綠豆果膠甲酯酶基因及其響應(yīng)鎘脅迫的分析

楊 樂，張創(chuàng)娟，程 斌，冷 艷，李師翁

（蘭州交通大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，蘭州 730070）

果膠甲酯酶（PME）廣泛存在于高等植物中，在植物的生長、發(fā)育和防御等過程中起著重要作用.在植物中，PME是一個由多基因組成的大基因家族，如擬南芥、水稻、番茄、油菜和棉花分別有66、43、79、110和80個PME基因［1-7］.通常分為兩種類型（Ⅰ型和Ⅱ型），Ⅰ型在N端含有Pro區(qū)，Ⅱ型不帶Pro區(qū)［8-9］.有學(xué)者研究了擬南芥幼苗PME的表達譜，僅有15%的PME高表達，其余基因在任何生長階段均未表達［10］.也有學(xué)者研究了亞麻和棉花中的PME表達模式，發(fā)現(xiàn)纖維發(fā)育特異性表達相關(guān)的PMEs［11-12］.PMEs可能在植物非生物脅迫中起作用，例如，當(dāng)植物受到Cd脅迫時，細胞壁纖維素含量降低，半纖維素含量升高，導(dǎo)致細胞壁孔隙度和厚度變小，可使Cd2+滯留在細胞壁間，果膠含量和PME酶活性在這一過程中起作用［13］.然而，目前對于PME在植物重金屬脅迫中的作用及其機制還缺乏系統(tǒng)研究，開展系統(tǒng)研究十分必要.

鎘（Cd）是一種廣泛存在且對環(huán)境造成嚴(yán)重污染的重金屬，其高水溶性對生物具有嚴(yán)重的毒害作用.Cd會通過胞質(zhì)間隙和管狀纖維殘留在植物體中［13］，通過食物鏈和食物網(wǎng)進入動物體內(nèi)，也會對人造成嚴(yán)重的危害.豆科植物因其能形成根瘤菌的特性，在土壤重金屬污染植物修復(fù)方面具有獨特的優(yōu)勢.綠豆是世界上廣泛種植的重要的豆科作物，開展其重金屬耐受性及其對重金屬脅迫響應(yīng)的研究具有理論和實踐價值.本人所在課題組前期已開展了綠豆幼苗期對Cd脅迫響應(yīng)的生理生化與分子機制研究［14-16］，本研究聚焦于PMEs，對綠豆PMEs進行全基因組鑒定，采用生物信息學(xué)方法分析PMEs系統(tǒng)發(fā)育樹、基因結(jié)構(gòu)、保守基序、理化性質(zhì)等.運用轉(zhuǎn)錄組技術(shù)對PMEs表達譜及其響應(yīng)Cd脅迫的表達譜進行研究，并對Cd脅迫下PME酶活性進行了測定，結(jié)果將為PME基因在響應(yīng)重金屬的毒害作用層面和基因工程應(yīng)用層面提供科學(xué)資料.

1 材料與方法

1.1 植物材料培養(yǎng)

用10%次氯酸鈉溶液浸泡新鮮的綠豆種子15 min，無菌水沖洗，在培養(yǎng)箱中于25±1℃浸種36 h，播種于滅菌的珍珠巖：蛭石（1∶1）的育苗盤［14］，25±1℃光照培養(yǎng)箱（PAR為0.1 mol·m-2·s-1）中14 h光周期培養(yǎng)5 d.

1.2 植物材料處理

將上述培養(yǎng)的幼苗分為兩組，每組至少包括三個生物學(xué)重復(fù)，處理組施以終濃度0.1 mol/L CdCl2的1/2 Hoagland營養(yǎng)液［15］，對照組施以1/2 Hoagland營養(yǎng)液，每皿分別施加營養(yǎng)液70 mL在相同的條件下繼續(xù)培養(yǎng).以施加營養(yǎng)液的時間為基準(zhǔn)，分別于培養(yǎng)的1、5、9天取根、莖、葉各1 g組織，液氮速凍，保存在-80℃冷藏備用.

1.3 RNA分離和表達譜分析

總RNA提取和cDNA文庫制備按照我們之前研究中描述的方法進行［7，17］，轉(zhuǎn)錄組測序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司IlluminaHiseq 2000平臺完成.基因表達譜用TBtools中的Heatmap Illustrator制作熱圖［18］.基因表達量以基因表達量以TPM（transcripts per kilobase per million mapped reads）值表示.

