超聲-微酸性電解水聯(lián)合處理對腐敗希瓦氏菌的作用機(jī)制

藍(lán)蔚青，趙欣宇，周大鵬，莫雅嫻，王彥波，馮豪杰，謝 晶,*

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306；3.浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310018）

我國是世界漁業(yè)大國，相關(guān)統(tǒng)計(jì)顯示，2020年水產(chǎn)品產(chǎn)量為6 549.02萬 t，比上年增長1.06%。其中，養(yǎng)殖水產(chǎn)品產(chǎn)量達(dá)5 224.20萬 t，增長了2.86%。然而，水產(chǎn)品在產(chǎn)量逐年遞增的同時(shí)，由于其營養(yǎng)豐富、含水量高，微生物極易在流通期間大量繁殖，使其發(fā)生腐敗，目前腐損率在15%左右?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，水產(chǎn)品的腐敗菌主要有希瓦氏菌、假單胞菌、不動桿菌、氣單胞菌等，而腐敗希瓦氏菌是導(dǎo)致水產(chǎn)品腐敗的主導(dǎo)者之一。因此，只有通過適當(dāng)?shù)奶幚矸绞揭种扑a(chǎn)品中優(yōu)勢腐敗菌的生長繁殖，才能進(jìn)一步降低其流通腐損率。

超聲（ultrasonic，US）是超出人類聽力范圍的機(jī)械波，已被廣泛應(yīng)用于食品殺菌、加速肉類腌制與嫩化、延長肉制品貨架期、某些活性物質(zhì)的輔助提取等方面。其中，Antunes-Rohling等研究得出，US（2.9 W/kg）解凍可明顯提升鱈魚魚片的解凍品質(zhì)；Pedrós-Garrido等研究發(fā)現(xiàn)高強(qiáng)度US（30 kHz、51.41 W/L）處理45 min可顯著降低三文魚、鯖魚、鱈魚和無須鱈魚片微生物數(shù)，改善其質(zhì)量。US在液體介質(zhì)中傳播時(shí)，能在液體中形成微小氣泡（即空化泡），產(chǎn)生空化效應(yīng)，該效應(yīng)被認(rèn)為是超聲波滅菌的主要效應(yīng)。US技術(shù)作為一種非熱殺菌技術(shù)被應(yīng)用在食品加工過程中，利用其產(chǎn)生的空化效應(yīng)來破壞細(xì)菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)，但單獨(dú)作用時(shí)低強(qiáng)度下殺菌效果不明顯。Huu等研究發(fā)現(xiàn)，用40 kHz US分別處理大腸桿菌和單增李斯特菌，當(dāng)處理時(shí)間低于30 min和45 min時(shí)，減菌效果不明顯。因此，US有必要結(jié)合其他處理技術(shù)，以達(dá)到提升其殺菌效果的目的。

微酸性電解水（slightly acidic electrolyzed water，SAEW）是在直流電場的環(huán)境下，通過對稀鹽酸或稀鹽酸與低濃度鹽混合液進(jìn)行無隔膜電解獲得的水溶液，pH值為5.5～6.5，有效氯濃度（available chlorine concentration，ACC）為10～30 mg/L，氧化還原電位（oxidation reduction potential，ORP）為700～900 mV，具有特殊理化與殺菌特性，一般公認(rèn)為安全（generally recognized as safe，GRAS）且環(huán)保，已成為苛刻化學(xué)消毒劑的流行替代品。SAEW屬于新型非熱殺菌技術(shù)，因其無殘留、無污染，且安全高效等特點(diǎn)，在水產(chǎn)品加工前處理與保鮮領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用。其中，向雅芳等用SAEW對鱸魚片進(jìn)行殺菌處理，結(jié)果表明SAEW殺菌作用良好，能有效降低樣品中的微生物數(shù)；馮豪杰等研究得出SAEW處理可有效抑制暗紋東方鲀冷藏期間微生物繁殖，延緩總揮發(fā)性鹽基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）含量與pH值上升，維持其良好的感官品質(zhì)，延長冷藏貨架期2～3 d。

