臭氧處理對(duì)牛乳乳清蛋白的結(jié)構(gòu)及致敏性的影響

熊子奕，譚宏凱，胡永芯，武 涌，陳紅兵，李 欣,*

（1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2.南昌大學(xué)食品學(xué)院，江西 南昌 330047；3.南昌大學(xué) 高等研究院微納米科學(xué)與技術(shù)省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；4.南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047）

乳清蛋白約占牛乳總蛋白含量的20%，其通常由球狀蛋白組成，如-乳白蛋白、-乳球蛋白、牛血清白蛋白、乳鐵蛋白和免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）等。其中，-乳球蛋白和-乳白蛋白的含量最高，分別占乳清蛋白含量的52%和19%。乳清蛋白具有極高的營養(yǎng)價(jià)值，研究表明，乳清蛋白可改善人們的睡眠質(zhì)量，促進(jìn)嬰幼兒胃腸道功能的發(fā)育，增強(qiáng)抵抗力。然而，乳清中-乳球蛋白和-乳白蛋白是牛乳中主要過敏原。有數(shù)據(jù)顯示，約82%的牛乳過敏患者對(duì)乳清蛋白中的-乳球蛋白過敏，75%的牛乳過敏患者血清中含有-乳白蛋白的特異性抗體。牛乳過敏使患者產(chǎn)生濕疹、腹瀉和胃腸出血等癥狀，嚴(yán)重者甚至導(dǎo)致休克和死亡，影響著過敏患者的生活質(zhì)量與營養(yǎng)補(bǔ)充選擇。

臭氧具有較強(qiáng)的廣譜殺菌作用，是一種高效、安全的“綠色消毒劑”。早在1904年，就有利用臭氧保存牛奶、奶酪、雞蛋等食品的報(bào)道。1997年，臭氧得到FDA的GRAS認(rèn)證，可作為公認(rèn)的安全添加劑，應(yīng)用于瓶裝水及其生產(chǎn)線的消毒；2001年，F(xiàn)DA將臭氧列入可直接和食品接觸的添加劑，這為臭氧處理技術(shù)在食品工業(yè)中的發(fā)展帶來了更為廣闊的前景。近年來，臭氧在乳制品生產(chǎn)過程中的應(yīng)用受到更多重視。Kang等將臭氧用于乳清蛋白的漂白，在一定條件下可達(dá)到與過氧化氫相同的漂白效果。陳夢(mèng)曦等利用質(zhì)量濃度為167 mg/L的臭氧氣體，在真空度為50 kPa的常溫條件下對(duì)牛奶持續(xù)消毒20 min，大腸桿菌的平均殺滅率為62.40%，低溫（4 ℃）條件下的平均殺滅率為72.88%。除此之外，臭氧處理在奶酪熟化和貯藏過程中，也具有較為成功的應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)，可使奶酪表面生長孢子在熟化期被殺滅，延長貯藏期，并且在貯藏室中存在的異味也由于臭氧氧化作用而消除。

雖然臭氧處理技術(shù)在乳制品生產(chǎn)過程中的應(yīng)用受到廣泛關(guān)注，但目前的研究大多集中在殺菌消毒領(lǐng)域，人們對(duì)于臭氧處理給乳制品系統(tǒng)中重要營養(yǎng)物質(zhì)蛋白質(zhì)帶來的影響知之甚少。本研究以牛乳乳清蛋白為研究對(duì)象，探討臭氧處理前后乳清蛋白的氨基酸組成、空間結(jié)構(gòu)、巰基及二硫鍵含量的變化，進(jìn)而深入了解臭氧處理對(duì)乳清蛋白結(jié)構(gòu)特性的影響。除此之外，利用間接競爭酶聯(lián)免疫吸附劑測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）對(duì)臭氧處理后乳清蛋白致敏性的變化進(jìn)行檢測，以期探究臭氧用于提高乳蛋白食品安全性和改善蛋白功能的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

