雷公藤甲素對急性心肌梗死小鼠心肌損傷的影響*

姚德山，王思川，張振剛，龔開政

（揚州大學(xué)附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，江蘇揚州 225001）

左心室負(fù)性重構(gòu)是缺血性心力衰竭發(fā)生發(fā)展的主要病理生理機制，雖然多種因素參與調(diào)控，但這一過程的基本決定因素是初始梗死的程度和心肌梗死后修復(fù)過程。先前的動物實驗研究表明，急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）的病理過程主要分為三個階段：炎癥反應(yīng)階段、修復(fù)階段和負(fù)性重構(gòu)階段［1］。早期炎癥反應(yīng)階段主要通過無菌性炎癥清除壞死細(xì)胞，隨后抑制炎癥反應(yīng)，炎癥消退，（?。┏衫w維細(xì)胞增殖，通過瘢痕形成進行修復(fù)。研究顯示，急性心肌梗死后的炎癥反應(yīng)的時間延長、程度過高或未及時終止，均可導(dǎo)致持續(xù)的組織損傷和愈合不當(dāng)、瘢痕形成缺陷以及細(xì)胞丟失和收縮功能障礙，導(dǎo)致梗死面積擴大，心肌負(fù)性重構(gòu)加重［2］。

雷公藤甲素（triptolide，TPL）是一種二萜類化合物，是中藥雷公藤的主要活性成分，常用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、膜性腎病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和銀屑?。?-4］。近來研究顯示，TPL 可通過抑制脂多糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)來預(yù)防骨骼肌萎縮［5］。此外，TPL 通過抑制PDE4B/AKT/NF-κB 信號級聯(lián)反應(yīng)，減少巨噬細(xì)胞浸潤和M1型極化，從而減弱葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的腸道炎癥反應(yīng)［6］。本課題組前期研究證實，在慢性壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的小鼠心肌肥厚病理過程中，TPL 通過抑制NLRP3 炎癥小體和下游炎癥介質(zhì)的釋放，減輕炎癥反應(yīng)［7］。然而，TPL 對AMI誘導(dǎo)的心肌重構(gòu)的作用尚未明確，本實驗通過結(jié)扎小鼠左冠狀動脈前降支構(gòu)建AMI 模型，觀察TPL 對AMI 后心肌負(fù)性重構(gòu)的抑制作用，并探討這種作用的潛在機制。

材料和方法

1 實驗動物分組

取50 只SPF 級健康雄性C57BL/6J 小鼠，8～10 周齡，體重23～25 g，購自揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)研究院，許可證號為SCXK（蘇）2017-0007。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，將50 只小鼠按照隨機數(shù)表法分為6 組：二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）+假手術(shù)（DMSO+sham）組（n=5）、高劑量TPL+假手術(shù)［TPL（H）+sham］組（n=5）、DMSO+手術(shù)（DMSO+AMI）組（n=10）、低劑量TPL+手術(shù)［TPL（L）+AMI］組（n=10）、中劑量TPL+手術(shù)［TPL（M）+AMI］組（n=10）及高劑量TPL+手術(shù)［TPL（H）+AMI］組（n=10）。根據(jù)之前的研究［7］，在造模前3 d 開始腹腔注射10μg·kg-1·d-1、30μg·kg-1·d-1和100μg·kg-1·d-1的TPL，每天一次。假手術(shù)組分別給予DMSO 和高劑量（100 μg·kg-1·d-1）TPL 作為對照，手術(shù)對照組給予DMSO作為對照。

2 主要試劑

TPL（645900）購自Sigma；即用型免疫組化試劑盒（SA1028）購自博士德生物工程有限公司；RTqPCR 試劑購自南京諾威贊生物科技有限公司；Bax抗體（ab32503）、Bcl-2 抗體（ab194583）、Ly6G 抗體（ab261916）、F4/80 抗體（ab100790）及心肌鈣蛋白T（cardiac troponin T，cTnT）抗體（ab47003）購自Abcam；NF-κB Pathway Antibody Sampler Kit（9936）和β-actin抗體（12262）購自Cell Signaling Technology；白細(xì)胞介素1（interleukin 1，IL-1）、IL-6、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）、I型膠原蛋白（collagen type I，Col I）、Col III、骨膜蛋白（periostin）和GAPDH 所用引物由上海生物工程有限公司設(shè)計合成，序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.The sequences of the primers for RT-qPCR