研究表明，更換US的液體介質(zhì)，將酸性電解水作為US介質(zhì)，可提升US的殺菌效果。其中，Li Jiao等利用US與SAEW聯(lián)合處理金黃色葡萄球菌，能使菌體濃度降低3.68（lg（CFU/mL））；Baumann等研究發(fā)現(xiàn)，US-臭氧聯(lián)用與US單一處理相比，其對單增李斯特菌的殺菌效果提升約30%；Carmen等結(jié)果得出，US-萬古霉素聯(lián)合處理能明顯提高US對銅綠假單胞菌與大腸桿菌的作用效果；Millan-Sango等研究顯示，US結(jié)合牛至精油對生菜中大腸桿菌O157:H7的殺菌效果比US單一殺菌提升26%?，F(xiàn)有研究主要側(cè)重于US與酸性電解水協(xié)同作用對食品品質(zhì)變化影響與作用效果方面，而對其協(xié)同作用機(jī)制鮮有研究?；诖?，本實(shí)驗(yàn)主要探討了US、SAEW及兩者聯(lián)合處理US+SAEW對腐敗希瓦氏菌的作用機(jī)制，分別從減菌率、細(xì)菌生長曲線、電導(dǎo)率、細(xì)胞膜通透性（碘化丙啶（propidium iodide，PI）攝入量）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）與乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）活力、紫外吸收物質(zhì)泄漏量等指標(biāo)，結(jié)合微觀結(jié)構(gòu)觀察，綜合分析其作用機(jī)制，以期為US結(jié)合SAEW處理應(yīng)用于水產(chǎn)品殺菌保鮮提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

腐敗希瓦氏菌（）由課題組成員從腐敗后期的大黃魚中分離、篩選、鑒定后保存于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室（上海）。

胰蛋白胨大豆瓊脂（tryptic soy agar，TSA）培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆肉湯（tryptic soy broth，TSB）培養(yǎng)基、氯化鈉（NaCl）、硫代硫酸鈉、無水乙醇、戊二醛（均為分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；PI染料北京索萊寶科技有限公司；AKP、LDH試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

FX-SWS100型SAEW生成機(jī) 煙臺方心水處理設(shè)備有限公司；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；Synergy2型自動酶標(biāo)儀 美國BioTek公司；DDB-11A型電導(dǎo)率儀 杭州齊威儀器有限公司；Mira 3型掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM） 捷克Tescan公司；FE20型pH/ORP計(jì) 上海而立環(huán)?？萍加邢薰荆籖C-3F型高濃度有效氯測定儀 北京航軒科技發(fā)展有限公司；M334712型全自動微生物生長曲線分析儀 芬蘭Bioscreen公司；UV-2450型紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司；F-7100型熒光分光光度計(jì) 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液與SAEW制備

將保存菌種取出，活化后平板劃線培養(yǎng)得到單菌落。挑取活化后的單菌落在TSB培養(yǎng)基中37 ℃振蕩培養(yǎng)8 h，隨后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.85%的無菌生理鹽水洗滌3 次并離心（8 000 r/min、10 min）取其沉淀以去除TSB，最后調(diào)整菌懸液菌體濃度至10～10CFU/mL。

通過SAEW生成機(jī)電解體積分?jǐn)?shù)9.0% HCl溶液制備SAEW。由pH/ORP計(jì)測定其pH值與ORP，由高濃度有效氯測定儀測定其ACC。經(jīng)測定，所制備SAEW的pH值為6.35±0.04，ORP為（861.6±12.35）mV，ACC為（30.00±1.54）mg/L。

1.3.2 樣品處理

將菌懸液分成4 組：對照（CK）組：1 mL菌懸液加入9 mL無菌生理鹽水；US組：1 mL菌懸液加入9 mL無菌生理鹽水，20 kHz、600 W US處理10 min；SAEW組：1 mL菌懸液加入8 mL SAEW，10 min后加入1 mL終止劑（0.85%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）NaCl溶液與0.50%硫代硫酸鈉），終止滅菌；US+SAEW組：1 mL菌懸液加入8 mL SAEW，20 kHz、600 W US處理10 min后加入1 mL終止劑，終止滅菌。

1.3.3 減菌效果測定

取100 μL不同處理后的菌懸液在TSA培養(yǎng)基上涂布，隨后置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，采用平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)。利用樣品殺菌前后的微生物殘存率的對數(shù)值表示減菌效果，絕對值越大，表明減菌作用越強(qiáng)，進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算公式如下。

