不同處理方法對蛋清蛋白免疫原性及結(jié)構(gòu)的影響

王 晨，馬艷秋，張梓湘，張龍媛，遲玉杰,*，遲 媛

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

我國雞蛋產(chǎn)量位居于世界第一，雞蛋營養(yǎng)豐富、價(jià)格低廉，是人們?nèi)粘Ｉ钪兄饕牡鞍踪|(zhì)來源之一，由于其高營養(yǎng)價(jià)值和優(yōu)良的功能特性而被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中。但雞蛋也是引起人體過敏最常見的食物之一，其致敏對象主要以嬰幼兒和兒童為主。雞蛋所致過敏主要是蛋清中蛋白引起的，其中最主要的4 種過敏原分別是卵白蛋白、卵類黏蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白和溶菌酶。隨著雞蛋產(chǎn)量的增加和應(yīng)用范圍的擴(kuò)大，雞蛋過敏人群數(shù)量也隨之增加。因此，探究改性方法降低雞蛋致敏性對開發(fā)低致敏性產(chǎn)品具有一定的實(shí)際意義。

目前，解決雞蛋過敏問題常采用單一的物理法和化學(xué)法，熱加工、酶解及高壓等是主要的食物脫敏方法。其中，酶解法是最為有效的降低食物致敏性的方法之一，具有條件溫和、高效及特異性強(qiáng)等特點(diǎn)。Kasera等采用堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶酶解3 種豆科植物，結(jié)果表明酶水解可有效地降低豆類蛋白質(zhì)的致敏性，并可用于制備低過敏性食物提取物。王艷等利用不同蛋白酶水解蛋清蛋白，其中堿性蛋白酶與木瓜蛋白酶水解能有效地降低蛋清蛋白的致敏性。微波是一種新興的降低食物致敏性技術(shù)，其具有高效、節(jié)能及操作簡便等優(yōu)勢，已被廣泛應(yīng)用于干燥和殺菌等加工領(lǐng)域。近年來，有學(xué)者研究利用微波和微波輔助酶水解降低食物致敏性，董曉穎等采用微波處理蝦過敏蛋白，通過間接酶聯(lián)免疫吸附測試（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法測定抗原性變化，結(jié)果顯示微波處理降低了蛋白致敏性；Izquierdo等采用微波和酶聯(lián)合處理牛乳清蛋白，結(jié)果顯示，酶與微波處理相結(jié)合能更有效地降低乳清蛋白免疫原性；Ketnawa等研究發(fā)現(xiàn)微波處理后的魚骨蛋白水解產(chǎn)物抗原性均顯著降低。綜上，微波和酶解處理可改變食物過敏蛋白的免疫原性。目前，國內(nèi)外對降低蛋白致敏性技術(shù)的研究主要集中于單一的處理方式，對復(fù)合處理手段的研究相對較少，并且對蛋清蛋白致敏性和結(jié)構(gòu)特性變化關(guān)系的研究較少。本團(tuán)隊(duì)前期研究采用高壓微射流降低蛋清蛋白的致敏性并得到較理想的效果，故在對蛋清蛋白采用單一方法改性的基礎(chǔ)上，本研究采用微波、酶解、微波協(xié)同酶解處理蛋清蛋白，通過ELISA法對蛋白免疫原性變化進(jìn)行探究，并采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、傅里葉變換紅外光譜、內(nèi)源熒光光譜、外源熒光光譜及紫外光譜等方法對不同處理前后蛋清蛋白樣品結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，從而探究不同處理方法對蛋清蛋白免疫原性及結(jié)構(gòu)性質(zhì)的影響，為開展后續(xù)研究工作提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮雞蛋采購于哈爾濱市好又多超市，4 ℃冷藏備用。