濃縮乳清蛋白（whey protein concentrate，WPC）澳優(yōu)乳業(yè)股份有限公司；預(yù)染大分子蛋白質(zhì)Marker美國Thermo公司；Tris、甘氨酸、四甲基乙二胺、丙烯酰胺-甲叉雙丙烯酰胺40%溶液（19∶1，/） 生工生物工程（上海）股份有限公司；十二烷基硫酸鈉 美國通用電氣醫(yī)療；考馬斯亮藍(lán)R250、乙二胺四乙酸、5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)、8-苯胺-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）、羊抗兔IgG抗體、生物素標(biāo)記羊抗人IgE抗體 美國Sigma公司；HRP-親和素、3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺 欣博盛生物科技有限公司；兔抗乳清蛋白血清為實(shí)驗(yàn)室自制，牛乳過敏患者血清購于PlasmaLab International（Everett, WA,USA）；其他常用生化試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LBO3-F-6G臭氧發(fā)生器 江西林博能源環(huán)保有限公司；迷你型蛋白電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、GS-800型光密度掃描儀 美國Bio-Rad公司；TU-1901型紫外分光光度計(jì) 北京普析通用儀器公司；F-4600熒光分光光度計(jì)日本日立公司；PB-10型酸度計(jì) 德國Sartorius公司；MOS-450/AF-圓二色譜儀 法國Biologic公司；S-433（D）氨基酸分析儀 德國Sykam公司；Varioskan LUX多功能酶標(biāo)儀 美國Thermo公司；Vortex Genius 3渦旋振蕩器 德國IKA公司；LK-120A電子天平 日本A&D公司。

1.3 方法

1.3.1 臭氧處理乳清蛋白

稱取0.8 g WPC粉，溶解于200 mL去離子水，配制成質(zhì)量濃度為4 mg/mL的乳清蛋白溶液。取6 份30 mL蛋白溶液置于臭氧發(fā)生系統(tǒng)（圖1）中，通入臭氧，氣體流量為20 L/h，臭氧質(zhì)量濃度為50 mg/L，處理時(shí)間分別為0、5、10、15、20 s和25 s，并收集樣品。

圖1 臭氧處理乳清蛋白實(shí)驗(yàn)示意圖Fig. 1 Schematic diagram for ozone treatment of whey protein

1.3.2 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）

采用SDS-PAGE對(duì)臭氧處理后乳清蛋白產(chǎn)物的分子質(zhì)量進(jìn)行鑒定。分離膠和濃縮膠分別為12%和4%，每孔上樣15 μL，樣品經(jīng)過濃縮膠時(shí)，電流為6 mA，經(jīng)過分離膠時(shí)，電流為12 mA，在此條件下進(jìn)行蛋白電泳。電泳結(jié)束后，采用考馬斯亮藍(lán)R-250染色，隨后利用甲醇-冰醋酸溶液脫色，并用凝膠成像系統(tǒng)采集電泳圖像。

1.3.3 氨基酸組分的測定

采用水解法對(duì)臭氧處理樣品進(jìn)行氨基酸組分含量的測定。取部分樣品于20 mL安培管中，加入10 mL 6 mol/L HCl溶液，再加1 g苯酚，充氮?dú)饧s10 min以排除空氣，置于110 ℃烘箱水解24 h。水解完成后，冷卻混勻，濾紙過濾，用去離子水定容至25 mL。取1 mL定容后的樣品置于燒杯中，60 ℃水浴蒸干后，加入適量去離子水溶解，重復(fù)蒸干2 次，加入3 mL樣品稀釋液（pH 2.2），用0.22 μm濾膜過濾到樣品瓶中，用氨基酸分析儀測定。

1.3.4 巰基與二硫鍵含量的測定

參照Beveridge等的方法，采用Ellman法測定臭氧處理前后乳清蛋白巰基與二硫鍵含量。巰基與二硫鍵含量按式（1）、（2）計(jì)算：

式中：為波長412 nm處的吸光度；為稀釋倍數(shù)；為樣品質(zhì)量濃度/（mg/mL）；為游離巰基含量/（μmol/g）；為總巰基含量/（μmol/g）。