式中：為處理前細(xì)菌菌落數(shù)/（CFU/mL）；為處理后細(xì)菌菌落數(shù)/（CFU/mL）。

1.3.4 微生物生長曲線的測定

將不同處理后的菌懸液按照1%接種量添加于TSB培養(yǎng)基中，置于37 ℃搖床150 r/min培養(yǎng)24 h，每隔1 h用微生物生長曲線分析儀取樣測定OD，每組3 個(gè)平行。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD為縱坐標(biāo)，繪制微生物生長曲線。

1.3.5 電導(dǎo)率測定

將不同處理后的菌懸液按照1%接種量添加于TSB培養(yǎng)基中，置于37 ℃搖床150 r/min培養(yǎng)10 h，分別于0、2、4、6、8、10 h測定其電導(dǎo)率。

1.3.6 PI攝入量測定

菌懸液10 000 r/min、4 ℃離心10 min，棄上清液，用無菌生理鹽水重懸，進(jìn)行PI染料染色。染色后室溫黑暗孵化15 min，用熒光分光光度計(jì)測定吸光度，激發(fā)光波長490 nm，發(fā)射光波長635 nm，以菌懸液煮沸10 min為陽性對照組，以吸光度表征PI攝入量。

1.3.7 AKP與LDH活力測定

不同處理的菌懸液分別于0、10 h取樣后，按照AKP與LDH試劑盒說明書要求測定其AKP與LDH活力。

1.3.8 對紫外吸收物質(zhì)泄漏量的測定

將不同處理后的菌懸液按照1%接種量添加于TSB培養(yǎng)基中，置于37 ℃搖床150 r/min培養(yǎng)，分別于0、10 h取樣，8 000 r/min離心5 min，使用紫外-可見分光光度計(jì)測定其上清液（表征核酸含量）和（表征蛋白質(zhì)含量）。

1.3.9 SEM觀察

參考Han Qiao等實(shí)驗(yàn)方法，將不同處理組的菌液重懸后靜置過夜，4 000 r/min離心5 min，棄上清液，沉淀分別用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液梯度脫水后重懸。取適量樣品滴至蓋破片上晾干，真空鍍膜后進(jìn)行SEM觀察。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3 次平行，采用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用Duncan’s法進(jìn)行差異顯著性分析和多重比較（＜0.05為顯著性差異），結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；使用Origin軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理方式對腐敗希瓦氏菌減菌效果的影響

SAEW具有強(qiáng)氧化性，被廣泛用于食品原料的清洗殺菌過程中。研究發(fā)現(xiàn)SAEW可破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，且能進(jìn)一步破壞菌體細(xì)胞的蛋白質(zhì)及酶系統(tǒng)，從而殺滅微生物。本實(shí)驗(yàn)研究US聯(lián)合SAEW對腐敗希瓦氏菌殺滅效果，其減菌效果如圖1所示。

圖1 不同處理方式對腐敗希瓦氏菌減菌效果的影響Fig. 1 Effects of different treatments on the inactivation of Shewanella putrefaciens

由圖1可知，經(jīng)不同方式處理后，US、SAEW及US+SAEW組的菌落數(shù)分別較CK組減少了0.69、1.55、2.48（lg（CFU/mL））。結(jié)果表明，US與SAEW聯(lián)合處理有協(xié)同殺菌作用?？赡苡捎赨S處理破壞了菌體結(jié)構(gòu)，促進(jìn)了SAEW進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，更直接作用于菌體細(xì)胞的酶、蛋白質(zhì)等，增強(qiáng)其殺菌效果。

2.2 不同處理方式對腐敗希瓦氏菌生長曲線的影響

由圖2可知，CK組的腐敗希瓦氏菌在2 h后快速生長，進(jìn)入對數(shù)生長期，隨后在10 h達(dá)到穩(wěn)定期；而菌體經(jīng)不同處理后，其對數(shù)生長期出現(xiàn)相應(yīng)延滯。其中，US處理組在7 h進(jìn)入對數(shù)生長期，SAEW處理組在9 h后生長速率緩慢上升，對數(shù)生長期出現(xiàn)在12～14 h。US+SAEW組的腐敗希瓦氏菌生長始終處于低水平，可見其對腐敗希瓦氏菌抑制效果明顯。該變化趨勢與Li Jiao等研究結(jié)果一致。

