栽培草莓潛在印記基因FaTRG-31的克隆與特征分析

安 琪，張 紅，懷欣佳，荊曉彤，熊勁松，喬玉山

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院， 南京 210095)

水通道蛋白(aquaporin，AQPs)是一類能通過在細(xì)胞膜上組成“孔道”并高效轉(zhuǎn)運(yùn)水分子的內(nèi)在蛋白。AQPs包括6個(gè)跨膜螺旋(TM1～TM6)、5個(gè)連接它們的環(huán)(A-E)[1]、2個(gè)高度保守的NPA(asparagine-proline-alanine)基序[2]、Ar/R(芳香/精氨酸)選擇性過濾器。AQP具有運(yùn)輸水和其他底物的功能，通過NPA基序和Ar/R區(qū)域的氨基酸殘基幫助其進(jìn)行底物的選擇，加強(qiáng)通道的特異性。植物水通道蛋白主要有5類：質(zhì)膜內(nèi)在蛋白(plasma intrinsic proteins, PIPs)、液泡膜內(nèi)在蛋白(tonoplast intrinsic proteins, TIPs)、類NOD26膜內(nèi)在蛋白(nodulin-26 like intrinsic proteins, NIPs)、小分子堿性膜內(nèi)在蛋白(small basic intrinsic proteins, SIPs)和X內(nèi)在蛋白(X intrinsic proteins, XIPs)[3]。

PIPs分為PIP1型和PIP2型。PIPs參與吸收和運(yùn)輸水、尿素[4]、硼酸[5]和二氧化碳[6]等，其主要功能是通過調(diào)節(jié)植物細(xì)胞滲透勢來介導(dǎo)水分子的跨膜運(yùn)輸，進(jìn)而參與調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的諸多過程[2, 7-8]。研究表明，PIPs家族在蘋果、番茄、葡萄等多種植物中被發(fā)現(xiàn)與種子和果實(shí)發(fā)育有關(guān)[9-11]。此外，當(dāng)植物抵御干旱、鹽和滲透脅迫時(shí)，植物細(xì)胞的PIPs通過發(fā)生表達(dá)水平、蛋白結(jié)構(gòu)等不同的適應(yīng)性改變，從而發(fā)揮重要作用[12-13]。草莓中水通道蛋白的相關(guān)報(bào)道較少，二倍體草莓中確定了10種AQP，屬于PIP和TIP亞家族[14]。栽培草莓中鑒定出9種AQP，分別是FaRB7、FaPIP1;1、FaPIP2;1、FaNIP1;1、FaPIP1;2、FaPIP1;3、FaPIP2;1(b)、FaPIP2;2和FaTIP(a)。研究表明，F(xiàn)aRB7啟動(dòng)子可以誘導(dǎo)草莓根特異性表達(dá)[15]；FaPIP1;1表達(dá)模式與生長素和成熟過程密切相關(guān)[16]；FaPIP2;1基因編碼具有高透水性的水通道，其表達(dá)模式與果實(shí)硬度相關(guān)[17]；FaNIP1;1主要在果實(shí)中表達(dá)并具有與成熟相關(guān)的表達(dá)模式，受脫落酸正調(diào)節(jié)，生長素負(fù)調(diào)節(jié)[18]；FaPIP1;2各組織均有表達(dá)且差異不顯著，F(xiàn)aPIP1;3為葉特異性表達(dá)，F(xiàn)aPIP2;1(b)主要在地上營養(yǎng)組織中表達(dá)，F(xiàn)aPIP2;2在葉片和葉柄中的表達(dá)明顯高于果實(shí)組織，F(xiàn)aTIP(a)果實(shí)中的表達(dá)較高[19]。本課題組前期通過轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)的一個(gè)栽培草莓潛在的印記基因FaTRG-31(turgor-responsive protein 31)，研究表明TRG-31屬于質(zhì)膜內(nèi)在蛋白(PIPs)家族[20-21]。

