基于葉綠體基因組分析我國(guó)苜蓿屬植物演化路徑

王曉娟,董文攀,周世良

1 上海科技館,上海自然博物館自然史研究中心,上海 200127 2 北京林業(yè)大學(xué)生態(tài)與自然保護(hù)學(xué)院,北京 100083 3 中國(guó)科學(xué)院植物研究所,系統(tǒng)與進(jìn)化植物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100093

苜蓿屬(MedicagoLinn.)隸屬于豆科蝶形花亞科車軸草族,屬下物種經(jīng)歷數(shù)次劃分調(diào)整,物種數(shù)量從最初的46種不斷增加至目前的87種,我國(guó)有15種[1—3]。苜蓿屬植物的分類困難與其起源、地理分布以及相似的易混淆物種有關(guān),例如,區(qū)分苜蓿屬、胡盧巴屬(TrigonellaLinn.)和草木犀屬(MelilotusLinn.)的一些物種,一直是令人棘手的難題[4—5]。1977年,Ivanov[6]提出苜蓿屬植物的起源地在高加索地區(qū),之后有學(xué)者認(rèn)為是地中海北部海岸[1]。目前發(fā)現(xiàn)的苜蓿屬大多數(shù)物種分布于地中海沿線、阿拉伯半島、伊拉克和巴爾干東部地區(qū),而部分成員如紫花苜蓿復(fù)合體中的少數(shù)種則因栽培逃逸擴(kuò)展至中亞、北亞和東亞地區(qū)[2—3]。苜蓿屬植物為一年生或多年生草本,稀灌木,在整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)乃至農(nóng)牧生產(chǎn)系統(tǒng)中均具有重要的功能,廣泛分布于山地、農(nóng)田、草地、森林等不同生態(tài)系統(tǒng)類型,其中,紫花苜蓿因其高蛋白、全營(yíng)養(yǎng)和耐消化等優(yōu)良特性,成為世界上最為重要的飼料作物之一[7]；截形苜蓿因其為二倍體、自花授粉、種子量大和遺傳操作方便等特性,成為豆科植物研究的模式植物[8]。

據(jù)《中國(guó)植物志》記載,我國(guó)現(xiàn)有苜蓿屬植物15種,隸屬于木本苜蓿組、天藍(lán)苜蓿組、紫苜蓿組、闊莢苜蓿組和南苜蓿組,而《Flora of China》未做屬下等級(jí)的劃分[2]。鄧宏超等[4]研究了國(guó)內(nèi)苜蓿屬和胡盧巴屬的分類劃分,并基于形態(tài)學(xué)特征等將苜蓿屬植物分為三類：一是開紫花而莢果螺旋盤卷,二是開黃花而莢果鐮刀狀彎曲或稍直,三是花雜色而莢果鐮刀狀彎曲至螺旋盤卷的過渡類型。但由于苜蓿屬植物耐受性強(qiáng),分布廣泛,生活型多變,導(dǎo)致學(xué)界難以將苜蓿屬植物的進(jìn)化歷史與其地理、生境特征直接關(guān)聯(lián)。如何通過科學(xué)方法探究苜蓿屬植物的生態(tài)演化路徑已經(jīng)成為本學(xué)科關(guān)注的熱點(diǎn)之一。

