRNA-497-5p，miR-497-5p）下調(diào)NLRP1抑制巨噬細(xì)胞IL-1β 的分泌并促進(jìn)膽固醇流出，從而抑制細(xì)胞泡沫化［20］。本課題組前期研究顯示，SENP3可以通過(guò)特異性去SUMO化修飾NLRP3 而抑制炎癥小體的激活和IL-1β 的產(chǎn)生［8］。本研究顯示，SENP3 可以抑制巨噬細(xì)胞泡沫化過(guò)程中pro-caspase-1的剪切和IL-1β的分泌。于是我們提出如下假說(shuō)：SENP3很可能利用其SUMO蛋白酶的活性，通過(guò)去SUMO化修飾NLRP3，抑制炎癥小體激活，從而抑制巨噬細(xì)胞泡沫化。雖然炎癥小體的激活主要是NLRP3 蛋白發(fā)揮作用，但受體蛋白也有可能是NLRP1和AIM2等多種蛋白，SENP3是否也可以通過(guò)去SUMO化修飾其他受體蛋白發(fā)揮作用，目前還不清楚。本研究不能確定具體是哪種炎癥小體通路發(fā)揮作用，進(jìn)一步可能需要檢測(cè)巨噬細(xì)胞泡沫化過(guò)程中SENP3 對(duì)于幾種受體蛋白的mRNA 水平、蛋白表達(dá)水平或SUMO化修飾水平的調(diào)控來(lái)驗(yàn)證。

綜上所述，本研究表明SENP3 蛋白對(duì)巨噬細(xì)胞泡沫化有顯著抑制作用，其作用機(jī)制可能通過(guò)抑制炎癥小體的激活及促炎因子IL-1β 的釋放。由于巨噬細(xì)胞泡沫化是AS 發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素，SENP3 可能是AS 發(fā)生發(fā)展的調(diào)控因子，有望成為防治AS 的潛在研究方向。