堿性蛋白酶（2×10U/g）、菠蘿蛋白酶（1.2×10U/g）、木瓜蛋白酶（6×10U/g）、中性蛋白酶（2×10U/g）、胰蛋白酶（250 NFU/mg） 南寧東恒華道生物科技有限責(zé)任公司；ELISA試劑盒 美國BioFront Technologies公司；8-苯胺-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、考馬斯亮藍(lán)G-250染液等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JJ-1精密增力電動攪拌機(jī) 上海浦東物理化學(xué)儀器廠；TU-1810紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；多功能酶標(biāo)儀 鄭州美生商貿(mào)有限公司；RF-6000型熒光分光光度計(jì) 日本島津制作所；傅里葉變換紅外光譜儀 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；電泳儀 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋清液的制備及處理

市售的新鮮雞蛋經(jīng)清洗后打蛋，分離出蛋清，用鑷子挑出系帶，用電動攪拌機(jī)在300 r/min下攪拌2 h，然后用紗布過濾多余雜質(zhì)，得到新鮮蛋清液，置于4 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 微波處理

將蛋清用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 8.0）進(jìn)行1∶1稀釋，再進(jìn)行微波處理，當(dāng)微波功率為700 W時(shí)，微波時(shí)間分別為10、15、20、30、40 s；當(dāng)微波時(shí)間為30 s時(shí)，微波功率分別為70、280、420、560、700 W。

1.3.3 酶解處理

將已處理的蛋清用PBS進(jìn)行1∶1稀釋，分別在各蛋白酶最適反應(yīng)溫度與最適反應(yīng)pH值（表1）下進(jìn)行水解。分別加入0.6%（以體系質(zhì)量計(jì)，后同）的堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶和胰蛋白酶，于水浴振蕩器中振蕩反應(yīng)30 min，滅酶10 min；加入堿性蛋白酶，酶添加量分別為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%，于水浴振蕩器中振蕩反應(yīng)30 min，滅酶10 min。

表1 各蛋白酶的最適反應(yīng)溫度及反應(yīng)pH值Table 1 Optimum temperature and pH for proteases tested in this study

1.3.4 微波協(xié)同酶解處理

選取微波處理700 W/20 s后的蛋清進(jìn)行酶解處理，分別加入0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的堿性蛋白酶，反應(yīng)30 min，滅酶10 min。

1.3.5 酶聯(lián)免疫吸附測試

參照聶君等的方法，選用ELISA法分析蛋清蛋白免疫原性。取0.5 mL上述不同條件處理后的蛋清蛋白樣品，加入9.5 mL稀釋后的ELISA試劑盒抽提緩沖液（使用前預(yù)熱至60 ℃），在60 ℃下提取10 min。室溫下離心10 min，過濾。吸取200 μL樣品到96 孔板中孵育10 min，洗滌3 次，每孔中加入100 μL抗體/辣根過氧化物酶底物，孵育后洗滌，最后加入100 μL ELISA試劑盒終止液，在450 nm波長處測其吸光度。具體方法操作參考ELISA試劑盒說明書。根據(jù)原始吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)軟件分析得到未處理蛋清蛋白質(zhì)量濃度為/（μg/mL），處理后蛋清蛋白質(zhì)量濃度為/（μg/mL）。按下式計(jì)算經(jīng)不同條件處理后蛋清蛋白免疫原性降低率。

1.3.6 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析

制備12%的分離膠和5%的濃縮膠，將蛋清蛋白樣品用pH 8.0的PBS稀釋至1 mg/mL，與上樣緩沖液按體積比3∶1混合后加熱煮沸5 min，然后1 500 r/min離心3 min。樣品上樣量為10 μL，先80 V電泳1 h后，將電壓調(diào)至120 V，直到電泳結(jié)束。用考馬斯亮藍(lán)G250對凝膠進(jìn)行染色，然后脫色直到清晰條帶出現(xiàn)。拍攝凝膠并觀察蛋清體系中蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的變化。

1.3.7 內(nèi)源性熒光光譜分析

將蛋清蛋白樣品用pH 8.0的PBS稀釋至0.1 mg/mL，在激發(fā)波長280 nm，發(fā)射波長300～420 nm條件下進(jìn)行光譜掃描，并記錄最大發(fā)射波長的熒光強(qiáng)度。