3 實驗方法

3.1 急性心肌梗死模型構(gòu)建 參照先前報道的研究方法［8］，采取結(jié)扎左冠狀動脈前降支構(gòu)建AMI 模型。小鼠腹腔注射氯胺酮（80 mg/kg）及賽拉嗪（5 mg/kg）聯(lián)合麻醉，行氣管插管通氣。于第4肋間隙打開胸腔暴露心臟，用8 號線于左心耳下方2 mm 處結(jié)扎左冠狀動脈前降支（sham 組僅穿線不結(jié)扎），觀察小鼠心電圖的變化，出現(xiàn)ST段抬高判定手術(shù)成功。

3.2 HE 染色 在術(shù)后第1 和7 天取材，心臟組織經(jīng)石蠟包埋后，切成5 μm 厚的薄片，常規(guī)脫蠟后使用HE 染色試劑盒中伊紅染色液染色2 min，流水沖洗5 min，蘇木素染色10 min，流水沖洗10 min，分化液染色30 s，流水沖洗2 min，返藍液染色30 s，流水沖洗10 min，封片后觀察AMI后心臟損傷。

3.3 RT-qPCR 用Trizol 法提取各組樣本心肌組織的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照說明書進行RT-qPCR檢測IL-1、IL-6、TNF-α、CTGF、periostin、Col I 和ColIII 的mRNA 表達水平。RT-qPCR 的擴增程序為：95 ℃30 s；95 ℃3 s，60 ℃34 s，40 個循環(huán)。GAPDH作為內(nèi)參照，使用2-ΔΔCt法計算目的基因的表達。

3.4 免疫組化檢測中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞 按照免疫組化說明書進行免疫組化染色，分別使用中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的特異性標(biāo)志蛋白Ly6G 和F4/80抗體檢測AMI后心肌組織中中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的浸潤情況。

3.5 Masson 三色法染色 石蠟切片常規(guī)脫蠟后，按照Masson 三色法染色試劑盒說明書進行染色，檢測AMI后心肌組織膠原纖維的表達。

3.6 Western blot 取20～30 mg心肌組織，提取總蛋白，用BCA 法進行蛋白定量。通過常規(guī)SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉，先后與Ⅰ抗（包括p-P65、P65、p-IκBα、IκBα、Bax、Bcl-2 和β-actin）雜交，洗膜后與Ⅱ抗雜交，采用化學(xué)發(fā)光液試劑盒進行發(fā)光顯影，采用ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度。

3.7 TUNEL 染色 在AMI 后第7 天，將心肌梗死組織進行石蠟包埋，切片后常規(guī)脫蠟，按照TUNEL 染色試劑盒說明書進行染色，同時使用cTnT 抗體進行熒光染色標(biāo)記心肌細(xì)胞，使用抗熒光淬滅劑封片后，使用熒光顯微鏡觀察心肌組織中細(xì)胞凋亡的比例。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 20.0 軟件分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。采用Graph-Pad Prism 8.0軟件進行圖表制作。