隨著分子生態(tài)學(xué)的出現(xiàn)和發(fā)展,利用基因組學(xué)和分子生物學(xué)的方法解決生態(tài)學(xué)問題不斷報(bào)道,但目前我國(guó)有關(guān)苜蓿屬植物葉綠體基因組和系統(tǒng)發(fā)育方面的研究尚開展較少,通過葉綠體基因組揭示該屬植物的起源、演化方面的研究也少有報(bào)道。葉綠體是細(xì)胞內(nèi)一類具有自主遺傳功能的重要細(xì)胞器。自1986年葉綠體基因組首次被測(cè)定以來(lái)[9—10],已有近6,549個(gè)物種的葉綠體基因組被測(cè)序,涵蓋大多數(shù)重要的真核光合類群(National Center for Biotechnology Information,NCBI,2021年6月8日登錄)。葉綠體基因組數(shù)據(jù)的迅速增加,表明本領(lǐng)域已經(jīng)逐漸成為研究熱點(diǎn),同時(shí)也為揭示葉綠體基因組在研究生態(tài)進(jìn)化中的重要價(jià)值提供了依據(jù)。研究表明,葉綠體基因組不僅在探究物種起源、演化以及物種間親緣關(guān)系等方面具有重要貢獻(xiàn)[11—12],而且在作物遺傳改良、生物制劑生產(chǎn)等方面也顯示出了巨大潛力[13]?；诖?為了闡明我國(guó)苜蓿屬植物的分子生態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)特征,探究其在我國(guó)的生態(tài)進(jìn)化路徑,本研究選取我國(guó)10個(gè)苜蓿屬代表物種和葫蘆巴屬一個(gè)物種作為研究對(duì)象,采用高通量測(cè)序平臺(tái)測(cè)定其葉綠體全基因組和核基因ITS序列,通過分析其葉綠體基因組結(jié)構(gòu)特征和變異規(guī)律,構(gòu)建苜蓿屬植物的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,結(jié)合上述苜蓿屬植物來(lái)源地的生境特征,探究我國(guó)苜蓿屬物種的葉綠體基因組進(jìn)化式樣,揭示我國(guó)苜蓿屬植物的演化機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 植物材料

苜蓿屬和胡盧巴屬植物種子來(lái)自中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所中國(guó)西南野生生物種質(zhì)資源庫(kù)(Germplasm Bank of Wild Species,GBWS),截形苜蓿種子來(lái)自澳大利亞南澳研究開發(fā)院(South Austrulian Research and Development Institute,SARDI)牧草種質(zhì)資源庫(kù),每種供試材料的采集編號(hào)以及采集地的年均降雨量、年均日照時(shí)數(shù)、年均氣溫和氣候區(qū)特征見表1。

表1 取樣的苜蓿屬植物材料信息

1.2 溫室培養(yǎng)

2018年至2019年,表1中苜蓿屬和胡盧巴屬植物的種子于智能溫室(上海乾菲諾農(nóng)業(yè)科技有限公司)進(jìn)行萌發(fā)和培養(yǎng)。所有種子經(jīng)溫水浸種8 h后,將種子置于25℃恒溫箱中催芽,每天投洗種子2次,直至種子露白后,進(jìn)行播種。溫室栽培條件為溫度(25±2)℃,光照強(qiáng)度400 μmol m-2s-1,空氣濕度40%,始終保持基質(zhì)濕潤(rùn)。整個(gè)生育期內(nèi)常規(guī)管理(圖1)。

圖1 供試苜蓿屬植物形態(tài)Fig.1 Medicago plants cultivated in green house1,紫苜蓿 M. sativa；2,雜交苜蓿 M. varia；3,截形苜蓿 M. truncatula；4,南苜蓿 M. polymorpha；5,天藍(lán)苜蓿 M. lupulina；6,青海苜蓿 M. archiducis-nicolai；7,花苜蓿 M. ruthenica；8,直果胡盧巴 M. orthoceras；9,單花胡盧巴 M. monantha；10,毛莢苜蓿 M. edgeworthii; 每個(gè)種各2張圖片,圖示各物種的葉片、花序、莢果或復(fù)葉等

1.3 DNA提取與高通量測(cè)序

采集幼嫩葉片立即置于液氮中冷凍后低溫保存。樣品總DNA采用mCTAB法提取,具體步驟參考李金璐等[14]的植物DNA提取方法。

總DNA采用超聲打斷,切膠回收350 bp的DNA片段,利用NEBNext?的建庫(kù)試劑盒構(gòu)建350 bp大小的文庫(kù),利用Hiseq 4000 PE150的測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序(北京諾禾致源科技股份有限公司,北京)。

1.4 葉綠體基因組和ITS序列拼接與注釋

高通量測(cè)序數(shù)據(jù)采用SPAdes3.6.1軟件進(jìn)行質(zhì)量控制和拼接,以已經(jīng)發(fā)表的葉綠體基因組和ITS序列為參考,用Blast程序篩選出葉綠體基因組和ITS序列的contigs[15],篩選出的葉綠體基因組和ITS序列的contigs用Sequencher 4.10組裝成完整的葉綠體基因組和ITS序列。