1.3.5 紫外-可見光譜分析

將樣品稀釋為0.2 mg/mL的均勻溶液，利用紫外分光光度計(jì)測定臭氧處理產(chǎn)物的空間展開情況。設(shè)定波長范圍為250～350 nm。

1.3.6 表面疏水性的測定

使用ANS疏水熒光探針法測定臭氧處理前后乳清蛋白的表面疏水性。將樣品稀釋成0.2 mg/mL的均勻溶液，并將50 μL的5 mmol/L ANS溶液添加到5.0 mL的稀釋樣品溶液中，旋渦振蕩30 s，室溫下避光反應(yīng)1 h。使用熒光分光光度計(jì)測量熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長為390 nm，發(fā)射波長為400～600 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬帶均為5 nm，掃描速率為1 200 nm/min。

1.3.7 圓二色光譜分析

參考常雪嬌等的方法，采用圓二色譜儀測定臭氧處理后乳清蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化。將樣品稀釋為0.2 mg/mL的均勻溶液，比色皿為1 mm厚，波長范圍為190～250 nm，速率為100 nm/min，在室溫，連續(xù)吹入5%氮?dú)鈼l件下檢測。樣品掃描3 次取其平均值，通過差減除去空白基線信號(hào)值，再使用Dichroweb網(wǎng)站計(jì)算蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)含量。

1.3.8 內(nèi)源熒光和三維（3D）熒光分析

將樣品溶液稀釋為0.2 mg/mL的均勻溶液，利用熒光分光光度計(jì)記錄300～400 nm的發(fā)射光譜，激發(fā)波長為280 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm，激發(fā)電壓為400 V，掃描速率為1 200 nm/min，得到內(nèi)源熒光光譜。

當(dāng)激發(fā)波長范圍為200～400 nm，發(fā)射波長范圍為200～600 nm時(shí)，兩者都以5 nm為間距增加，采集熒光信號(hào)得到激發(fā)發(fā)射矩陣熒光光譜，即三維（3D）熒光光譜。

1.3.9 間接競爭ELISA

采用間接競爭ELISA對(duì)臭氧處理乳清蛋白進(jìn)行IgG和IgE結(jié)合能力的評(píng)估，具體步驟參考袁水林等的方法，并略微修改。分別以-乳白蛋白和-乳球蛋白為包被抗原，包被質(zhì)量濃度為2.5 μg/mL，兔抗乳清蛋白血清稀釋倍數(shù)為1∶5 000，將樣品按一定的濃度梯度稀釋，進(jìn)行IgG結(jié)合能力的檢測。同時(shí)將10 位牛乳過敏患者的血清等體積混合構(gòu)建血清池，將人血清稀釋200 倍，進(jìn)行IgE結(jié)合能力的檢測。10 位牛乳過敏患者的相關(guān)信息如表1所示。

表1 牛乳過敏患者信息Table 1 Information about patients with milk allergy

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白對(duì)照和3 次平行實(shí)驗(yàn)并取平均值，利用SPSS 26軟件進(jìn)行ANOVA差異顯著性分析，＜0.05，差異顯著。圓二色光譜數(shù)據(jù)用Dichroweb網(wǎng)站進(jìn)行分析，利用Origin 2018軟件和GraphPad Prism 8.0.2軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)并繪圖，表格用Excel軟件繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 臭氧處理乳清蛋白的電泳分析