圖2 不同處理方式對腐敗希瓦氏菌生長的影響Fig. 2 Effects of different treatments on the growth of Shewanella putrefaciens

2.3 不同處理方式對腐敗希瓦氏菌電導(dǎo)率的影響

當(dāng)微生物細(xì)胞處于不利環(huán)境中，菌體細(xì)胞膜的通透性增加，導(dǎo)致電解質(zhì)外泄，電導(dǎo)率相應(yīng)升高。不同處理方式對腐敗希瓦氏菌的電導(dǎo)率變化影響如圖3所示。

圖3 不同處理方式對腐敗希瓦氏菌電導(dǎo)率的影響Fig. 3 Effects of different treatments on the electrical conductivity of Shewanella putrefaciens

由圖3可知，隨著處理時(shí)間的延長，各組菌懸液的電導(dǎo)率相應(yīng)升高。其中，處理組的電導(dǎo)率較CK組顯著上升，尤其是經(jīng)US+SAEW處理后，其菌懸液的電導(dǎo)率最高（＜0.05），表明US+SAEW對菌體細(xì)胞膜影響最大，菌體細(xì)胞膜受到損傷，其保護(hù)屏障被打破，致使胞內(nèi)電解質(zhì)外泄至培養(yǎng)液中，電導(dǎo)率隨之升高。

2.4 不同處理方式對腐敗希瓦氏菌細(xì)胞PI攝入量的影響

PI是一種大分子熒光染料，其無法進(jìn)入具有完整質(zhì)膜的細(xì)胞，但可進(jìn)入膜受損的細(xì)胞，并與細(xì)胞內(nèi)DNA和RNA結(jié)合。通過對菌體細(xì)胞進(jìn)行PI染色，能測定處理后菌體細(xì)胞膜通透性的變化。不同處理方式對腐敗希瓦氏菌細(xì)胞PI攝入量的影響如圖4所示。

圖4 不同處理方式對腐敗希瓦氏菌細(xì)胞PI攝入量的影響Fig. 4 Effects of different treatments on the PI uptake of Shewanella putrefaciens

由圖4可知，與CK組相比，各處理組菌懸液的PI攝入量顯著升高（＜0.05），表明US與SAEW單獨(dú)或聯(lián)合處理均對腐敗希瓦氏菌的菌體結(jié)構(gòu)帶來嚴(yán)重破壞，使PI染料更易進(jìn)入細(xì)胞，其中以US+SAEW處理組的PI攝入量最高，由此說明了US與SAEW聯(lián)合處理對菌體細(xì)胞膜通透性產(chǎn)生顯著影響。

2.5 不同處理方式對腐敗希瓦氏菌胞外AKP與LDH活力的影響

AKP大多存在于細(xì)胞壁與細(xì)胞膜間，當(dāng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)受到破壞，AKP由胞內(nèi)滲出。因此，可通過檢測細(xì)菌胞外AKP活力高低來判斷菌體細(xì)胞壁的破壞情況。LDH調(diào)控細(xì)胞的糖酵解途徑，當(dāng)菌體細(xì)胞膜受損時(shí)，其會由胞內(nèi)泄漏至胞外，可通過測定其活力高低判斷菌體細(xì)胞膜的受損程度。不同處理方式對腐敗希瓦氏菌胞外AKP與LDH活力變化影響如圖5所示。

圖5 不同處理方式對腐敗希瓦氏菌胞外AKP（A）與LDH（B）活力的影響Fig. 5 Effects of different treatments on extracellular AKP (A) and LDH (B) activity of Shewanella putrefaciens

如圖5A所示，不同處理后的腐敗希瓦氏菌胞外AKP活力均顯著上升，且在10 h后與0 h差異顯著（＜0.05）。該結(jié)果同前期指標(biāo)分析結(jié)果一致，可見US+SAEW聯(lián)合處理可進(jìn)一步破壞菌體細(xì)胞壁的完整性。遲媛等研究表明US處理在殺菌過程中會作用菌體細(xì)胞壁，破壞菌體外層結(jié)構(gòu)，而SAEW也能攻擊細(xì)胞壁與細(xì)胞膜，導(dǎo)致其通透性增加。