利用Plann程序?qū)Λ@得的葉綠體基因組進(jìn)行注釋。利用已經(jīng)公開發(fā)表的M.sativa(序列接收號(hào)：MK460489)為參考序列,對(duì)所有的蛋白質(zhì)編碼基因,rRNA和tRNA基因進(jìn)行注釋,并對(duì)注釋結(jié)果進(jìn)行逐一檢查。缺失的基因或者自動(dòng)注釋錯(cuò)誤的基因,依照參考序列的注釋信息進(jìn)行手動(dòng)調(diào)整,得到完整的注釋結(jié)果。利用在線軟件OGDRAW(https://chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/OGDraw.html)繪制苜蓿屬物種的葉綠體基因組物理圖譜。

1.5 簡(jiǎn)單重復(fù)序列分析

利用MISA 軟件對(duì)苜蓿屬物種的葉綠體基因組的簡(jiǎn)單序列重復(fù)(simple sequence repeats, SSRs)分別進(jìn)行檢測(cè)。SSR位點(diǎn)的定義如下,單核苷酸單元的重復(fù)數(shù)≥10；二核苷酸單元的重復(fù)數(shù)≥5,三核苷酸單元重復(fù)數(shù)≥4,四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸單元的重復(fù)數(shù)≥3。兩個(gè)SSRs之間的距離不少于20 bp。

1.6 系統(tǒng)發(fā)育分析

根據(jù)注釋結(jié)果,提取苜蓿屬葉綠體基因組的76個(gè)編碼基因,利用MAFFT 軟件進(jìn)行比對(duì),并利用MEGA X進(jìn)行手工檢查。比對(duì)好之后串聯(lián)成一個(gè)數(shù)據(jù)集進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。用RAxML軟件以最大似然法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。核苷酸替換模型采用GTR+G,系統(tǒng)發(fā)育各個(gè)分支長(zhǎng)度的支持率通過進(jìn)行500次自展重復(fù)分析獲得。

2 結(jié)果與分析

2.1 苜蓿屬葉綠體基因組結(jié)構(gòu)特征

本研究測(cè)定了苜蓿屬10個(gè)物種完整的葉綠體基因組和1個(gè)胡盧巴屬物種的葉綠體基因組,平均測(cè)序深度從1,222×(青海苜蓿)到10,340×(花苜蓿)。供試材料的葉綠體基因組基本特征見表2。葉綠體基因組大小不盡相同,介于121—127 kb之間,其中,青海苜蓿葉綠體基因組最大,長(zhǎng)度為127,358 bp,單花胡盧巴最小,長(zhǎng)度為121,082 bp,兩者基因組大小相差約6 kb。GC含量介于33.8%—34.1%之間,平均值為34.02%,不同物種間GC含量差異較小,有5個(gè)物種的葉綠體GC含量完全一致,均為34.1%。

表2 苜蓿屬植物葉綠體基因組測(cè)序分析

由圖2可見,供試苜蓿屬和胡盧巴屬均非典型的“四區(qū)”結(jié)構(gòu),都缺失了一個(gè)大的反向重復(fù)序列,屬于豆科蝶形花亞科車軸草族反向重復(fù)序列缺失支(inverted repeat-lacking clade,IRLC)。依據(jù)組裝注釋的葉綠體基因組的結(jié)構(gòu)特征,供試材料的葉綠體基因組分為以下4種類型：1)類型I最為普遍,包括圖2中所示的直果胡盧巴、單花胡盧巴、毛莢苜蓿、紫苜蓿、雜交苜蓿、南苜蓿和截形苜蓿；2)類型II,包括青海苜蓿和花苜蓿兩種；3)天藍(lán)苜蓿單獨(dú)作為類型III；4)胡盧巴單獨(dú)作為類型IV。對(duì)比后發(fā)現(xiàn),四種類型的葉綠體基因組結(jié)構(gòu)發(fā)生了不同程度的變化,包括基因的重排現(xiàn)象、片段丟失等。