圖2 臭氧處理蛋白SDS-PAGE圖Fig. 2 SDS-PAGE pattern of whey protein treated with ozone

如圖2所示，WPC的主要蛋白質(zhì)是分子質(zhì)量為14.2 kDa的-乳白蛋白和18.4 kDa的-乳球蛋白。泳道2（臭氧處理5 s）和泳道3（臭氧處理10 s）中，乳清蛋白主要成分未發(fā)生明顯變化，但分子質(zhì)量為34 kDa左右的蛋白條帶顏色變深，這可能是由于臭氧的氧化作用，使相鄰的-乳球蛋白單體中游離半胱氨酸之間形成二硫鍵，產(chǎn)生了更多的-乳球蛋白二聚體，且-乳球蛋白的游離半胱氨酸位于蛋白分子結(jié)構(gòu)的中心，其形成的二硫鍵不易被-巰基乙醇還原。隨著臭氧處理時(shí)間進(jìn)一步延長，與未處理樣品相比，臭氧處理后的乳清蛋白中-乳白蛋白和-乳球蛋白單體的濃度降低，高分子質(zhì)量條帶更為明顯，說明臭氧處理使乳清蛋白單體之間形成了不同程度的聚合物。

2.2 臭氧處理對(duì)乳清蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

2.2.1 臭氧處理對(duì)乳清蛋白氨基酸含量的影響

表2 臭氧處理前后乳清蛋白的氨基酸組成Table 2 Amino acid composition of whey protein before and after ozone treatment

在加工處理過程中，蛋白質(zhì)的氨基酸組分含量可能會(huì)發(fā)生變化，從而影響蛋白質(zhì)的理化特性。由表2可知，臭氧處理組的絲氨酸、甘氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、酪氨酸、組氨酸和精氨酸的相對(duì)含量較未臭氧處理的樣品均降低，其中甘氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸和組氨酸的變化大致隨著臭氧處理時(shí)間的延長顯著遞減，其他氨基酸組分相對(duì)含量則沒有明顯降低。組氨酸和酪氨酸含量的降低可歸因于咪唑環(huán)和苯環(huán)等芳香環(huán)的存在，有研究表明，該類環(huán)與臭氧具有較高的反應(yīng)活性。甲硫氨酸屬于含硫氨基酸，其含量的降低可能是因?yàn)楹袔€基的側(cè)鏈易被氧化，生成含砜類氨基酸衍生物。精氨酸作為一種帶電子的堿性氨基酸，可能通過胍基基團(tuán)與臭氧反應(yīng)，顯示出較強(qiáng)的還原能力，導(dǎo)致含量下降。而甘氨酸具有一定的抗氧化活性，也易與強(qiáng)氧化劑臭氧反應(yīng)。其余氨基酸的相對(duì)含量未發(fā)生明顯降低，這可能是該類氨基酸不易被氧化或其在蛋白分子內(nèi)部不易與臭氧接觸，無法發(fā)生反應(yīng)。

2.2.2 臭氧處理對(duì)乳清蛋白巰基及二硫鍵含量的影響

圖3 臭氧處理蛋白巰基及二硫鍵含量Fig. 3 Contents of sulfhydryl group and disulfide bond in whey protein treated with ozone

如圖3所示，在5、10、15、20 s和25 s的臭氧處理?xiàng)l件下，未處理樣品和臭氧處理樣品游離巰基含量分別為5.78、4.49、3.85、3.01、2.92 μmol/g和2.13 μmol/g，總巰基含量分別為14.98、14.73、14.12、13.80、13.60 μmol/g和12.97 μmol/g，而二硫鍵含量分別為4.60、5.12、5.13、5.39、5.34 μmol/g和5.42 μmol/g。與未處理樣品相比，臭氧處理樣品無論是游離態(tài)巰基還是總巰基含量均略有下降，而二硫鍵含量略微升高。巰基含量的減少主要原因可能是含硫氨基酸的氧化生成了不同的殘基，如對(duì)氧化劑敏感的半胱氨酸，氧自由基作用位點(diǎn)非常淺，氧化可能會(huì)形成亞磺酸/磺酸，而甲硫氨酸被氧化為甲硫氨酸砜。而二硫鍵含量的升高則是因?yàn)閮煞肿影腚装彼醾?cè)鏈上的巰基聚集形成新的二硫鍵。Tiwari等的研究也證明，氧化反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致乳清蛋白和小麥粉中巰基含量的減少及二硫鍵含量的增加，其結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