1.4 果膠甲酯酶活性的測定

取1 g綠豆樣品于預(yù)冷研缽中，加入等體積（w／v）提取緩沖液（0.1 mol/L Tris-HCl，pH=7.5，0.5 mol/L NaCl）研磨成勻漿，4℃12 000 rpm離心10 min，收集上清液用于所有酶測定.在試管中加入4 mL 0.5% （w／v）果膠溶液和0.3 mL 0.01% （w／v）溴酚藍［19］，然后加入300μL酶液.2 min后記錄樣品的吸光度并計算酶活性（ΔA620/min·g·FW）［2，18］，每個樣品重復(fù)3次.

1.5 綠豆PME基因家族的鑒定

從NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載綠豆全基因組及注釋文件信息，篩選綠豆PME基因，從EnsemblPlant數(shù)據(jù)庫（https：//plants.ensembl.org/index.html）檢索擬南芥（Arabidopsis thaliana）PME參考基因，從NCBI數(shù)據(jù)庫得到大豆（Glycine max）基因組注釋文件和蛋白質(zhì)序列文件［20］.

使用基于隱馬爾可夫模型（HMMER）（https：//www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/search/hmmsc an）的工具對得到的綠豆PME蛋白質(zhì)序列進行檢索，Pfam數(shù)據(jù)庫（http：//pfam.xfam.org）進行蛋白序列的結(jié)構(gòu)域分析.

1.6 PMEs蛋白分析

使用PSROT（https：//www.genscript.com/psort.html）軟件的WoLFPSORTII（https：//wolfpsort.hgc.jp/）預(yù)測PME蛋白的亞細胞定位［21］，ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam）軟件預(yù)測PME蛋白的分子量和等電點，MEME（http：//meme-suite.org/tools/meme）在線工具獲取基因結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)［22］，Pfam數(shù)據(jù)庫進行結(jié)構(gòu)域分析，TBtools軟件［18］獲取基因家族分析結(jié)果及可視化，參數(shù)設(shè)置最大motif 6，最小和最大寬度為50和100，其他參數(shù)設(shè)置為默認值［23］.MEMESuite（5.0.5）進行PME的保守基序掃描，ExPASYPROTPARAM工具（http：//web.expasy.org/protparam/）進行PME基因的基因表達譜分析及可視化［21］.

2 結(jié)果

2.1 綠豆PMEs基因鑒定及蛋白特征

通過與擬南芥直系同源比對分析，從綠豆基因組中鑒定出80個PME基因家族成員，根據(jù)先前報道的命名規(guī)則［24］，將其命名為VrPME01-VrPME80.對應(yīng)的UniProt基因ID和蛋白質(zhì)基本特征及亞細胞定位列于表1.綠豆PMEs蛋白序列長度介于131～634 aa，分子量為14 550～6 270 Da，等電點（PIs）為4.74～9.73.亞細胞預(yù)測將PMEs定位于細胞壁、細胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、質(zhì)膜和葉綠體中，其中定位于細胞質(zhì)外基質(zhì)的PMEs最多（39個）.綠豆的PME基因包含兩種類型，52個（VrPME01～VrPME53，除VrPME48外）為N端含有Pro區(qū)的Ⅰ型，26個（VrPME54～Vr-PME80，除VrPME75和VrPME78）屬于Ⅱ型.

表1 綠豆PME蛋白質(zhì)特征Tab.1 Characteristics of the PME protein of mung bean

續(xù)上表

2.2 綠豆PMEs基因結(jié)構(gòu)

對3個物種PME的motif和基因結(jié)構(gòu)進行比較分析，91%的PME包含相同的6個保守基序，同源關(guān)系較近的成員具有相似的外顯子及內(nèi)含子，其他PME基因的外顯子之間大小存在一定差異，72.5%的VrPMEs含有2～3個內(nèi)含子，其中VrPME45和VrPME79只有1個內(nèi)含子，25%VrPME含有4～5個內(nèi)含子（見圖1（c））.保守結(jié)構(gòu)域分析表明，Vr-PME01～VrPME53（VrPME48除外）具有PMEI域，而VrPME54～VrPME80（除VrPME75和VrPME78外）不包含PMEI域（見圖2）.

圖1 綠豆PMEs親緣關(guān)系（a）、保守motif（b）和基因結(jié)構(gòu)（c）Fig.1 Phylogenetic relationship（a），conserved motif（b），and structure of mung bean PMEs（c）

圖2 綠豆PME蛋白結(jié)構(gòu)域Fig.2 Domains of mung bean PME proteins

2.3 綠豆PMEs基因表達譜

轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示80個綠豆PMEs中只有17個在根、莖和葉中表達，如圖3所示，綠豆中Vr-PMEs的表達量基本呈現(xiàn)根＞莖＞葉.其中，Vr-PME16和VrPME11基因在根中的表達量最高，且在第1天VrPME16和VrPME11表達量TPM值分別高達444.9和197.8；在第9天分別為177.7和37.1；VrPME11和VrPME12在莖中的表達量最高，且在第1天VrPME11和VrPME12基因表達量分別為260.3和49.8；在葉中表達量最高的基因是VrPME06，在第5天表達量最高為94.16（TPM），其他基因的表達量均在10以下.此外，VrPME66在莖和葉中均表達，但在根中未表達.