結(jié)果

1 TPL 通過抑制NF-κB 通路減輕小鼠AMI誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)

HE 染色結(jié)果顯示（圖1A），小鼠AMI 后第1 天，與DMSO+sham 組相比，DMSO+AMI 組心肌組織出現(xiàn)大量的細(xì)胞核固縮，細(xì)胞質(zhì)溶解消失，心肌組織紋理紊亂。此外，免疫組化染色顯示（圖1A），心肌組織中出現(xiàn)大量中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤；與DMSO+AMI組相比，TPL預(yù)處理可以顯著減少心肌梗死區(qū)中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的浸潤（P＜0.05），高劑量組效果更加顯著。Western blot 結(jié)果顯示（圖1B），DMSO+AMI 組心肌組織中p-P65 和p-IκBα 的蛋白水平顯著升高（P＜0.01）；而與DMSO+AMI組相比，TPL預(yù)處理可以顯著降低AMI 后p-P65 和p-IκBα 蛋白水平（P＜0.05）。RT-qPCR 檢測結(jié)果顯示（圖1C～E），AMI 術(shù)后IL-1、IL-6 和TNF-α 的mRNA 表達水平顯著升高（P＜0.01）；而與DMSO+AMI組相比，TPL預(yù)處理小鼠AMI 后IL-1、IL-6 和TNF-α 的mRNA 表達水平顯著降低（P＜0.05），高劑量組效果更加顯著。

在小鼠AMI 后第7 天，HE 染色結(jié)果顯示（圖2A），心肌組織出現(xiàn)明顯的組織紊亂，核溶解消失；而與DMSO+AMI 組相比，TPL 預(yù)處理小鼠AMI 后心肌組織損傷面積顯著減?。≒＜0.05），高劑量組效果更加顯著。Western blot 分析顯示（圖2B），AMI 后心肌組織中p-P65 和p-IκBα 蛋白水平顯著升高，而TPL預(yù)處理小鼠AMI 后心肌組織中p-P65 和p-IκBα 蛋白水平顯著降低（P＜0.05）。RT-qPCR 結(jié)果顯示（圖2C～E），AMI后第7天炎癥因子IL-1、IL-6和TNF-α 水平顯著增高，而TPL 預(yù)處理小鼠AMI 后炎癥因子水平顯著降低（P＜0.05），高劑量組效果更加顯著。

2 TPL減輕小鼠AMI后心肌纖維化

Masson 染色顯示（圖3A），小鼠AMI 第7 天心肌組織中膠原體積分?jǐn)?shù)（collagen volume fraction，CVF）顯著升高；而與DMSO+AMI 組相比，TPL 預(yù)處理小鼠AMI 后CVF 顯著降低（P＜0.05），高劑量組效果更加顯著。RT-qPCR 結(jié)果顯示（圖3B～3E），AMI 后心肌組織中CTGF、perisotin、Col I 和Col III 的mRNA 表達水平顯著升高；而與DMSO+AMI 組相比，TPL 預(yù)處理小鼠AMI 心肌組織CTGF、periostin、Col I 和Col III 的mRNA 表達水平顯著降低（P＜0.05），高劑量組效果更加顯著。

Figure 1.Effect of TPL pretreatment on inflammatory response in mice 24 h after AMI.A：representative images of HE staining and immunohistochemical staining for Ly6G and F4/80 in cardiac tissues（scale bar=200 μm），and Ly6G and F4/80 positive cells were counted（n=5）；B：representative Western blot images and semi-quantitative analysis of the protein levels of p-P65 and p-IκBα in myocardial infarction tissue（n=3）；C，D and E：the mRNA levels of IL-1，IL-6 and TNF-α in myocardial tissue were detected，and GAPDH was used as internal reference（n=5～7）. Mean±SEM.**P＜0.01 vs DMSO+sham group；#P＜0.05，##P＜0.01 DMSO+AMI group.圖1 TPL預(yù)處理對小鼠急性心肌梗死后24 h炎癥反應(yīng)的影響

Figure 2.Effect of TPL pretreatment on inflammatory response in mice 7 d after AMI.A：the representative images of HE staining（scale bar=1 000 μm）and the quantitative results of the extent of myocardial tissue injury（n=5）；B：the representative Western blot images and semi-quantitative analysis of the protein levels of p-P65 and p-IκBα in myocardial infarction tissue（n=5）；C，D and E：the mRNA levels of IL-1，IL-6 and TNF-α in myocardial tissue were detected，and GAPDH was used as internal reference（n=5～10）.Mean±SEM.**P＜0.01 vs DMSO+sham group；#P＜0.05，##P＜0.01 DMSO+AMI group.圖2 TPL預(yù)處理對小鼠急性心肌梗死7 d炎癥反應(yīng)的影響