2.3 臭氧處理對(duì)乳清蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

圖4 臭氧處理后乳清蛋白的圓二色光譜圖Fig. 4 CD spectra of whey protein treated with ozone

表3 臭氧處理乳清蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量Table 3 Secondary structure contents of whey protein treated with ozone

如圖4和表3所示，與未處理的乳清蛋白相比，臭氧處理會(huì)使乳清蛋白中各二級(jí)結(jié)構(gòu)之間相互轉(zhuǎn)化。隨著時(shí)間的延長，-螺旋相對(duì)含量降低，-折疊相對(duì)含量稍有增加，-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量總體變化較小，無規(guī)卷曲相對(duì)含量則呈先增加后降低的趨勢。這可能是因?yàn)槎虝r(shí)的臭氧處理導(dǎo)致乳清蛋白去折疊，蛋白結(jié)構(gòu)部分展開，從而使其嚴(yán)謹(jǐn)有序的二級(jí)結(jié)構(gòu)趨于松散，天然球狀形態(tài)丟失，使其更具彈性。隨著處理時(shí)間的延長，蛋白分子聚集，二硫鍵含量增加，而二硫鍵的存在有助于加強(qiáng)和穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，使分子結(jié)構(gòu)更為有序。

2.4 臭氧處理對(duì)乳清蛋白空間結(jié)構(gòu)的影響

2.4.1 臭氧處理乳清蛋白紫外光譜分析

圖5 臭氧處理乳清蛋白的紫外光譜圖Fig. 5 UV spectra of whey protein treated with ozone

從圖5可看出，WPC的紫外光譜圖在280 nm附近有特征吸收峰，這主要是由蛋白肽鏈上色氨酸和酪氨酸殘基的芳香雜環(huán)π→π*躍遷引起。當(dāng)臭氧處理時(shí)間為5 s時(shí)，樣品的特征吸收峰未發(fā)生偏移，但強(qiáng)度更高，說明短時(shí)間的臭氧處理不會(huì)改變色氨酸和酪氨酸殘基的側(cè)鏈基團(tuán)分布，但會(huì)使乳清蛋白的空間結(jié)構(gòu)展開，更多的色氨酸和酪氨酸殘基暴露，三級(jí)結(jié)構(gòu)變得松散。隨著臭氧處理時(shí)間的延長，乳清蛋白的紫外最大吸收峰強(qiáng)度逐漸增加，且出現(xiàn)較為明顯的藍(lán)移，這說明較長時(shí)間的臭氧處理會(huì)使蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)及氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)發(fā)生明顯變化，從而導(dǎo)致具有紫外吸收能力的氨基酸的微環(huán)境發(fā)生改變。

2.4.2 臭氧處理乳清蛋白內(nèi)源熒光光譜分析

圖6 臭氧處理乳清蛋白的內(nèi)源熒光光譜圖Fig. 6 Intrinsic fluorescence spectra of whey protein treated with ozone

乳清蛋白中含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸3 種芳香族氨基酸，在280 nm波長的激發(fā)條件下，這3 種氨基酸內(nèi)的苯環(huán)或者共軛雙鍵結(jié)構(gòu)使其具有熒光發(fā)光性質(zhì)，這種熒光被稱為內(nèi)源性熒光。因?yàn)楸奖彼岬臒晒鈴?qiáng)度很低，蛋白分子內(nèi)又發(fā)生了從酪氨酸殘基到色氨酸殘基的能量轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致酪氨酸殘基的熒光猝滅和色氨酸殘基的熒光增加，所以通常將色氨酸作為內(nèi)源性熒光探針探究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化。如圖6所示，當(dāng)臭氧處理時(shí)間為5 s時(shí)，乳清蛋白的內(nèi)源熒光變化不明顯，但隨著處理時(shí)間的延長，乳清蛋白內(nèi)源熒光逐漸降低，當(dāng)處理時(shí)間為25 s時(shí)，其特征峰值僅為未處理樣品的6.94%，且發(fā)生了9 nm的藍(lán)移。這可能是由于色氨酸具有低單電子氧化勢能，極易轉(zhuǎn)化為不穩(wěn)定的色氨酸自由基，進(jìn)而被臭氧氧化為犬尿氨酸，使內(nèi)源熒光強(qiáng)度下降。而隨著反應(yīng)的進(jìn)行，蛋白質(zhì)的聚集使蛋白分子內(nèi)未被氧化的色氨酸重新回到非極性環(huán)境中，使其最大吸收波長發(fā)生藍(lán)移。