1.3.8 紫外光譜分析

將不同條件處理前后的蛋清蛋白樣品用pH 8.0的PBS稀釋至2 mg/mL，設(shè)置掃描波長為240～400 nm，掃描速率100 nm/min，帶寬為5.0 nm，間隔為1.0 nm，響應(yīng)時(shí)間為0.2 s，光徑為1 cm。重復(fù)掃描3 次，累加得到紫外掃描光譜圖。

1.3.9 傅里葉變換紅外光譜分析

取適量蛋清蛋白樣品置于衰減全反射附件上，使用OMNIC軟件，在4 000～400 cm范圍內(nèi)進(jìn)行全波段掃描，掃描分辨率為4 cm，并通過扣除水背景進(jìn)行基線校準(zhǔn)。基于二階傅里葉變換紅外光譜，使用Peakfit 4.12軟件定量計(jì)算蛋白的二級結(jié)構(gòu)。

1.3.10 外源性熒光光譜

選用熒光探針法測定蛋清蛋白的表面疏水性，用pH 8.0的PBS調(diào)整蛋白質(zhì)量濃度，使其質(zhì)量濃度梯度為0.25～2.00 mg/mL，取4 mL樣液加入20 μL 8 mmol/L的ANS試劑混勻，在室溫條件下避光反應(yīng)15 min，隨后設(shè)置外源性熒光光譜儀參數(shù)：激發(fā)波長390 nm、發(fā)射波長470 nm、狹縫5 nm，測定樣品相對熒光強(qiáng)度，以相對熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)、蛋白質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)作圖，以曲線斜率表示樣品的表面疏水性（）。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

運(yùn)用Microsoft Excel 2019軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)中所有結(jié)果均是3 次測定的平均值。采用OriginPro 9.0軟件對傅里葉變換紅外光譜、紫外光譜、熒光光譜等圖譜結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 微波處理對蛋清蛋白免疫原性的影響

由圖1可知，與未經(jīng)微波處理的蛋清蛋白樣品比較，微波處理后樣品的吸光度均有一定程度的降低，表明微波處理后的蛋清蛋白免疫原性有所降低，且蛋清蛋白樣品的免疫原性與微波功率呈負(fù)相關(guān)，當(dāng)微波功率達(dá)到700 W時(shí)，其免疫原性降低最明顯，表明在該處理?xiàng)l件下對蛋清蛋白的免疫原性影響最大。究其原因是微波的熱效應(yīng)迫使蛋清蛋白分子發(fā)生折疊，隱藏了部分免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）G的結(jié)合表位，使其免疫原性降低，隨著微波功率進(jìn)一步增加，蛋白分子可能發(fā)生了分子內(nèi)或分子間的聚集，導(dǎo)致部分IgG的結(jié)合表位被更多地隱藏或破壞，免疫原性進(jìn)一步降低。由圖2可知，當(dāng)微波功率一定時(shí)，蛋清蛋白免疫原性降低率隨著處理時(shí)間的延長呈先上升后下降趨勢，這可能是隨著微波時(shí)間的延長，蛋清蛋白空間伸展，暴露出部分表位，但數(shù)量遠(yuǎn)少于被隱藏的表位，所以其免疫原性整體仍呈降低趨勢。微波處理?xiàng)l件為700 W/20 s的蛋清蛋白樣品免疫原性降低率最高，降低了50.81%。這與陳紅兵等的研究結(jié)果一致，其研究證實(shí)了微波處理可以一定程度降低蛋清蛋白潛在的致敏性，并且所有條件下處理后的蛋清樣品結(jié)構(gòu)均發(fā)生改變。Lamacchia等的研究也表明小麥籽粒經(jīng)微波處理后，其抗原性明顯降低。

圖1 不同微波功率處理對蛋清蛋白免疫原性的影響Fig. 1 Effects of microwave power on immunogenicity of egg white protein

圖2 不同微波時(shí)間處理對蛋清蛋白免疫原性的影響Fig. 2 Effects of microwave time on immunogenicity of egg white protein