圖2 苜蓿屬植物4種葉綠體基因組類型Fig.2 Four types of plastomes in Medicago plants最外圈的方框表示基因(圈內(nèi)的表示順時(shí)針轉(zhuǎn)錄,圈外的表示逆時(shí)針轉(zhuǎn)錄)；不同顏色表示不同功能的基因；陰影表示GC含量；類型I,直果胡盧巴、單花胡盧巴、毛莢苜蓿、紫苜蓿、雜交苜蓿、南苜蓿和截形苜蓿；類型II,青海苜蓿和花苜蓿；類型III,天藍(lán)苜蓿；類型IV,胡盧巴

供試材料的葉綠體基因組都含有111個(gè)不同的基因,包括77個(gè)蛋白編碼基因、30個(gè)tRNA基因和4個(gè)rRNA基因。其中,自我復(fù)制基因包括核糖體大亞基、核糖體小亞基的蛋白編碼基因、tRNA和rRNA基因；光合作用基因包括光系統(tǒng)I、光系統(tǒng)II、NADH脫氫酶、細(xì)胞色素b/f復(fù)合物、ATP合成酶和RubisCo大亞基的蛋白編碼基因；其他基因包括成熟酶K、囊膜蛋白、乙酰輔酶A羧化酶亞基、C-型細(xì)胞色素酶、蛋白酶基因以及未知功能蛋白編碼基因(表3)。

表3 苜蓿屬葉綠體基因組的基因類型、基因群和基因名稱

2.2 苜蓿屬物種葉綠體基因組簡(jiǎn)單序列重復(fù)

由圖3可見,苜蓿屬葉綠體基因組的簡(jiǎn)單序列重復(fù)數(shù)為102到129個(gè),單堿基重復(fù)出現(xiàn)次數(shù)最多(62.14%),其次為二堿基重復(fù)(21.29%)。單堿基重復(fù)多是A/T,二堿基重復(fù)則多為AT/TA。

圖3 苜蓿屬物種葉綠體基因組簡(jiǎn)單重復(fù)序列的數(shù)量及其分布特征Fig.3 Numbers and characterization of simple sequence repeat (SSR) in Medicago plastomes

2.3 苜蓿屬物種葉綠體基因組結(jié)構(gòu)變異

如圖4所示,在供試苜蓿屬和胡盧巴屬的葉綠體基因組中,共發(fā)現(xiàn)10個(gè)倒位的結(jié)構(gòu)變異：1)天藍(lán)苜蓿中2個(gè),發(fā)生在基因atpB到y(tǒng)cf3、ndhC到trnLUAA之間的區(qū)域；2)青海苜蓿和花苜蓿共享4個(gè)倒位,發(fā)生在從基因psbM到psaA、ndhB到trnNGUU、ndhB到rpoA和clpP到rpl20之間的區(qū)域；3)胡盧巴中6個(gè),發(fā)生在基因accD到trnPUGG、ndhB到rpoA、rpl20到psbF、ndhB到trnNGUU、psbJ到cemA以及psbB到y(tǒng)cf1之間的區(qū)域。其中,胡盧巴發(fā)生倒位變異最多,6處倒位既包括從psbB到y(tǒng)cf1共包含32個(gè)基因的長(zhǎng)序列區(qū)段,也有從psbJ到cemA僅包含3個(gè)基因的短序列區(qū)段。其中,天藍(lán)苜蓿獨(dú)立發(fā)生2處倒位,而在青海苜蓿、花苜蓿和胡盧巴3個(gè)物種中則平行共享以下2處倒位：ndhB到trnNGUU(包含12個(gè)基因)、ndhB到rpoA(包含14個(gè)基因)。

圖4 基于葉綠體編碼基因的苜蓿屬植物系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和葉綠體基因組結(jié)構(gòu)變異Fig.4 Phylogenetic relationships based on plastid coding genesand distribution of plastome structural mutations內(nèi)含子丟失和倒位繪制在分支圖的分枝上；右上角的小圖表示帶枝長(zhǎng)的系統(tǒng)發(fā)育樹,圖中數(shù)字表示所在節(jié)點(diǎn)的支持率,未標(biāo)注數(shù)字的節(jié)點(diǎn)的支持率均為100