2.4.3 臭氧處理乳清蛋白三維熒光光譜分析

在蛋白質(zhì)的三維熒光圖譜中，峰a和峰b分別為酪氨酸、色氨酸殘基的芳香雜環(huán)π→π*躍遷和多肽骨架的n→π*躍遷引起的熒光特征。從圖7和表4可知，臭氧處理使得峰a和峰b的峰強(qiáng)發(fā)生明顯下降。綜合分析可知，臭氧處理使乳清蛋白中部分酪氨酸和色氨酸殘基轉(zhuǎn)化為其衍生物，導(dǎo)致熒光猝滅，同時(shí)蛋白分子的聚集使色氨酸等疏水性氨基酸暴露減少，蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。

圖7 臭氧處理乳清蛋白的三維熒光光譜圖Fig. 7 3D fluorescence spectra of whey protein treated with ozone

表4 臭氧處理乳清蛋白的三維熒光圖譜峰位置和峰強(qiáng)度Table 4 3D fluorescence spectral parameters of whey protein treated with ozone

2.4.4 臭氧處理乳清蛋白表面疏水性分析

圖8 臭氧處理乳清蛋白的ANS熒光光譜圖Fig. 8 ANS fluorescence spectra of whey protein treated with ozone

表面疏水性是蛋白質(zhì)的重要理化性質(zhì)，其變化反映了蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的改變。通常情況下，利用熒光探針ANS對(duì)蛋白質(zhì)的表面疏水性進(jìn)行表征，其原理是蛋白質(zhì)的部分折疊部位有一組疏水側(cè)鏈，這些側(cè)鏈沒有完全嵌入到天然核心結(jié)構(gòu)中，并為ANS提供了結(jié)合位點(diǎn)。對(duì)所有樣品的表面疏水性進(jìn)行測定，如圖8所示。在較短時(shí)間（5、10 s）的臭氧處理?xiàng)l件下，乳清蛋白的表面疏水性呈遞增趨勢，但隨著處理時(shí)間的延長（15～25 s），樣品的表面疏水性發(fā)生明顯降低，并與處理時(shí)間呈顯著負(fù)相關(guān)。這種變化可以通過氧化過程中蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變解釋。當(dāng)臭氧處理時(shí)間較短時(shí)，臭氧使得乳清蛋白的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，其結(jié)構(gòu)變得更為松散，天然狀態(tài)下埋藏在蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水性氨基酸暴露于蛋白質(zhì)表面，使其表面疏水性增強(qiáng)。但隨著臭氧時(shí)間的延長，越來越多的蛋白質(zhì)單體之間發(fā)生共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合，產(chǎn)生了不同程度的多聚體，其表面的疏水基團(tuán)被掩埋于多聚體內(nèi)部，導(dǎo)致蛋白質(zhì)表面疏水性的顯著下降。除此之外，臭氧的氧化作用導(dǎo)致甲硫氨酸等疏水性氨基酸含量的變化也是蛋白質(zhì)表面疏水性改變的關(guān)鍵因素。

2.5 臭氧處理乳清蛋白與IgG和IgE結(jié)合能力的變化

圖9 臭氧處理乳清蛋白與IgE和IgG的結(jié)合能力Fig. 9 IgE and IgG binding ability of whey protein treated with ozone