2.2 酶解處理對蛋清蛋白免疫原性的影響

酶水解會降低食物蛋白質(zhì)的部分過敏原表位數(shù)量，從而達(dá)到降低其致敏性的效果，其中蛋白酶的添加量和種類等是影響蛋白質(zhì)致敏性的主要因素。由圖3可以看出，不同蛋白酶酶解處理的蛋清蛋白樣品免疫原性都有一定程度的降低。其中菠蘿蛋白酶酶解后，蛋清蛋白免疫原性殘留量最低，最終免疫原性降低了61.22%。其次是堿性蛋白酶，降低了約55.83%。由于每種蛋白酶的作用位點(diǎn)不同，對蛋清過敏蛋白的水解能力不同，因此蛋清蛋白經(jīng)處理后得到的免疫原性降低率各不相同。王艷等的研究也指出不同酶水解蛋清蛋白后，蛋清蛋白致敏性均降低，其中堿性蛋白酶處理后抗原性降低最明顯。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示采用堿性蛋白酶酶解得到的蛋清蛋白免疫原性降低率僅略低于菠蘿蛋白酶，但考慮到蛋清pH值呈堿性，堿性蛋白酶最適pH值為8.0，因此選擇堿性蛋白酶進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。由圖4可知，隨著堿性蛋白酶添加量的增加，蛋清蛋白免疫原性呈降低的趨勢，當(dāng)?shù)鞍酌柑砑恿康?.8%及以上時(shí)，免疫原性的變化趨于平緩。由于酶解改變了過敏原的構(gòu)象表位，一般情況下構(gòu)象表位在水解開始后就會被迅速破壞。而隨著酶添加量的增加，蛋白質(zhì)被水解的程度也逐漸增大，堿性蛋白酶更多地作用在抗原表位上，從而達(dá)到降低免疫原性的效果。綜上所述，酶水解能有效地降低蛋清蛋白免疫原性，但其免疫原性仍然存在，因此后續(xù)的研究可對蛋清樣品采用物理法協(xié)同酶水解處理，來進(jìn)一步降低蛋清蛋白的免疫原性。

圖3 不同酶種類處理對蛋清蛋白免疫原性的影響Fig. 3 Effects of different proteases on immunogenicity of egg white protein

圖4 不同酶添加量處理對蛋清蛋白免疫原性的影響Fig. 4 Effects of enzymatic hydrolysis with different enzyme dosages on immunogenicity of egg white protein

2.3 微波協(xié)同酶解處理對蛋清蛋白免疫原性的影響

固定微波條件為700 W/20 s，以堿性蛋白酶添加量為變量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，如圖5所示，隨著蛋白酶添加量的增加，蛋清蛋白免疫原性降低率整體呈上升趨勢，當(dāng)?shù)鞍酌傅奶砑恿繛?.8%時(shí)，蛋清蛋白樣品的免疫原性下降程度最高，降低了67.48%。與未處理和單獨(dú)堿性蛋白酶處理的樣品相比，通過微波和堿性蛋白酶結(jié)合處理所得到的樣品免疫原性降低更明顯，這是由于微波加快了蛋白酶水解蛋白的速率，微波處理下形成的折疊蛋白可以作為蛋白酶作用的理想底物，使一些表位更容易被酶水解，進(jìn)而減少部分過敏原表位數(shù)量。隨著蛋白酶添加量進(jìn)一步增加，蛋白水解的程度增大，蛋白酶更多地作用在抗原表位上，使免疫原性繼續(xù)降低。綜上，酶解和微波聯(lián)合處理有助于降低蛋清蛋白的免疫原性，且保留了酶活性和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)修飾的可逆熱變性，對于降低蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)性可能具有實(shí)際意義。也有研究報(bào)道了與未處理的樣品和單獨(dú)的酶處理樣品相比，通過微波與鏈霉蛋白酶、木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶聯(lián)合處理獲得的乳清蛋白水解物免疫反應(yīng)性顯著降低，證明微波輔助酶解處理有助于降低蛋白水解產(chǎn)物的抗原性。