葉綠體基因組序列分析還在天藍(lán)苜蓿中發(fā)現(xiàn)了內(nèi)含子丟失現(xiàn)象。3個(gè)發(fā)生內(nèi)含子丟失的基因分別是clpP、rpoC1和atpF,其功能分別為編碼蛋白酶、DNA的RNA聚合酶以及ATP合成酶(圖4)。

2.4 基于葉綠體基因組序列和核ITS序列的苜蓿屬系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

基于葉綠體基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系顯示4個(gè)主要譜系分支,從基部開始分別包含毛莢苜蓿、直果胡盧巴和單花胡盧巴、青海苜蓿和花苜蓿以及其他5個(gè)種。基于核基因ITS的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系與以上結(jié)果略有不同,主要是天藍(lán)苜蓿單獨(dú)形成分支,而不是與截形苜蓿等組成一個(gè)分支。ITS系統(tǒng)發(fā)育分化式樣與傳統(tǒng)的5個(gè)組的劃分吻合。

圖5 基于rDNA的ITS序列的苜蓿屬植物系統(tǒng)發(fā)育樹 Fig.5 Phylogenetic tree of Medicago species based on rDNA ITS sequences

3 討論

3.1 反向重復(fù)序列丟失和IRLC類群

作為分子生態(tài)學(xué)研究的基礎(chǔ),分子測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展,直接推動(dòng)了葉綠體基因組學(xué)的發(fā)展[16]。典型陸生植物葉綠體基因組為雙鏈環(huán)狀DNA分子,大小一般為115—165 kb,常編碼約101—118個(gè)基因。這些基因主要分為3類,即光合作用有關(guān)基因、基因自身表達(dá)有關(guān)的基因和其他生物合成有關(guān)的基因。植物的葉綠體基因組結(jié)構(gòu)一般具有相對(duì)保守的“四區(qū)”結(jié)構(gòu)：大單拷貝區(qū)(large single copy region,LSC)、小單拷貝區(qū)(small single copy region,SSC)和兩個(gè)序列完全相同、方向相反的反向重復(fù)區(qū)(inverted repeat region,IR)。在被子植物中,反向重復(fù)區(qū)域的基因高度保守,堿基的突變速率也低于單拷貝區(qū),研究表明IR區(qū)的存在對(duì)于穩(wěn)定葉綠體基因組結(jié)構(gòu)起到重要作用[17]。IR區(qū)主要編碼4個(gè)rRNA基因(rrn16、rrn23、rrn4.5 和rrn5)和一些未知功能基因(ycf)[18]。被子植物葉綠體基因組的“四區(qū)”結(jié)構(gòu)相對(duì)保守,但I(xiàn)R區(qū)域可擴(kuò)張或縮減,是影響葉綠體基因組大小的重要因素之一,導(dǎo)致不同植物類群的葉綠體基因組差異很大[19]。例如,發(fā)生在豌豆(Pisumsativum)中IR完全刪減[20]和天竺葵(Pelargoniumhortorum)中IR極度增加(增至76 kb)[21]的極端報(bào)道。此外,已報(bào)道的樟科葉綠體基因片段丟失事件,導(dǎo)致該科植物葉綠體基因組整體縮小,并且和樟科種系發(fā)生進(jìn)程一致[22]。