表5 臭氧處理乳清蛋白的IC50值Table 5 IC50 of whey protein treated with ozone μg/mL

在間接競爭ELISA實(shí)驗(yàn)中，常用IC值（半抑制濃度）表征抗原抗體結(jié)合能力的強(qiáng)弱，即當(dāng)競爭抗原的IC值越大，則說明達(dá)到半抑制率所需的競爭抗原量越多，競爭抗原與抗體的結(jié)合能力越弱。通過對(duì)圖9結(jié)果進(jìn)行擬合，得到臭氧處理乳清蛋白的IC值如表5所示。臭氧處理使乳清蛋白的IgG和IgE結(jié)合能力發(fā)生明顯地變化。在以-乳白蛋白為包被抗原的條件下，乳清蛋白隨著臭氧處理時(shí)間的延長，與IgE的結(jié)合能力呈先增加后降低的趨勢，而與IgG的結(jié)合能力也大致隨著時(shí)間的延長而明顯降低。此外，在以-乳球蛋白為包被抗原的條件下，隨著處理時(shí)間的延長，乳清蛋白與IgE和IgG的結(jié)合能力也出現(xiàn)明顯的下降。這是因?yàn)榕Ｈ槿榍宓鞍状嬖谠S多過敏原表位，這是蛋白質(zhì)引發(fā)食物過敏反應(yīng)的免疫學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)，也是參與結(jié)合特異性抗體的結(jié)構(gòu)部分。根據(jù)表位結(jié)構(gòu)的不同，可將其分為線性表位和構(gòu)象性表位。通過上述研究可以發(fā)現(xiàn)，臭氧處理會(huì)改變?nèi)榍宓鞍字胁糠职被峤M分的含量，這一結(jié)果可能會(huì)導(dǎo)致乳清蛋白中位于線性表位上的部分氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)被氧化修飾，改變了其部分理化性質(zhì)，從而導(dǎo)致表位與抗體結(jié)合能力的降低。而臭氧處理對(duì)乳清蛋白的空間結(jié)構(gòu)也帶來了一定影響，這一改變也會(huì)導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)中部分構(gòu)象性表位發(fā)生變化，從而影響過敏原蛋白與IgE和IgG抗體的結(jié)合能力。當(dāng)處理時(shí)間較短時(shí)，乳清蛋白致敏性出現(xiàn)波動(dòng)，甚至略微升高的現(xiàn)象，可能是因?yàn)榈蛣┝砍粞跖c蛋白質(zhì)反應(yīng)溫和，蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)向無規(guī)卷曲方向轉(zhuǎn)化，空間結(jié)構(gòu)舒展，包埋在內(nèi)部的過敏原表位暴露，增強(qiáng)了乳清蛋白與特異性抗體的結(jié)合能力。當(dāng)乳清蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)重歸有序時(shí)，其致敏性得到顯著的降低。這一規(guī)律也在其他過敏原的相關(guān)研究中得以體現(xiàn)。除此之外，臭氧處理乳清蛋白的表面疏水性與致敏性也呈現(xiàn)出相似的變化規(guī)律。所以，結(jié)構(gòu)變化是乳清蛋白致敏性改變的關(guān)鍵因素。

3 結(jié) 論

利用臭氧對(duì)乳清蛋白溶液進(jìn)行不同時(shí)長的處理，發(fā)現(xiàn)臭氧處理對(duì)乳清蛋白的各級(jí)結(jié)構(gòu)均有較大影響。利用間接競爭ELISA對(duì)臭氧處理乳清蛋白的致敏性進(jìn)行血清學(xué)評(píng)估后發(fā)現(xiàn)，臭氧處理15 s以上可以使乳清蛋白中主要過敏原-乳白蛋白和-乳球蛋白的致敏性顯著下降。本研究說明了臭氧處理會(huì)改變牛乳過敏原乳清蛋白的結(jié)構(gòu)特性，從而降低了乳清蛋白的致敏性，這為新型低致敏乳制品的開發(fā)提供了理論依據(jù)，也為臭氧處理技術(shù)在改善乳蛋白功能上的應(yīng)用提供了一定新思路。除此之外，將臭氧的殺菌消毒作用與改善乳蛋白功能性及安全性相結(jié)合，研發(fā)出更有針對(duì)性的臭氧處理設(shè)備也將是后續(xù)研究的方向。