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    超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定食用植物油中典型鏈格孢霉毒素

    2022-09-01 08:02:18王新語徐靜靜王志新
    食品科學(xué) 2022年16期
    關(guān)鍵詞:孢霉鏈格植物油

    蘭 豐,王新語,姚 杰,姜 蔚,*,徐靜靜,孫 林,王志新,*

    (1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部果品及苗木質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(煙臺),山東 煙臺 265500;2.煙臺大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山東 煙臺 264005)

    近幾年,中國每年食用植物油消費量都在3 000萬 t以上,已成為全球最大的食用植物油消費國。食用植物油是人體必需脂肪酸的主要來源之一,其質(zhì)量和安全直接關(guān)系到人體的健康。

    鏈格孢屬真菌能夠產(chǎn)生70余種代謝產(chǎn)物,其中一些有致癌、致畸毒性,典型代表有細(xì)交鏈格孢菌酮酸(tenuazonic acid,TeA)、鏈格孢酚(alternariol,AOH)、交鏈格孢酚甲醚(alternariol monomethyl ether,AME)、交鏈孢烯(altenuene,ALT)和騰毒素(tentoxin,TEN),化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。鏈格孢屬真菌能夠侵染大豆、油菜、向日葵等,導(dǎo)致油料作物減產(chǎn),還能產(chǎn)生真菌毒素,繼而污染后續(xù)加工的食用油。加強食用植物油中鏈格孢霉毒素的風(fēng)險監(jiān)測尤為必要。中國目前尚未制定鏈格孢霉毒素在食品中的最大允許殘留限量,但歐盟自2011年就已開展鏈格孢酚霉毒素對不同人群的膳食攝入風(fēng)險評估研究,為制定最大殘留限量做準(zhǔn)備。

    圖1 典型鏈格孢霉毒素化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig. 1 Chemical structures of typical Alternaria toxins

    TeA具有互變異構(gòu)和旋轉(zhuǎn)異構(gòu)特性,色譜分離比較困難,以前的研究大都排除TeA,僅測定另外幾種毒素,還有的采用柱前衍生法只測定TeA。雖然柱前衍生法改變了TeA的性質(zhì)、改善了色譜行為,但在實際操作過程中,衍生重現(xiàn)性并不令人滿意。鏈格孢霉毒素的檢測在果蔬及其制品方面應(yīng)用較多,而植物油方面鮮有報道。2020年有研究者使用質(zhì)譜法同時測定葵花籽油中5 種鏈格孢霉毒素,運用同位素內(nèi)標(biāo)校正基質(zhì)效應(yīng)。目前已有的植物油中鏈格孢霉毒素的檢測方法主要使用80%甲醇溶液提取,后續(xù)的氮吹濃縮時間過長,部分毒素有損失。此外,由于部分鏈格孢霉毒素還缺乏相應(yīng)的同位素標(biāo)準(zhǔn)品,而且費用昂貴,該方法還不能被普遍應(yīng)用。

    針對上述存在的問題,本研究擬從前處理入手,利用正交試驗獲得較佳的植物油前處理方法,優(yōu)化色譜和質(zhì)譜條件,以期建立便于操作和應(yīng)用的植物油中鏈格孢霉毒素檢測方法,為制定我國食品中鏈格孢霉毒素限量標(biāo)準(zhǔn)提供技術(shù)支撐。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    TeA、AOH、AME、ALT和TEN標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(純度均大于98%) 德國Dr. Ehrenstorfor公司;乙腈、甲醇(均為質(zhì)譜純) 上海安譜實驗科技股份有限公司;碳酸銨(優(yōu)級純) 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    LC-MS 8040液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀 日本島津公司;BEH C色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)美國Waters公司;SK-1渦旋混勻器 常州國華電器有限公司;BS323S電子天平 德國Sartorius公司;TD5AWS離心機 上海盧湘儀儀器有限公司;N-EVAP氮吹儀美國Organomation公司;Milli-Q超純水系統(tǒng) 德國默克公司。