圖5 不同微波協(xié)同酶解處理對蛋清蛋白免疫原性的影響Fig. 5 Effects of microwave-assisted enzymatic hydrolysis with different enzyme dosages on immunogenicity of egg white protein

2.4 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析結(jié)果

卵白蛋白分子質(zhì)量主要分布在44 kDa處，卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的分子質(zhì)量約為76 kDa，卵類黏蛋白的分子質(zhì)量約為28 kDa，溶菌酶的分子質(zhì)量約為14.3 kDa。如圖6所示，與未處理蛋清蛋白樣品相比，微波處理后的蛋清蛋白樣品條帶灰度輕微變淺，表明蛋清蛋白質(zhì)量濃度發(fā)生了一定程度的降低，這是微波處理使部分蛋清蛋白變性所致，該結(jié)果與文獻(xiàn)[17]的研究結(jié)果一致。從堿性蛋白酶處理蛋清蛋白結(jié)果可以看出，目標(biāo)條帶與未處理蛋清蛋白條帶相比灰度變得較淺，在14.4～45.0 kDa之間出現(xiàn)一些新條帶，說明蛋清蛋白經(jīng)堿性蛋白酶作用后部分被水解為蛋白片段。而經(jīng)酶解和微波協(xié)同酶解處理的樣品在電泳圖上呈現(xiàn)出較為一致的結(jié)果，卵轉(zhuǎn)鐵蛋白條帶幾乎完全消失，說明卵轉(zhuǎn)鐵蛋白不穩(wěn)定，易發(fā)生聚集。與單一酶解處理相比，微波處理下蛋白質(zhì)降解反應(yīng)發(fā)生得更快。電泳只能從一個(gè)側(cè)面反映出過敏蛋白分子的水解效果，并不能反映抗原性的具體變化，因此采用傅里葉紅外變換光譜和熒光光譜等對蛋清蛋白的結(jié)構(gòu)變化進(jìn)一步研究。

圖6 不同處理前后蛋清蛋白的SDS-PAGE圖Fig. 6 SDS-PAGE patterns of egg white protein subjected to different treatments

2.5 傅里葉變換紅外光譜分析結(jié)果

通過紅外光譜可進(jìn)一步分析蛋清蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化規(guī)律。紅外圖譜主要有幾組特征吸收譜帶，分別為酰胺I帶（1 600～1 700 cm）和酰胺II帶（1 530～1 550 cm）。其中，酰胺I帶主要反映C＝O伸縮振動，最常用于分析蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)；酰胺II帶反映了N—H變形振動或C—N伸縮振動；在3 200～3 400 cm的吸收峰反映了O—H和N—H的伸縮振動。由圖7可知，不同方法處理蛋清蛋白的紅外光譜都有所差異。4 種樣品都在酰胺I帶出現(xiàn)了特征吸收現(xiàn)象，而O—H或N—H與C＝O之間形成的氫鍵比O—H自身形成的氫鍵所引起的特征現(xiàn)象更明顯。未處理的蛋清蛋白在酰胺I帶的吸收峰在1 656.26 cm處，經(jīng)微波和酶解處理的蛋清蛋白分別遷移到1 656.86 cm和1 656.58 cm處，酰胺基譜帶的變化說明微波與酶解條件對蛋清蛋白的二級結(jié)構(gòu)造成了影響，其中微波協(xié)同酶解處理使-折疊數(shù)量減少的程度更大。經(jīng)過協(xié)同處理后，蛋清蛋白的酰胺基吸收峰遷移到1 655.91 cm處，向短波數(shù)移動，表明協(xié)同處理使N—H與C＝O形成的氫鍵總量增加。未處理蛋清蛋白的N—H伸縮振動峰在1 541.15 cm處，微波、酶解和微波協(xié)同酶解處理后，N—H伸縮振動峰分別遷移至1 540.43、1 540.35 cm和1 541.08 cm，峰強(qiáng)度也有不同程度的增加。這是分子間或分子內(nèi)的氫鍵締合作用產(chǎn)生氫鍵，使N—H和O—H的鍵常數(shù)減小，相應(yīng)基團(tuán)的振動偶極矩變化增大，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)的變化。不同處理樣品在3 300 cm附近的峰發(fā)生了不同程度的遷移，主要是蛋白質(zhì)分子中N—H伸縮振動與氫鍵形成了締合體，蛋清蛋白的二級結(jié)構(gòu)中-螺旋或無規(guī)卷曲相對含量提高的緣故。