圖3 綠豆PMEs在根、莖和葉中的表達譜Fig.3 Expression pattern of mung bean PMEs in root，stem，and leaf tissues

2.4 Cd脅迫對Vr PMEs表達的影響

轉(zhuǎn)錄組分析表明，100μmol/L Cd處理下，綠豆PME家族成員的表達存在較大差異（見圖4）.在根中，Cd處理顯著上調(diào)了VrPME16、VrPME21和Vr-PME25，平均上調(diào)倍數(shù)為3.52；顯著下調(diào)了14個基因，平均下調(diào)倍數(shù)為1.89倍，其中VrPME03、Vr-PME06、VrPME07、VrPME10和VrPME12顯著下調(diào)表達，平均下調(diào)3.78倍；

圖4 Cd脅迫下綠豆PMEs表達的變化Fig.4 Changes in expression level of mung bean PMEs in response to Cd stress

在莖中，Cd處理顯著上調(diào)了VrPME11和Vr-PME16，平均上調(diào)倍數(shù)為2.69倍，其中VrPME16顯著上調(diào)4.44倍；顯著下調(diào)了14個基因，平均下調(diào)倍數(shù)為1.43.

在葉中，Cd處理上調(diào)了8個基因，平均上調(diào)倍數(shù)為0.37；下調(diào)了8基因，平均下倍數(shù)為0.91.其中，VrPME10在Cd脅迫葉中未表達.雖然葉片中上調(diào)基因的個數(shù)最多，但最大上調(diào)基因VrPME25在第1 d被上調(diào)2.32倍，其他基因的上調(diào)倍數(shù)均較小.上述結(jié)果表明，Cd脅迫對綠豆根和莖中PMEs表達影響最大，而對葉中PME表達影響最小.

2.5 Cd脅迫對綠豆幼苗PME酶活性的影響

為了進一步了解Cd脅迫下VrPMEs表達變化是否與酶活性變化相關(guān)，本文對PME酶活性進行了測定.結(jié)果表明，在根中，Cd處理組和對照組PME酶活性都隨生長時間延長呈現(xiàn)顯著下降趨勢，Cd處理后的PME酶活性在3個時間點均升高，平均升高1.25倍.在第1 d、5 d、9 d PME酶活性分別比對照提高了的6%、32%倍和85%倍（見圖5（a））.在莖中，Cd處理第1 d和5 d PME酶活性分別比對照降低了的0.5%和13%，第9 d比對照提高了18%（見圖5（b））.在葉中，Cd處理第1 d、5 d PME酶活性分別比對照降低了的1%、23%和30% （見圖5（c））.上述結(jié)果表明，Cd脅迫顯著升高根中PME酶活性，而降低葉中PME活性，短期（1天）Cd脅迫幾乎不改變莖和葉中PME活性，長期（9天）Cd脅迫升高根和莖中PME酶活性.根中PME酶活性參與了對Cd脅迫的響應(yīng)，這一結(jié)果與Cd脅迫對Vr-PMEs表達的影響基本一致.

圖5 Cd脅迫對綠豆根、莖和葉中PME酶活性的影響Fig.5 Effects of Cd stress on the activity of PME enzyme in root，stem，and leaf tissues

3 討論

本次研究從綠豆基因組中鑒定了80個PME基因，已有研究在擬南芥［3-4］、大豆［25］、水稻［7］、番茄［4］和棉花［2］基因組中分別鑒定出66、124、59、79和80個PME基因.顯然，不同物種PME家族基因數(shù)量差異較大，綠豆具有較多的PME家族基因數(shù).PME蛋白的預(yù)測表明，VrPME蛋白的肽鏈長度、等電點和分子量等差異較大.亞細胞定位預(yù)測表明，綠豆PME蛋白分布于不同的細胞器中，包括細胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、質(zhì)膜、葉綠體等，這一結(jié)果與PME蛋白在葡萄中亞細胞定位預(yù)測結(jié)果有所不同，在葡萄中部分PME蛋白在線粒體中也有表達，但在葉綠體中未表達［26］.這說明了PME蛋白在細胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和質(zhì)膜中能發(fā)揮穩(wěn)定的生物學(xué)功能.