    1.3 方法

    1.3.1 溶液配制

    標(biāo)準(zhǔn)溶液:稱取一定量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),用甲醇溶解,配制成一定質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。分別量取適量的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,用甲醇稀釋、定容,配制成1.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液用甲醇逐級稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)溶液獲得。基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液由陰性樣品的提取液經(jīng)氮吹近干后用標(biāo)準(zhǔn)工作液復(fù)溶后獲得。

    1 mmol/L碳酸銨溶液:稱取0.157 g碳酸銨固體溶解于1 000 mL水中。

    1.3.2 樣品前處理

    稱取2.0 g食用油于10 mL塑料離心管中,加入4 mL甲醇-乙腈(1∶1,/)溶液,渦旋10 s,于5 000 r/min離心5 min,取2 mL上清液于10 mL塑料離心管中,70 ℃氮吹至近干,加入0.5 mL甲醇復(fù)溶后,經(jīng)0.22 μm聚四氟乙烯濾膜過濾到裝有塑料內(nèi)襯管的進樣瓶中,上機待測。

    1.3.3 儀器條件

    1.3.3.1 色譜條件

    流動相:A為乙腈,B為1 mmol/L碳酸銨溶液;流速0.3 mL/min;進樣量2.0 μL;柱溫30 ℃;梯度洗脫條件:0.0~1.0 min,10% A、90% B;1.0~4.0 min,10%~95% A、90%~5% B;4.0~7.0 min,95% A、5% B;7.1 min,10% A、90% B。

    1.3.3.2 質(zhì)譜條件

    電噴霧負(fù)離子電離模式;多反應(yīng)監(jiān)測掃描;加熱模塊溫度400 ℃;脫溶劑管溫度250 ℃;霧化氣(氮氣)流速3.0 L/min;干燥氣(氮氣)流速15 L/min;碰撞氣(氬氣)壓力230 kPa。5 種鏈格孢霉毒素的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

    表1 5 種鏈格孢霉毒素的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometry parameters of 5 kinds of Alternaria toxins

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    采用Labsolutions軟件(Shimadzu公司)進行超高液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析,Microsoft Excel進行統(tǒng)計計算,ChemDraw Ultro 8.0軟件進行鏈格孢霉毒素結(jié)構(gòu)式的繪制,OriginPro 8.5軟件進行鏈格孢霉毒素總離子流圖繪制。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 儀器條件優(yōu)化

    2.1.1 色譜條件優(yōu)化

    p值是影響化合物色譜行為的因素之一。AOH、ALT、AME的p值分別為7.6、7.5、7.7,呈弱酸性,TEN呈中性。這4 種毒素在C柱上都能較好地保留。TeA的p值為4.3,酸性比其他4 種毒素強,極性更大。首先測試Waters HSS T3(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)和Waters Fluoro-Phenyl(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)兩款適合分析極性化合物的色譜柱,發(fā)現(xiàn)使用這兩款分離柱未能獲得TeA目標(biāo)峰。在同樣條件下測試了其他幾種色譜柱,包括Agilent Eclipse XDB C(150 mm×2.1 mm,3.5 μm)、Agilent ZORBAX SB C(150 mm×2.1 mm,3.5 μm)、Waters BEH C(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)、Waters Phenyl-Hexyl(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)、SHIMADZU Shim-pack XR-ODS(75 mm×2.0 mm,1.6 μm)、GL Sciences Bio C(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)等,發(fā)現(xiàn)TeA僅在XDB C上出峰。這可能與這款色譜柱采用了封端的技術(shù),覆蓋了硅醇基,減弱了TeA與硅醇基之間的相互作用。但封端并沒有完全覆蓋硅醇基,導(dǎo)致TeA峰寬過大、拖尾,峰形不平滑尖銳,在嘗試各種流動相條件后仍不能改善。