Figure 3.Pretreatment with TPL attenuated myocardial fibrosis induced by AMI.A：representative images of Masson staining（scale bar=100μm）and semi-quantitative analysis of collagen volume fraction（CVF）in Masson staining（n=5～7）；B，C，D and E：the mRNA expression levels of CTGF，periostin，Col I and Col III in myocardial tissue（n=5～10）. Mean±SEM.**P＜0.01 vs DMSO+sham group；#P＜0.05，##P＜0.01 DMSO+AMI group.圖3 TPL預(yù)處理減輕急性心肌梗死誘導(dǎo)的心肌纖維化

3 TPL減輕小鼠AMI后心肌細(xì)胞凋亡

TUNEL 染色與cTnT 染色結(jié)果顯示（圖4A），小鼠AMI 后心肌梗死區(qū)域出現(xiàn)大量凋亡的心肌細(xì)胞，而且心肌細(xì)胞邊界模糊，心肌細(xì)胞溶解消失；同時也觀察到有少量TUNEL 陽性染色不能完全與cTnT 染色共定位，提示心肌組織內(nèi)也有少量非心肌細(xì)胞發(fā)生了細(xì)胞凋亡；而TPL 預(yù)處理小鼠AMI 后凋亡的心肌細(xì)胞顯著減少（P＜0.05），高劑量組效果更加顯著。Western blot 分析顯示（圖4B），AMI 后Bax/Bcl-2 的比值顯著升高；而TPL 預(yù)處理小鼠AMI 后Bax/Bcl-2 的比值顯著降低（P＜0.05）。

討 論

Figure 4.Pretreatment with TPL attenuated cardiomyocyte apoptosis induced by AMI.A：the representative images of TUNEL（green）and cTnT（red）staining in myocardial tissue（scale bar=200 μm；blue showed the nuclei of total cells），and the percentage of apoptotic myocardial cells（n=5～10）；B：the representative Western blot images and semi-quantitative analysis of the protein levels of Bax and Bcl-2 in myocardial tissue（n=5）. Mean±SEM.**P＜0.01 vs DMSO+sham group；#P＜0.05，##P＜0.01 DMSO+AMI group.圖4 TPL預(yù)處理減輕急性心肌梗死誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡

本研究首次證明了TPL 通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和減輕病理損傷來抑制小鼠AMI 誘導(dǎo)的心肌重構(gòu)。TPL預(yù)處理通過減少心肌組織中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤，抑制NF-κB通路激活，減少炎癥因子IL-1、IL-6和TNF-α 的釋放，從而減輕小鼠AMI 后炎癥反應(yīng)。此外，TPL 預(yù)處理可以顯著減少細(xì)胞外基質(zhì)中CTGF、periostin、Col I 和Col III 的表達，減輕心肌纖維化，并且通過降低Bax/Bcl-2 比值，減少急性缺血誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，從而抑制AMI誘導(dǎo)的心肌重構(gòu)。

TPL 是中草藥雷公藤的提取物，基于其抗炎作用被廣泛應(yīng)用于治療自身免疫和炎癥性疾?。?，9-10］。然而，TPL 發(fā)揮抗炎和免疫抑制的作用機制尚不明確。先前研究表明，大劑量TPL具有細(xì)胞毒性［7，11-13］。參照以往研究資料［7］，本實驗設(shè)置了3 個劑量梯度，并且設(shè)置高劑量（100 μg·kg-1·d-1）TPL+假手術(shù)組作為對照，證實了該高劑量的TPL 對正常心肌組織沒有顯著的毒性作用，排除TPL 的毒性作用對實驗結(jié)果的影響。