大多數(shù)VrPME是保守蛋白，且所有蛋白含有PMEI保守結(jié)構(gòu)域.大部分VrPMEs含有2～3個外顯子，只有少部分基因含有4～6個數(shù)外顯子，這與棉花PME基因所呈現(xiàn)出的結(jié)果完全一致［27］.綜上，PME在基因結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)均呈現(xiàn)出具有相對穩(wěn)定的進化方向，其功能具有穩(wěn)定性.

PME由高爾基體合成并釋放到細胞壁中，催化甲基酯化及果膠脫甲酯化［28］.PME在細胞壁的形成和果膠的重塑中起重要作用［8］.研究發(fā)現(xiàn)PME基因在植物生長中起重要作用.在本研究中，轉(zhuǎn)錄組揭示17個VrPMEs在綠豆根、莖和葉中表達（見圖3），其表達量呈現(xiàn)根＞莖＞葉.VrPME66具有組織特異性，在莖和葉中表達，但在根中未表達.在擬南芥的發(fā)育過程中，編碼PME的At4g02330主要在花組織、柱頭、微管組織和花粉粒中表達［3］，編碼PME的At2g47550可能參與花粉和花粉管的發(fā)育，而At4g02330可能參與細胞壁的果膠代謝，調(diào)節(jié)細胞分離和花瓣脫落［3］；葡萄中，大多數(shù)PME存在于漿果和卷須中，并在花序中高度表達［29-30］，PMEs呈現(xiàn)組織特異性表達模式，可能與PMEs的擴增、進化以及植物生長發(fā)育的復(fù)雜性有關(guān)［17］.本文分析了17個VrPMEs對Cd脅迫的響應(yīng)，結(jié)果表明，Cd脅迫下，在根、莖和葉中被顯著上調(diào)的基因數(shù)量分別為3、3和8個，平均上調(diào)倍數(shù)分別為3.25、1.8和0.37.其中VrPME06、VrPME21和VrPME25在根中被強烈上調(diào)，在根中被顯著上調(diào)的基因且都屬于Type-1，Vr-PME16在莖中顯著上調(diào)4.44倍（見圖4）.Hongo等［31］發(fā)現(xiàn)Ⅰ型PME AtPME35（At3g59010）通過介導(dǎo)皮層細胞和纖維束間的初級細胞壁去甲基酯化來加強擬南芥莖的功能，AtPME35的特異性表達是莖機械強度所必需的.VrPME16、VrPME21和VrPME25的pI為8.9、8.61和8.87，與AtPME35 pI 8.70相近，因此它們也可能具有類似于AtPME35的去甲基酯化活性.VrPME16、PtoPME35和AtPME35的氨基酸序列高度相似.楊樹PtoPME35在干旱脅迫的莖中高度表達［32］.這些證據(jù)表明組織特異性表達對于PME響應(yīng)非生物脅迫功能多樣性非常重要.這為果膠不僅在初級細胞壁中起作用，而且在次級細胞壁中起作用提供了新的證據(jù).

Cd脅迫使綠豆根中PME酶活平均升高了25%（見圖5（a）），而莖中酶活性平均只升高了0.5%（見圖5），表明根中PME酶在響應(yīng)Cd脅迫中起作用，而莖和葉中PME酶對Cd脅迫不響應(yīng).并且鎘脅迫根中PME酶活性在第1天最大，隨著Cd脅迫的時間推移，PME酶活性逐漸降低，這與鹽脅迫對擬南芥PME酶活性影響一致［33］.有研究發(fā)現(xiàn)一定濃度Al3+刺激水稻PME酶活性升高［34］，低溫脅迫導(dǎo)致擬南芥和油菜（Brassica napus L.）PME酶活性升高［35-36］.此外，Al、Pb和Cu脅迫均導(dǎo)致水稻PME酶活性顯著提高，果膠含量顯著上升，果膠甲酯化程度顯著降低的趨勢［37］.這些結(jié)果表明，重金屬脅迫導(dǎo)致植物PME酶活性升高，強調(diào)PME基因及其酶在植物響應(yīng)重金屬中起重要作用.綜上所述，PME在植物響應(yīng)非生物脅迫中的功能及其機制仍有待揭示.

4 結(jié)論

基因組和轉(zhuǎn)錄組結(jié)果表明，PME基因不僅在植物的生長和發(fā)育中起重要功能，而且通過改變細胞壁的結(jié)構(gòu)和功能植物響應(yīng)非生物脅迫中起重要作用.在植物響應(yīng)重金屬Cd脅迫中，根PME基因及其酶具有更為直接的作用，而莖和葉PME基因及其酶僅為弱響應(yīng).