    草甘膦的極性強而且具有螯合性,性質(zhì)與TeA相似。前期實驗室在堿性流動相條件下,獲得較好的草甘膦色譜峰,受其啟發(fā),嘗試在流動相中加入碳酸銨,使用耐堿性的BEH C色譜柱分離5 種毒素,獲得較好的TeA色譜峰,其他4 種毒素峰形和靈敏度都得到了改善和提高。以甲醇作有機流動相時,在291/229(ALT定量離子對)通道中ALT的出峰時間前后基線較高,可能會影響ALT的定量。嘗試變化流動相梯度洗脫程序,基線異常的情況沒有改變。以乙腈作流動相時,基線恢復(fù)正常,因此把碳酸銨溶液和乙腈作為流動相。考察碳酸銨在1、2 mmol/L和3 mmol/L質(zhì)量濃度條件下毒素響應(yīng)值,發(fā)現(xiàn)隨著碳酸銨濃度的增加,5 種毒素的靈敏度均有部分降低。因此,確定碳酸銨使用濃度為1 mmol/L。最終確定以乙腈和1 mmol/L碳酸銨溶液為流動相,以BEH C柱為分離柱進行5 種毒素的分析。

    2.1.2 質(zhì)譜條件的選擇

    5 種毒素分別用甲醇配制成質(zhì)量濃度1.0 mg/L的單標(biāo)準(zhǔn)溶液,采用流動注射方式,在/100~1 000范圍內(nèi)進行正負(fù)全掃描。5 種毒素均能找到相應(yīng)的加氫和減氫母離子。一般情況下加氫離子的靈敏度高于減氫離子,通常會選擇靈敏度更高的加氫離子作母離子進行后續(xù)的條件優(yōu)化??紤]到流動性為堿性,更有利于氫的失去,因此選擇5 種毒素的減氫離子作為母離子。對確定的母離子進行打碎,分別找到響應(yīng)高的2 個產(chǎn)物離子作為子離子。在確定的母離子和子離子的基礎(chǔ)上,優(yōu)化Q1、Q3電壓和碰撞電壓等參數(shù),獲得5 種毒素的質(zhì)譜參數(shù)(表1),典型色譜圖見圖2。

    圖2 定量限質(zhì)量濃度下的鏈格孢霉毒素總離子流圖Fig. 2 Total ion current chromatogram of Alternaria toxins at LOQ

    2.2 前處理條件優(yōu)化

    2.2.1 提取條件的優(yōu)化

    影響提取效率的因素有很多,其中包括溶劑對目標(biāo)物的溶解性、溶劑對基質(zhì)的浸透和擴散能力以及提取時間等。正交試驗?zāi)軓亩鄠€因素中快速找到影響結(jié)果的關(guān)鍵因素和最優(yōu)方案。因此,本研究選取提取溶劑、提取劑體積和提取時間3 個影響提取效率的主要因素設(shè)計3因素3水平正交試驗,以回收率為指標(biāo),每組實驗重復(fù)3 次,正交試驗結(jié)果見表2。

    表2 正交試驗設(shè)計及結(jié)果(n=3)Table 2 Orthogonal array design and experimental results (n = 3)

    從表2可以看出,對于TeA,提取溶劑的類型對結(jié)果影響最大,提取劑體積和時間影響較小。極性較強的甲醇有利于TeA的提取,而純乙腈提取效率最差,這可能與TeA的極性較強有關(guān)。提取溶劑類型對結(jié)果影響較大的還有AME,但對于AME,乙腈是較好的提取溶劑,這可能與AME具有親酯性,極性較小有關(guān)。提取劑體積對AME的影響次之,從結(jié)果看4 mL的提取體積更有利于AME的提取,影響最小的是提取時間。另外3 種毒素ALT、AOH和TEN的情況一致,提取劑體積對回收率影響最大,溶劑類型影響次之,提取時間影響最小,從結(jié)果看,4 mL體積對這3 種毒素提取效果最好。從整體看,TeA和AME對溶劑類型要求較高,甲醇和乙腈混合提取兼顧了二者的極性,提取效果最好,ALT、AOH、TEN和AME在4 mL體積時提取效果最佳,TeA在3 種體積下,提取效率相差不大,因此確定5 種毒素的提取體積為4 mL,而提取時間對目標(biāo)物的回收率結(jié)果影響最小,考慮效率因素,確定提取時間為10 s。

    2.2.2 其他條件的確定

    前處理中使用玻璃離心管會降低AOH、AME和TeA的回收率,因此渦旋提取過程應(yīng)使用塑料離心管。玻璃進樣瓶對TeA的吸附較明顯,長時間進樣,TeA的響應(yīng)值會有降低,應(yīng)使用塑料或帶有塑料內(nèi)襯管進樣瓶。尼龍濾膜對AME和AOH有吸附,而聚四氟乙烯膜對這5 種毒素均沒有吸附,應(yīng)使用聚四氟乙烯有機系膜。