物種的進(jìn)化必然是建立在基因組的進(jìn)化之上,物種多樣性是生態(tài)、進(jìn)化和歷史過程的產(chǎn)物,其演化路徑可能既有宏觀上的方向性,也有微觀成種的隨機(jī)性。葉綠體基因組的縮減、擴(kuò)張及丟失可能與物種在進(jìn)化過程中的物種分化和譜系分化相吻合,當(dāng)然,兩者也不一定完全等同[23]。目前,盡管對(duì)植物葉綠體基因組的結(jié)構(gòu)和功能有所認(rèn)識(shí),但有關(guān)葉綠體基因組結(jié)構(gòu)變異與其生態(tài)進(jìn)化起源、演化驅(qū)動(dòng)機(jī)制等尚待深入研究。自Kolodner & Tewari[24]首次在豌豆葉綠體基因組中發(fā)現(xiàn)IR丟失現(xiàn)象,之后的研究又陸續(xù)在綠豆(Vignaradiata)、大豆(Glycinemax)、菜豆(Phaseolusvulgaris)和蠶豆(Viciafaba)中證實(shí)了其葉綠體基因組IR缺失現(xiàn)象[25—26]。隨著葉綠體基因組數(shù)據(jù)的不斷積累,豆科蝶形花亞科車軸草族物種的葉綠體基因組發(fā)生IR區(qū)的丟失現(xiàn)象,成為該類植物的指示特征,為此,該類群也被稱為反向重復(fù)序列缺失支,并且IR丟失事件(該支的分化事件)發(fā)生在—3900萬(wàn)年前[27—30]。如圖2 所示,供試苜蓿屬及其近緣屬胡盧巴也呈現(xiàn)IR區(qū)域的丟失,均為IRLC類成員(圖2)。越來(lái)越多的證據(jù)發(fā)現(xiàn),IR區(qū)段丟失現(xiàn)象還發(fā)生在其它植物類群中,如牻牛兒苗科(Geraniaceae)的老鸛草屬(Geranium)[31]和仙人掌科(Cactaceae)的仙人掌(Carnegieagigantea)[32]中,進(jìn)一步表明IR區(qū)的丟失可能在被子植物譜系中多次獨(dú)立發(fā)生,而葉綠體基因組大的結(jié)構(gòu)變異在特定類群因具有強(qiáng)烈的系統(tǒng)發(fā)育信號(hào),常被用來(lái)定義單系類群[33]。

3.2 苜蓿屬葉綠體基因組結(jié)構(gòu)變異的進(jìn)化啟示

包括苜蓿屬在內(nèi)的豆科IRLC類群是IR收縮的經(jīng)典案例,目前認(rèn)為大的IR收縮可能與基因組的異常重組有關(guān)[34]。研究發(fā)現(xiàn),小苜蓿(M.minima)中一段新的IR位于ycf1和clpP附近,而這兩個(gè)基因序列通常被認(rèn)為是高度變化的,并可能是基因重組的熱點(diǎn)區(qū)域[23]。堿基替換和結(jié)構(gòu)變異引起的基因重組事件頻發(fā)也可能導(dǎo)致豆科植物IR收縮的發(fā)生[35]。葉綠體基因組的大小除了受IR擴(kuò)張和收縮的影響,還與重復(fù)序列的含量相關(guān)。本研究測(cè)定的我國(guó)苜蓿屬植物的葉綠體基因組簡(jiǎn)單序列重復(fù)數(shù)為102到129個(gè),單堿基重復(fù)是出現(xiàn)次數(shù)最多的(62.14%),可作為分子標(biāo)記,為研究苜蓿系統(tǒng)學(xué)和進(jìn)化生物學(xué)提供依據(jù)。然而,葉綠體基因組的穩(wěn)定性和重復(fù)序列累積以及IR缺失或是獲得之間的關(guān)系尚未明了,特別是IR擴(kuò)張、收縮或缺失等結(jié)構(gòu)變異對(duì)核酸替換率的影響尚不清晰。