由圖5B可見，菌懸液經(jīng)處理10 h后，US、SAEW與US+SAEW處理組的LDH活力分別從0 h的0.34、0.63 U/L與1.15 U/L升至10 h的2.51、2.01 U/L與4.73 U/L，CK組的LDH活力顯著低于處理組（＜0.05）。結(jié)果表明，US與SAEW處理均破壞了菌體細(xì)胞膜，使菌體內(nèi)生物大分子外泄，從而達(dá)到其殺菌目的，其中，以US與SAEW聯(lián)合處理作用效果最明顯。

2.6 不同處理方式對腐敗希瓦氏菌紫外吸收物質(zhì)泄漏量的影響

核酸與蛋白質(zhì)的最大吸收波長分別為260 nm和280 nm。因此可以這兩處波長下的吸光度表征菌體細(xì)胞內(nèi)部成分泄漏量。不同處理方式對腐敗希瓦氏菌紫外吸收物質(zhì)泄漏的影響如圖6所示。相同處理時(shí)間下，US+SAEW組樣品的核酸（圖6A）和蛋白質(zhì)（圖6B）物質(zhì)泄漏量顯著高于US或SAEW單獨(dú)處理組（＜0.05）。聯(lián)合處理導(dǎo)致菌體細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的不可逆損傷，使膜透性喪失和細(xì)胞質(zhì)大量滲漏。該結(jié)果與AKP、LDH活力變化結(jié)果一致。由此可知，US與SAEW聯(lián)合處理可引起細(xì)胞內(nèi)容物的泄漏，加速菌體死亡的進(jìn)程。

圖6 不同處理方式對腐敗希瓦氏菌核酸（A）與蛋白質(zhì)（B）等紫外吸收物質(zhì)泄漏量的影響Fig. 6 Effects of different treatments on leakage of ultravioletabsorbing substances: nucleic acid (A) and protein (B)

2.7 不同處理方式對腐敗希瓦氏菌微觀結(jié)構(gòu)的影響

由圖7可知，CK組菌體細(xì)胞飽滿完整、形態(tài)均勻。經(jīng)US處理后，細(xì)胞形狀不規(guī)則，菌體表面出現(xiàn)皺褶。經(jīng)SAEW處理后，部分菌體細(xì)胞出現(xiàn)破裂，內(nèi)容物溶出。而US與SAEW聯(lián)合處理造成了更嚴(yán)重的損傷，包括細(xì)菌表面塌陷、外膜斷裂、細(xì)胞壁受損，大量內(nèi)容物外泄。這是由于US處理使菌體細(xì)胞的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜受到嚴(yán)重破壞，促進(jìn)SAEW進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，增強(qiáng)其聯(lián)合殺菌效果。

圖7 不同處理方式對腐敗希瓦氏菌微觀結(jié)構(gòu)的影響（18 000×）Fig. 7 Effects of different treatments on the microstructure of Shewanella putrefaciens (18 000 ×)

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)研究了US、SAEW及US+SAEW聯(lián)合處理對腐敗希瓦氏菌的菌體作用機(jī)制，通過測定殺菌效果、微生物生長曲線、電導(dǎo)率、PI攝入量、AKP與LDH活力、細(xì)胞膜通透性等，初步闡明了US+SAEW處理對腐敗希瓦氏菌的作用機(jī)理。結(jié)果表明，US與SAEW處理的協(xié)同效應(yīng)使腐敗希瓦氏菌菌落數(shù)減少了2.48（lg（CFU/mL））。聯(lián)合處理使菌體細(xì)胞膜的完整性明顯受損，導(dǎo)致其電導(dǎo)率、AKP和LDH活力、紫外吸收值（、）升高。SEM結(jié)果表明，US+SAEW處理嚴(yán)重破壞腐敗希瓦氏菌的菌體結(jié)構(gòu)，造成其細(xì)胞壁破裂，蛋白質(zhì)與核酸等細(xì)胞質(zhì)成分的大量外泄。US+SAEW聯(lián)合處理能使腐敗希瓦氏菌菌體生長受到抑制，細(xì)胞膜受損，菌體活性降低，最終導(dǎo)致其死亡。因此，將US與SAEW聯(lián)合處理用于水產(chǎn)品的保鮮加工與前處理具有良好的應(yīng)用前景。