圖7 不同處理?xiàng)l件下蛋清蛋白的紅外光譜Fig. 7 Infrared spectra of egg white under different treatment conditions

根據(jù)研究報(bào)道，蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)與紅外光譜各子峰存在對應(yīng)關(guān)系，即-螺旋結(jié)構(gòu)對應(yīng)波數(shù)范圍為1 650～1 659 cm，-折疊結(jié)構(gòu)對應(yīng)波數(shù)范圍為1 610～1 639 cm，-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)對應(yīng)波數(shù)范圍為1 660～1 700 cm，無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)對應(yīng)的波數(shù)范圍為1 640～1 649 cm，據(jù)此計(jì)算出的各二級結(jié)構(gòu)相對含量，如表2所示。未處理的蛋清蛋白樣品，-螺旋相對含量為22.30%，-折疊相對含量為27.23%，-轉(zhuǎn)角相對含量為28.08%，無規(guī)卷曲相對含量為22.40%。與未處理蛋清蛋白相比，700 W微波處理20 s蛋清蛋白樣品-螺旋、-折疊和無規(guī)卷曲相對含量均有所增加，-轉(zhuǎn)角相對含量降低，表明蛋白質(zhì)分子間的相互作用會導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)的改變，在蛋白質(zhì)受微波作用變性時(shí)，由于疏水殘基的暴露導(dǎo)致部分展開分子間相互交聯(lián)，從而形成-折疊結(jié)構(gòu)。對于酶解和微波協(xié)同酶解處理的樣品，其蛋白質(zhì)中各二級結(jié)構(gòu)相對含量均發(fā)生變化，-螺旋和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)相對含量均有所增加，而-折疊和-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)相對含量相應(yīng)降低。這是由于酶解與協(xié)同處理都使蛋清蛋白二級結(jié)構(gòu)的螺旋結(jié)構(gòu)展開，蛋白分子結(jié)構(gòu)得到伸展，從而導(dǎo)致隱藏在蛋白分子內(nèi)部的抗原表位暴露在分子表面，進(jìn)而降低了其免疫原性，這與Golias等研究結(jié)果基本一致。綜上，不同方法處理蛋清樣品吸收峰峰位因處理?xiàng)l件的不同會發(fā)生不同程度的變化，蛋清蛋白的二級結(jié)構(gòu)被破壞，蛋白分子中官能團(tuán)所構(gòu)成的-螺旋、-折疊和-轉(zhuǎn)角含量也會發(fā)生變化，它們之間在不同作用下相互轉(zhuǎn)化或者轉(zhuǎn)化為無規(guī)卷曲。

表2 不同處理對蛋清蛋白二級結(jié)構(gòu)相對含量的影響Table 2 Effects of different treatments on the secondary structure content of egg white protein