    2.3 基質(zhì)效應(yīng)和線性范圍

    基質(zhì)效應(yīng)評價主要是比較基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率,計算公式為:基質(zhì)效應(yīng)/%=(基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率-1)×100??ㄗ延?、大豆油陰性樣品經(jīng)提取、氮吹后,用標(biāo)準(zhǔn)工作溶液復(fù)溶得到5 種毒素系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液使用甲醇配制。表3顯示,AOH、ALT、TEN和AME的質(zhì)量濃度范圍為0.002~0.2 mg/L,TeA質(zhì)量濃度范圍為0.02~0.2 mg/L。5 種毒素在配制的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好,≥0.998。代表性的兩種基質(zhì)中5 種毒素的基質(zhì)效應(yīng)在2.9%~18.7%之間,均小于20%,說明在該前處理和儀器條件下,5 種毒素在植物油基質(zhì)中存在弱的基質(zhì)效應(yīng),可以忽略。在定量時可以直接使用溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    表3 典型鏈格孢霉毒素的線性范圍和基質(zhì)效應(yīng)Table 3 Linear ranges and matrix effect of typical Alternaria toxins

    2.4 方法學(xué)評價

    以陰性的葵花籽油和大豆油為代表性基質(zhì),添加3 個水平的毒素,渦旋靜置1 h后,按1.3.2節(jié)前處理和1.3.3節(jié)實驗條件檢測,結(jié)果如表4所示,TeA在0.02、0.1 mg/kg和0.2 mg/kg添加量下,其余4 種毒素在0.002、0.02 mg/kg和0.2 mg/kg添加量下,5 種毒素的平均回收率在98%~118%之間,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.9%~17.4%之間,滿足分析要求。而TeA在低于0.02 mg/kg添加量下,另外4 種毒素在低于0.002 mg/kg添加量下,其回收率和精密度不能滿足檢測要求。因此,根據(jù)添加回收實驗,確定TeA的定量限為0.02 mg/kg,其余4 種毒素的定量限為0.002 mg/kg。

    表4 典型鏈格孢霉毒素在2 種代表性植物油基質(zhì)中的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)Table 4 Recoveries and RSDs of typical Alternaria toxins in two representative vegetable oils (n = 5)

    2.5 實際樣品檢測結(jié)果

    對超市購買的芝麻油、大豆油、葵花籽油、花生油等10 個植物油樣品進行鏈格孢霉毒素檢測,在芝麻油和葵花籽油中均檢出AME,質(zhì)量濃度分別為0.005~0.02 mg/L和0.003~0.008 mg/L,其他4 種毒素未檢出,見表5。水媒法是芝麻油和葵花籽油生產(chǎn)的常見方法,AME具有親酯性,在植物油生產(chǎn)過程中可能更多地保留在油脂層,而其他4 種毒素的極性較AME更強,更多可能進入了水層,這可能是AME檢出率高的原因。

    表5 實際樣品檢測結(jié)果Table 5 Results of determination of Alternaria toxins in actual samples

    3 結(jié) 論

    建立了食用植物油中5 種鏈格孢霉毒素簡便、高效測定方法。利用正交試驗優(yōu)化提取溶劑、提取劑體積和提取時間等前處理要素條件。采用碳酸銨溶液和乙腈為流動相優(yōu)化色譜條件和質(zhì)譜條件,所建方法基質(zhì)效應(yīng)不明顯,可以通過溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線直接定量,實現(xiàn)了植物油中鏈格孢霉毒素的高效檢測。通過對實際樣品的檢測發(fā)現(xiàn)AME在植物油樣品中檢出率較高,其他4 種毒素未檢出,分析可能與植物油的生產(chǎn)工藝有關(guān),這對以后優(yōu)化和改進相關(guān)生產(chǎn)工藝有一定幫助。但方法中TeA的響應(yīng)相對其他4 種毒素要低,需要進一步研究和改進。

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