Kermicle等于1970年發(fā)現(xiàn)，玉米中R基因的某些等位基因從一個(gè)親本遺傳時(shí)產(chǎn)生完全著色的籽粒，而從另一個(gè)親本遺傳時(shí)則不會產(chǎn)生[22]，首次在植物中發(fā)現(xiàn)印記基因?；蚪M印記(genomic imprinting)是指親本染色體上等位基因的表觀遺傳修飾差異而導(dǎo)致只有一個(gè)等位基因表達(dá)，另一個(gè)沉默或者表達(dá)量低的現(xiàn)象。具有這種父母本差異表達(dá)現(xiàn)象的基因被稱為印記基因。根據(jù)印記基因的親本來源不同可以分為兩種類型：母源印記基因(maternally expressed imprinted gene，MEGs)和父源印記基因(paternally expressed imprinted gene，PEGs)[23]?，F(xiàn)已在真菌、哺乳動(dòng)物和開花植物中鑒定出印記基因，開花植物中的印記基因主要在胚乳中表達(dá)，只有少數(shù)印記基因在胚中被報(bào)道[24]。隨著高通量技術(shù)的成熟和應(yīng)用為印記基因的鑒定提供了更高效的方法。在擬南芥和水稻中通過系統(tǒng)的全基因組測序已鑒定出上百個(gè)印記基因[25-31]，但其中大多數(shù)尚未得到證實(shí)且沒有明確的功能。目前草莓中，通過傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)手段僅我們在森林草莓(FragariavescaL.)中鑒定出5個(gè)印記基因，分別是FvARI8、FvBRO1、FvKHDP-2、FvDRIP2和FvLTP3[32]，但仍缺乏對草莓印記基因表達(dá)模式及生物學(xué)功能的研究。FaTRG-31作為栽培草莓中潛在的印記基因，為明確該基因的印記類型及表達(dá)特征，本研究從栽培草莓‘紅顏’中克隆得到該基因，并對其表達(dá)模式、印記特性等進(jìn)行初步分析，以了解該基因的作用機(jī)理進(jìn)而為草莓印記基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制及生物學(xué)功能的深入研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為八倍體栽培草莓‘紅顏’(B)和‘甜查理’(S)，種植于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)白馬教學(xué)基地。收集‘紅顏’草莓的根、短縮莖、葉、花萼、花瓣、花藥、花托、子房、花柱、12 DAP(days after pollination)的胚及胚乳、種皮，‘甜查理’草莓12 DAP的胚乳，B(♀)×S(♂)、S(♀)×B(♂) 12 DAP的胚乳，液氮速凍，置于-80℃冰箱保存。試驗(yàn)所用質(zhì)粒為pCAMBIA1302-GFP，所用大腸桿菌菌株為DH5α，農(nóng)桿菌菌株為EHA105，煙草為本氏煙草(NicotianabenthamianaDomin)。

1.2 方 法

1.2.1FaTRG-31的克隆與生物信息分析以‘紅顏’草莓12 DAP的胚乳為材料，總RNA提取參照RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(Tiangen)說明書進(jìn)行。凝膠電泳檢測完整性后利用PrimeScript Ⅱ1stStrand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)合成cDNA。在GDR數(shù)據(jù)庫(https://www.rosaceae.org/)中搜索maker-Fvb7-1-augustus-gene-257.46-mRNA-1獲得草莓FaTRG-31基因序列，利用DNAMAN設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物(表1)。以‘紅顏’12 DAP的胚乳cDNA為模板，按照2×Hieff Canace?Gold PCR Master Mix(翌圣)說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳并回收目的條帶，連接pClone007 Blunt Simple(007BS)載體(擎科)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后挑選陽性克隆由公司完成測序。

利用ORF finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)、Conserved domains(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)、ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)、TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)、Signal P5.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)、WoLF PSORT(https://wolfpsort.hgc.jp/)等在線網(wǎng)站對FaTRG-31進(jìn)行蛋白質(zhì)分子量、等電點(diǎn)、跨膜區(qū)、信號肽和亞細(xì)胞定位的預(yù)測。通過MEGA 7.0軟件分析FaTRG-31氨基酸序列與擬南芥和葡萄中的PIP不同亞型蛋白序列之間的親緣關(guān)系，采用Neighbor-Joining(NJ)法構(gòu)建進(jìn)化樹，用Bootstrap重復(fù)1000次進(jìn)行校正，其他參數(shù)默認(rèn)[33]。