先前的研究顯示，大量炎癥因子釋放及中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞募集是心臟負(fù)性重構(gòu)過程中的關(guān)鍵機制［7，14］。在CX3CR1gfp/+小鼠AMI 模型中，通過活體顯微鏡顯示單核細(xì)胞在幾分鐘內(nèi)即可迅速被招募到心肌梗死區(qū)域，募集的單核細(xì)胞吸引中性粒細(xì)胞聚集在梗死區(qū)，放大了炎癥信號［15］。巨噬細(xì)胞通過調(diào)節(jié)CXCL2 和CXCL5 的產(chǎn)生，促進中性粒細(xì)胞外滲到缺血性心肌組織中，促進ROS 的產(chǎn)生，傳播炎癥反應(yīng)，進一步招募單核細(xì)胞和調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的極化［16］。此外，激活NF-κB 信號通路釋放大量的炎癥因子，可以顯著的加重小鼠AMI 誘導(dǎo)的心肌組織損傷，加重心臟功能的惡化［14］。之前的研究顯示，TPL 通過減少ROS 的產(chǎn)生，減輕心肌氧化應(yīng)激損傷，減少TNF-α和IL-10 的表達，改善關(guān)節(jié)炎大鼠的心臟功能［17］。在糖尿病心肌病模型中，TPL 通過抑制TNF-α/VCAM-1炎癥途徑以及TGFβ1/α-SMA/vimentin 纖維化途徑減弱炎癥反應(yīng)和心肌纖維化，發(fā)揮對糖尿病心肌病的保護作用［18］。本研究結(jié)果顯示，在AMI 早期心肌組織中出現(xiàn)大量的中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤，而且隨著疾病的發(fā)展，心肌組織的炎癥反應(yīng)持續(xù)激活，心肌缺血損傷范圍不斷的擴大，而TPL 預(yù)處理可以顯著的減少中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤，并且可以持續(xù)抑制NF-κB 信號通路的激活，減少炎癥因子IL-1、IL-6 和TNF-α 的產(chǎn)生，從而減輕小鼠AMI 誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，減輕心肌組織損傷。

心肌纖維化是心肌負(fù)性重構(gòu)的主要病理機制，可以導(dǎo)致心臟收縮和舒張功能障礙［19-21］。持續(xù)的炎癥反應(yīng)可以加重心肌纖維化［7］。有研究顯示，在血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌肥大病理模型中，TPL 通過抑制NLRP3 炎癥小體的激活，減輕心肌組織炎癥反應(yīng)，從而減輕心肌纖維化［22］。此外，TPL 曾被證實可減輕異丙腎上腺素和慢性壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌纖維化［7，23］。本研究的結(jié)果顯示，在AMI 病理過程中，TPL 預(yù)處理可以抑制AMI 后心肌組織細(xì)胞外基質(zhì)中CTGF、periostin、Col I和Col III的mRNA 表達水平，減輕心肌纖維化，抑制小鼠AMI后心肌負(fù)性重構(gòu)。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞死亡的主要形式之一，與多種心血管疾病密切相關(guān)［11］。在心肌梗死病理過程中，在心肌梗死區(qū)和梗死邊緣區(qū)都會出現(xiàn)細(xì)胞凋亡，它是梗死面積大小的最終決定因素［24-25］。先前研究顯示，TPL 通過調(diào)節(jié)miR-24-3p-BCL2L11-PPARs-PGC1α軸減輕氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［26］。在氧糖剝奪實驗中，TPL 可通過上調(diào)Scr/Akt/GSK3β 途徑的磷酸化來抑制少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡。Bcl-2/Bax 凋亡信號通路在內(nèi)在凋亡途徑中起關(guān)鍵作用［27］。本研究通過cTnT 標(biāo)記心肌細(xì)胞，與TUNEL 染色共染，觀察到TPL 可以顯著減少AMI 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡；重要的是，TPL 不僅可下調(diào)促凋亡蛋白Bax 的表達，還可增加促存活蛋白Bcl-2 的表達，因此減輕AMI 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。

總之，本研究結(jié)果提示，TPL 通過抑制NF-κB 信號通路減輕小鼠AMI 誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和心肌纖維化，并且降低Bax/Bcl-2 比值，減少心肌細(xì)胞凋亡，從而抑制心肌負(fù)性重構(gòu)。