2.6 內(nèi)源性熒光光譜分析結(jié)果

激發(fā)的蛋白內(nèi)源熒光光譜可以反映是否存在色氨酸、酪氨酸以及苯丙氨酸，主要以色氨酸為蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的反映指標(biāo)，探究蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的變化。不同方法改性前后蛋清蛋白樣品的內(nèi)源熒光光譜如圖8所示，相比于未處理蛋清蛋白，酶解處理后的蛋清蛋白具有更高的熒光強(qiáng)度，主要是因?yàn)樵趬A性蛋白酶的作用下，掩埋在分子內(nèi)部的疏水區(qū)域被破壞，使色氨酸基團(tuán)暴露于溶劑中。并且酶解后的蛋清蛋白最大波長發(fā)生了輕微的紅移，表明蛋白構(gòu)象被破壞，更多的色氨酸從蛋白質(zhì)分子內(nèi)部非極性環(huán)境中逐漸暴露出來。酶解改變了蛋清蛋白的三級結(jié)構(gòu)，使過敏原失去原有的活性從而導(dǎo)致蛋白免疫原性降低。微波處理蛋清蛋白樣品的內(nèi)源熒光強(qiáng)度低于未處理樣品，是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)發(fā)生了折疊，部分生色基團(tuán)被破壞或者掩埋，蛋白因相互聚集掩蓋了過敏反應(yīng)的反應(yīng)位點(diǎn)，引起免疫原性的改變。微波協(xié)同酶解處理樣品內(nèi)源熒光強(qiáng)度高于單一微波處理樣品，但低于未處理與單一酶解處理的樣品，蛋清蛋白樣品并沒有發(fā)生明顯的變化，主要是微波的熱效應(yīng)使蛋白質(zhì)聚集，酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸殘基被包埋于分子內(nèi)部，而后隨著酶解處理，蛋白質(zhì)分子先伸展從而暴露出部分生色基團(tuán)，或者是蛋白質(zhì)分子之間產(chǎn)生了交聯(lián)，表面形成了新的生色基團(tuán)而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度的增大，但新形成的生色基團(tuán)數(shù)量遠(yuǎn)少于最初被包埋的基團(tuán)，所以總體上生色基團(tuán)數(shù)量仍減少，致使熒光強(qiáng)度低于未處理的樣品。微波促進(jìn)酶水解的同時(shí)也加快了過敏原構(gòu)象表位的變化，使其免疫原性降低更明顯。

圖8 不同處理前后蛋清蛋白內(nèi)源性熒光光譜Fig. 8 Fluorescence spectra of egg white protein under different treatment conditions

2.7 紫外光譜分析結(jié)果

蛋白質(zhì)產(chǎn)生的紫外吸收光譜主要是由色氨酸和酪氨酸殘基側(cè)鏈對紫外光的吸收所形成，氨基酸殘基的微環(huán)境由蛋白分子的構(gòu)象決定，一旦蛋白分子的構(gòu)象改變，所處的微環(huán)境發(fā)生改變，生色基團(tuán)的紫外吸收光譜隨之發(fā)生改變。如圖9所示，蛋清蛋白樣品經(jīng)過不同方法處理后，紫外吸光度均發(fā)生變化，表明蛋白分子構(gòu)象發(fā)生了變化，抗原的構(gòu)象表位遭到破壞，故蛋白的免疫原性降低。相比于未處理的蛋清蛋白樣品，微波處理蛋清蛋白樣品的紫外吸光度降低，這是由于蛋白分子發(fā)生聚集，芳香族氨基酸殘基被掩藏于蛋白分子內(nèi)部，不能發(fā)揮其顯色作用。經(jīng)酶解及微波協(xié)同酶解處理樣品的吸光度較未處理樣品均出現(xiàn)一定程度的增加，表明酶解使蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)展開，色氨酸和酪氨酸殘基暴露于分子表面，導(dǎo)致其紫外吸光度升高。復(fù)合處理的樣品先是在微波條件下蛋白質(zhì)分子發(fā)生聚集，隨著酶解的進(jìn)行，蛋白結(jié)構(gòu)展開，疏水基團(tuán)暴露出來，使其紫外吸光度升高，總體芳香族氨基酸殘基暴露量低于單一酶解改性樣品，故紫外吸光度低于酶水解處理的樣品。Ai Minmin等研究采用不同蛋白酶水解皮蛋清凝膠，結(jié)果表明蛋清酶解產(chǎn)物的紫外吸光度均發(fā)生了不同程度的增加，說明酶水解改變了蛋白結(jié)構(gòu)。

圖9 不同處理?xiàng)l件下蛋清蛋白紫外吸收光譜Fig. 9 UV absorption spectra of egg white protein under different treatment conditions