1.2.2 FaTRG-31亞細(xì)胞定位分析以pCAMBIA1302-GFP植物表達(dá)載體為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)BglⅡ和SpeⅠ的載體引物(表1)對FaTRG-31編碼區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，構(gòu)建植物表達(dá)載體pCAMBIA1302-GFP-FaTRG-31。將構(gòu)建好的表達(dá)載體和pCAMBIA1302-GFP空載體質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105。參照Zheng等[34]的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將重懸后OD值為0.6左右的菌液注射到本氏煙草葉片。置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d后在激光共聚焦顯微鏡下觀察煙草葉片中的熒光信號并拍照記錄。

1.2.3FaTRG-31的組織表達(dá)特性分析以‘紅顏’草莓不同組織(根、短縮莖、葉、花萼、花瓣、花藥、花托、子房、花柱、12 DAP的胚及胚乳、種皮)為材料提取RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)FaTRG-31的編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)qRT-PCR引物(表1)，草莓內(nèi)參基因?yàn)镋F1-α[25]。檢測‘紅顏’草莓不同組織中FaTRG-31的表達(dá)水平。采用SYBR premix EX TaqTMreagent試劑盒(TaKaRa)進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系(20 μL)為：SYBRpremixExTaq混合液10 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，cDNA 1.0 μL和ddH2O 8.0 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，40次循環(huán)?；蛳鄬Ρ磉_(dá)量通過2-ΔΔCt法[35]計(jì)算，試驗(yàn)進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

表1 引物序列及用途Table 1 Primers and their amplification

1.2.4FaTRG-31啟動(dòng)子的克隆及序列分析根據(jù)在GDR數(shù)據(jù)庫中檢索到的FaTRG-31基因序列，向起始密碼子上游2 000 bp進(jìn)行搜索，獲得該基因所對應(yīng)的啟動(dòng)子序列。根據(jù)啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物(表1)。通過CTAB法提取‘紅顏’草莓基因組DNA，以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將回收的片段連接至007BS載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后進(jìn)行陽性克隆鑒定與測序。使用在線軟件PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)[36]分析FaTRG-31啟動(dòng)子中包含的順式作用元件。

1.2.5FaTRG-31印記鑒定提取B、B(♀)×S(♂)、S(♀)×B(♂) 12 DAP的胚乳總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以‘甜查理’12 DAP的胚乳cDNA為模板，根據(jù)GDR數(shù)據(jù)庫中包含單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)的基因片段設(shè)計(jì)特異性引物(表1)，在‘甜查理’中克隆該基因片段進(jìn)行RT-PCR測序分析，結(jié)合之前克隆的‘紅顏’FaTRG-31基因，獲得可靠的SNP位點(diǎn)。利用該SNP位點(diǎn)區(qū)分親本的等位基因，再以‘紅顏’與‘甜查理’正反交12 DAP的胚乳cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。根據(jù)劉國慶等[37]的方法使用DNA測序峰圖的面積來獲得堿基變異的比例，利用Image J[38]軟件計(jì)算DNA測序峰圖面積以獲得SNP位點(diǎn)堿基的變異比例。驗(yàn)證草莓胚乳中FaTRG-31的印記特性。

1.2.6FaTRG-31在非生物脅迫下的表達(dá)分析取12株生長于盆缽中長勢一致的‘紅顏’草莓正常澆水，經(jīng)3 d的緩苗期后開始脅迫處理，4株置于4 ℃環(huán)境中模擬低溫脅迫；4株澆灌300 mmol·L-1甘露醇溶液模擬干旱脅迫處理；4株澆灌100 mmol·L-1NaCl溶液模擬鹽脅迫處理。分別于脅迫處理后0、12、24、48、72和96 h取不同處理的草莓葉片，液氮速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆?。以未?jīng)脅迫處理和脅迫處理后不同時(shí)間的‘紅顏’葉片cDNA為模板，通過qRT-PCR分析FaTRG-31在非生物脅迫下的表達(dá)模式。內(nèi)參引物、特異引物、反應(yīng)體系、程序及數(shù)據(jù)分析同1.2.3。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析用SPSS 22軟件進(jìn)行，通過Duncan法進(jìn)行顯著性分析(P<0.05)，用Excel 2017制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 FaTRG-31的克隆與生物信息分析

以‘紅顏’草莓12 DAP的胚乳cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得了大小約1 000 bp的單一條帶(圖1，A)，測序分析結(jié)果表明，該基因包含一個(gè)長為999 bp的完整開放閱讀框，編碼332個(gè)氨基酸。

ProtParam預(yù)測理化性質(zhì)顯示，F(xiàn)aTRG-31編碼的蛋白質(zhì)分子量約為33.6 kD，等電點(diǎn)為9.10，不穩(wěn)定系數(shù)(instability index Ⅱ)為29.99，親水性平均數(shù)(GRAVY)為0.370，屬于穩(wěn)定的疏水性蛋白。SignalP和TMHMM分析顯示，F(xiàn)aTRG-31不含信號肽，且具有AQPs家族典型的6個(gè)跨膜區(qū)(分別位于氨基酸序列第99～121、136～158、178～195、224～241、254～276、302～324位)，是一類膜蛋白。WoLF PSORT預(yù)測結(jié)果顯示，F(xiàn)aTRG-31定位在細(xì)胞質(zhì)膜中。在線軟件(https://prosite.expasy.org/)分析FaTRG-31的氨基酸序列，其中含有AQPs家族兩個(gè)高度保守的NPA基序和SGGHINPAVT序列。此外，還含有水通道蛋白家族PIPs亞家族的高度保守序列GGGANXXXXGY和TGI/TNPARSL/FGAAI/VIVF/YN(圖2)，說明FaTRG-31屬于質(zhì)膜內(nèi)在蛋白(PIPs)家族。

將FaTRG-31蛋白序列與擬南芥和葡萄的PIP蛋白序列進(jìn)行比對，利用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)aTRG-31與所有PIP1型質(zhì)膜水通道蛋白的氨基酸相似性均高于90%，并與FaPIP1;1親緣關(guān)系最近，相似性超過98%。

2.2 FaTRG-31的亞細(xì)胞定位

為確定FaTRG-31亞細(xì)胞定位情況，將FaTRG-31構(gòu)建到pCAMBIA1302-GFP植物表達(dá)載體中，成功構(gòu)建pCAMBIA1302-GFP-FaTRG-31融合表達(dá)載體，待質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105后注射煙草葉片背面，并以空載為對照，利用激光共聚焦顯微鏡觀察融合蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果(圖4)顯示，在空載對照中熒光信號在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和細(xì)胞膜等部位都能觀察到，而pCAMBIA1302-GFP-FaTRG-31融合蛋白只在細(xì)胞質(zhì)膜上觀察到熒光信號，說明FaTRG-31蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)膜上。這與亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果一致，且與PIPs家族其他成員定位結(jié)果一致[39]。由此得出FaTRG-31屬于質(zhì)膜內(nèi)在蛋白(PIPs)家族。

2.3 FaTRG-31在不同組織中的表達(dá)模式

為明確FaTRG-31的表達(dá)特點(diǎn)，對草莓的根、短縮莖、葉、花萼、花瓣、花藥、花托、子房、花柱、12 DAP的胚及胚乳、種皮等不同組織進(jìn)行qRT-PCR分析。結(jié)果顯示：FaTRG-31基因在‘紅顏’草莓的不同組織中均有表達(dá)，在胚乳中的表達(dá)量最高，其次是花萼、短縮莖和花柱，子房最低(圖5)。

2.4 FaTRG-31啟動(dòng)子作用元件分析

為了驗(yàn)證FaTRG-31啟動(dòng)子中是否存在胚乳表達(dá)相關(guān)的作用元件，以‘紅顏’草莓的基因組DNA為模板，擴(kuò)增出FaTRG-31起始密碼子上游1 989 bp的啟動(dòng)子序列(圖1，B)。通過Plant CARE在線網(wǎng)站對FaTRG-31啟動(dòng)子進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，F(xiàn)aTRG-31啟動(dòng)子區(qū)除了含有啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn)相關(guān)元件(TATA-box、CAAT-box)外，還有與胚乳表達(dá)相關(guān)的作用元件(GCN4-motif)，以及4種光響應(yīng)元件(GT1-motif、Box4、G-box、TCT-motif)、2種激素響應(yīng)元件(ABRE、TGA-element)、3種與干旱和鹽等脅迫相關(guān)的響應(yīng)元件(TC-rich repeats、MBS、MYC)(表2)，這可以部分解釋該基因在胚乳中高表達(dá)的原因。