2.8 表面疏水性分析結(jié)果

疏水相互作用是維持蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的主要作用力，ANS與蛋白質(zhì)結(jié)合的熒光強(qiáng)度與蛋白的表面疏水性呈正相關(guān)，利用外源性熒光光譜對不同方法處理蛋清蛋白樣品的疏水性進(jìn)行分析，如圖10所示，酶解、微波和微波協(xié)同酶解處理蛋清蛋白樣品的表面疏水性均比未處理樣品高，且經(jīng)過微波協(xié)同酶解處理的樣品表面疏水性最高，這可能是堿性蛋白酶的作用使包埋在蛋白內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露，從而導(dǎo)致表面疏水性的增加。也可能是水解使蛋白結(jié)構(gòu)部分展開，導(dǎo)致掩埋在蛋白質(zhì)中的疏水位點(diǎn)暴露。微波700 W處理20 s的蛋清蛋白樣品由于蛋白質(zhì)分子相互作用，從而使蛋白質(zhì)內(nèi)部疏水基團(tuán)暴露在表面，增加了與ANS的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)量。在此過程中，蛋清蛋白的抗原表位由此被破壞或在聚合變性時(shí)被隱藏，從而不能與結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，使其免疫原性降低。復(fù)合處理后蛋清蛋白的表面疏水性最高，微波破壞了蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，進(jìn)而促使蛋白酶更容易作用于蛋白質(zhì)，導(dǎo)致其表面疏水性增加，免疫原性進(jìn)一步降低，這與?；勖舻难芯拷Y(jié)果一致。郭榮佳利用堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解大豆分離蛋白，結(jié)果表明酶解處理大豆分離蛋白表面疏水性整體均高于未處理大豆分離蛋白。Zang Xiaodan等研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)胰蛋白酶水解后米糠蛋白疏水性增加，這歸因于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的展開和疏水基團(tuán)的暴露。

圖10 不同處理?xiàng)l件下蛋清蛋白的表面疏水性Fig. 10 Surface hydrophobicity of egg white protein under different treatment conditions

3 結(jié) 論

微波、酶解和微波協(xié)同酶解處理對蛋清蛋白免疫原性均有不同程度的影響。微波處理可降低蛋清蛋白免疫原性，當(dāng)微波700 W處理20 s時(shí)，蛋白免疫原性降低率最高（50.81%）。此條件下蛋白質(zhì)分子發(fā)生聚集，部分生色基團(tuán)和芳香族氨基酸殘基被包埋，分子相互作用使內(nèi)部疏水基團(tuán)暴露，一定程度修飾了過敏表位，導(dǎo)致免疫原性降低。不同蛋白酶水解后，蛋清蛋白免疫原性均降低，其中堿性蛋白酶水解后免疫原性降低了55.83%。隨著酶添加量的增加，其免疫原性降低率逐漸增加。酶水解使蛋清蛋白分子空間結(jié)構(gòu)展開，疏水基團(tuán)和芳香族殘基暴露，改變了蛋白的三級結(jié)構(gòu)，使高級結(jié)構(gòu)中的化學(xué)鍵斷裂，過敏原失去活性引起免疫原性的降低。經(jīng)微波協(xié)同酶解處理后，蛋清蛋白的免疫原性隨著酶添加量的增加進(jìn)一步下降。經(jīng)協(xié)同處理后的SDS-PAGE條帶發(fā)生變化，-螺旋結(jié)構(gòu)相對含量有所增加，而-折疊結(jié)構(gòu)相對含量相應(yīng)降低，疏水基團(tuán)逐漸暴露，說明微波協(xié)同酶解處理導(dǎo)致蛋清蛋白的二、三級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，據(jù)此可知，蛋清蛋白的免疫原性隨著其構(gòu)象的改變而改變，通過破壞蛋白的構(gòu)象及抗原表位能夠使其免疫原性降低。綜上所述，微波和酶解處理對降低蛋清蛋白免疫原性具有協(xié)同作用，但蛋清蛋白結(jié)構(gòu)與免疫原性變化的具體原因還有待進(jìn)一步研究。