2.5 FaTRG-31印記鑒定

根據(jù)FaTRG-31基因在胚乳組織中高表達(dá)，植物中的印記基因同樣也主要在胚乳中表達(dá)。為明確栽培草莓潛在印記基因FaTRG-31的印記特性，以‘紅顏’、‘紅顏’(♀)ב甜查理’(♂)、‘甜查理’(♀)ב紅顏’(♂)正反交12 DAP的胚乳cDNA為模板，對預(yù)測含有SNP位點(diǎn)的基因片段進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果顯示(圖6)，兩親本的FaTRG-31基因序列在570 bp處存在SNP位點(diǎn)。在‘紅顏’做母本的雜交胚乳中，該SNP位點(diǎn)與親本‘紅顏’相同；而在‘甜查理’做母本的雜交胚乳中，該SNP位點(diǎn)與‘甜查理’相同。以上結(jié)果表明在此SNP位點(diǎn)處胚乳中等位基因的表達(dá)只和母本有關(guān)，即只表達(dá)母本的等位基因，不表達(dá)父本的等位基因，說明該基因是母源印記基因(MEG)。

2.6 FaTRG-31在不同脅迫處理下的表達(dá)分析

鑒于FaTRG-31啟動(dòng)子序列上含有多種與非生物脅迫相關(guān)的響應(yīng)元件(MBS、TC-rich repeats)，同時(shí)PIPs類基因多與抗逆性相關(guān)。為進(jìn)一步研究FaTRG-31的功能特性，分別采用低溫、干旱和鹽脅迫處理‘紅顏’草莓，通過qRT-PCR方法檢測脅迫處理后草莓中FaTRG-31的表達(dá)水平。結(jié)果顯示(圖7)，在4 ℃低溫處理下，F(xiàn)aTRG-31的表達(dá)水平呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，在48 h時(shí)出現(xiàn)最低值，然后逐漸升高，表明較長時(shí)間的低溫條件上調(diào)該基因的表達(dá)。在干旱處理后，F(xiàn)aTRG-31在脅迫后12 h里小幅度上調(diào)表達(dá)，12 ～ 48 h內(nèi)顯著下調(diào)并低于對照水平，而后又在72 h時(shí)上調(diào)至12 h時(shí)的水平，表明干旱短時(shí)間上調(diào)該基因的表達(dá)。在鹽脅迫處理后，F(xiàn)aTRG-31與干旱處理后表達(dá)模式類似。在前期小幅上調(diào)表達(dá)，之后轉(zhuǎn)錄水平迅速下調(diào)至低于對照，而后逐漸上調(diào)，在72 h時(shí)達(dá)到最高，復(fù)又下調(diào)至對照水平，表明鹽脅迫下FaTRG-31也有較高水平的表達(dá)。通過了解FaTRG-31在低溫、干旱及鹽脅迫下的表達(dá)模式，推測該基因可能在草莓抵御低溫和滲透脅迫過程中起作用。

3 討 論

目前植物中已發(fā)現(xiàn)許多印記基因[24]，但關(guān)于草莓印記基因的研究還比較少。本研究從‘紅顏’中克隆得到栽培草莓潛在印記基因FaTRG-31，通過生物信息學(xué)、系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)FaTRG-31編碼的蛋白質(zhì)屬于典型的水通道蛋白(AQPs)家族中質(zhì)膜內(nèi)在蛋白(PIPs)亞家族[2, 40]。此外，F(xiàn)aTRG-31蛋白的亞細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì)膜，此結(jié)果與預(yù)測結(jié)果及前人研究相一致[41-42]，這進(jìn)一步證實(shí)了FaTRG-31屬于質(zhì)膜內(nèi)在蛋白家族。質(zhì)膜內(nèi)在蛋白(PIPs)家族中的不同成員表達(dá)模式不同[43]，有的組成型表達(dá)，如CsPIP1;2、CsPIP2;4和CsPIP1;3在子房、果實(shí)和花中高表達(dá)[44]；有的特異性表達(dá)，如PePIP2;7在葉中特異性表達(dá)，且主要在成熟葉片的葉肉細(xì)胞中表達(dá)[45]。本研究通過對FaTRG-31在‘紅顏’各組織中的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)FaTRG-31在胚乳中高表達(dá)。植物體內(nèi)基因表達(dá)受到嚴(yán)格調(diào)控，涉及到啟動(dòng)子、終止子等調(diào)控元件，其中啟動(dòng)子序列具有主導(dǎo)作用[46]。本研究進(jìn)一步從‘紅顏’草莓中克隆到了FaTRG-31基因上游1 989 bp左右的啟動(dòng)子序列，序列分析表明啟動(dòng)子上含有與胚乳特異性表達(dá)相關(guān)的作用元件(GCN4-motif)，這與FaTRG-31基因在胚乳中高表達(dá)相吻合，表明其可能在胚乳中發(fā)揮作用。研究表明，被子植物中的印記基因主要發(fā)生在胚乳，玉米[47]、擬南芥[48]中的印記基因均在胚乳中高表達(dá)，并且在種子早期發(fā)育過程中也有表達(dá)[49-50]。此外，印記基因還參與細(xì)胞分裂[27]、營養(yǎng)轉(zhuǎn)移[51]、胚乳發(fā)育[52]和種子大小的調(diào)控[53]等生物學(xué)過程。FaTRG-31是前期通過轉(zhuǎn)錄組測序在栽培草莓中篩選出來的潛在印記基因，本研究在親本中篩選出可靠的SNP位點(diǎn)，通過單等位基因表達(dá)進(jìn)行印記驗(yàn)證。研究結(jié)果顯示，草莓雜交胚乳中經(jīng)驗(yàn)證的SNP位點(diǎn)處只表達(dá)母本的等位基因，不表達(dá)父本的等位基因，結(jié)合組織表達(dá)分析顯示該基因在胚乳中高表達(dá)，說明FaTRG-31為印記基因且是母源印記基因(MEG)。對于該印記基因的具體功能和調(diào)節(jié)機(jī)制等一系列問題還需進(jìn)一步研究。

高等植物基因的表達(dá)主要由啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄因子的相互作用來調(diào)控，啟動(dòng)子的調(diào)控元件決定了基因的特定表達(dá)，其作用元件可以反映相應(yīng)基因的功能[54]。除了與胚乳表達(dá)相關(guān)的響應(yīng)元件，啟動(dòng)子中還有與干旱和鹽脅迫相關(guān)的響應(yīng)元件(TC-rich repeats、MBS、MYC)。印記基因FaTRG-31屬于PIPs家族，研究表明多數(shù)PIPs家族基因在植物抗逆分子機(jī)制中參與應(yīng)答反應(yīng)[55-56]。TaAQP7和TaAQP8在煙草中的過表達(dá)分別導(dǎo)致對干旱和鹽脅迫的抗性提高[55,57]；過表達(dá)PIP1;2基因的香蕉植物表現(xiàn)出對干旱、鹽分和寒冷脅迫的抵抗力增強(qiáng)[58]；香蕉MaPIP1;1在擬南芥中的異源過表達(dá)通過減少膜損傷、改善離子分布和維持滲透平衡來增加對鹽和干旱脅迫的耐受性[59]。草莓中也有相關(guān)研究表明，RdreB1BI通過激活草莓中的AQP相關(guān)基因來增強(qiáng)抗旱性[60]。本研究通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR探究了非生物脅迫處理下印記基因FaTRG-31的表達(dá)模式。結(jié)果顯示，低溫脅迫下該基因表達(dá)模式表現(xiàn)為短時(shí)間下調(diào)而后逐漸上調(diào)；干旱脅迫下的基因表達(dá)模式和鹽脅迫下基因表達(dá)模式相似，均表現(xiàn)為前期小幅度上調(diào)而后下降復(fù)又上調(diào)表達(dá)?？傮w來看，長期低溫和早期的滲透脅迫時(shí)均上調(diào)表達(dá)，這與大麥葉片在脅迫下HvPIP1;6轉(zhuǎn)錄水平的增加表現(xiàn)一致[61]。此外，有研究表明擬南芥胚乳印記基因SDC會在非生物脅迫處理下被激活表達(dá)[62]。這暗示印記基因可能參與了植物對低溫、干旱和鹽等非生物脅迫的響應(yīng)。通過了解FaTRG-31在非生物脅迫下的表達(dá)模式，推測該基因可能在草莓抵御低溫和滲透脅迫過程中起作用，這仍需進(jìn)一步通過轉(zhuǎn)基因手段進(jìn)行驗(yàn)證。