除反向重復(fù)序列(IR)的缺失,供試苜蓿屬物種中還發(fā)現(xiàn)了其它顯著的葉綠體基因組結(jié)構(gòu)變異,如天藍(lán)苜蓿clpP、rpoC1和atpF基因的內(nèi)含子丟失、青海苜蓿和花苜蓿之間共享倒位等,這些獨(dú)立或是平行發(fā)生的結(jié)構(gòu)變異,也是潛在的系統(tǒng)發(fā)育信號(hào),可以作為區(qū)分不同類群的重要特征(圖4)。研究發(fā)現(xiàn),豆科菜豆亞族的刺槐屬(Robinia)、綠豆、菜豆等物種,其葉綠體基因組發(fā)生50 kb倒位,和其它具有該結(jié)構(gòu)變異的類群構(gòu)成了50 kb倒位支[36—38]。事實(shí)上,包括苜蓿屬在內(nèi)的核心車軸草族的葉綠體基因組也發(fā)生了不同程度的重排,包括基因的重復(fù)、丟失和序列的倒位等[39]。大于1kb的倒位在蝶形花亞科植物中較為常見,本研究中青海苜蓿和花苜蓿倒位發(fā)生在基因psbM到psaA、ndhB到trnNGUU、ndhB到rpoA以及clpP到rpl20之間,而近緣屬的胡盧巴倒位變異則高達(dá)6處,包括psbB到y(tǒng)cf1的區(qū)段(含32個(gè)基因),以及psbJ到cemA區(qū)段(含3個(gè)基因),顯示出葉綠體基因組結(jié)構(gòu)變異的多樣性和復(fù)雜性。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),我國(guó)天藍(lán)苜蓿中的內(nèi)含子丟失與其它研究報(bào)道相一致,有必要通過更加廣泛的取樣和分析,進(jìn)一步評(píng)估該分支苜蓿物種的倒位、內(nèi)含子丟失及其演化模式[23]。研究表明,反向重復(fù)序列可能通過介導(dǎo)分子內(nèi)重組而導(dǎo)致倒位的發(fā)生[28]。缺乏反向重復(fù)區(qū)的豆科蝶形花亞科IRLC物種如何控制葉綠體基因組穩(wěn)定性還遠(yuǎn)未被闡明,或許對(duì)苜蓿屬?gòu)V泛的葉綠體基因組分析可以找出結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性與多樣性的關(guān)系,從而揭示IR多次得失的變異機(jī)制。

3.3 我國(guó)苜蓿屬植物的演化路徑

我國(guó)野生苜蓿分布在全國(guó)不同地理區(qū)域,適應(yīng)各種生境特征,從寒冷的北部沙漠到溫暖潮濕的南部山區(qū)和中部平原地帶,從國(guó)內(nèi)東部沿海到喜馬拉雅山脈[2]。這些野生種擁有豐富的自然變異來(lái)源,是了解苜蓿屬植物種群動(dòng)態(tài)和改善苜蓿品種的重要基礎(chǔ)。對(duì)于植物的生長(zhǎng)和分布來(lái)說,溫度、降水和光照是最重要的氣候因子,強(qiáng)烈地影響著物種的分布格局(表1)。由本實(shí)驗(yàn)測(cè)序結(jié)果(圖4),對(duì)照表1生境特征可知,苜蓿屬植物的進(jìn)化與年平均溫度、年均降雨量、年均日照時(shí)數(shù)等生境因子之間存在密切關(guān)系,特別是年平均溫度影響最大。年均溫度越高,物種出現(xiàn)的時(shí)間越晚,進(jìn)化程度越高,如紫苜蓿(11.1℃)、截形苜蓿(17.1℃)、南苜蓿(15.6℃)、天藍(lán)苜蓿(17.6℃),反之,處于進(jìn)化分支樹基部的物種,其生境條件均相對(duì)較為惡劣,如胡盧巴(3.6℃)、毛莢苜蓿(7.4℃)、單花胡盧巴(6.4℃)、花苜蓿(4.5℃)、青海苜蓿(5.1℃),表明溫度是苜蓿屬植物物種進(jìn)化的重要影響因子,溫度越高,越利于苜蓿屬植物的生長(zhǎng),有利于其拓展更廣闊的生境,進(jìn)而成為廣布種。其中,天藍(lán)苜蓿是一年生、二年生或偶爾短命的多年生植物,自交為主(自交率大于95%),分布廣泛,是易于繁衍的綠肥植物；而花苜蓿則是長(zhǎng)壽的多年生植物,行異交(自交率低于30%),分布狹窄,適應(yīng)干燥極寒的砂礫和沙漠等低投入生態(tài)系統(tǒng)。此外,天藍(lán)苜蓿具有不裂的小豆莢,通過生物和非生物因子促進(jìn)種子的長(zhǎng)距離傳播,而花苜蓿具開裂的豆莢并缺乏有效的種子傳播機(jī)制。從表型上看,天藍(lán)苜蓿的花相對(duì)較小,具2—4 mm的黃色蝶形花冠,而花苜蓿則有長(zhǎng)達(dá)8 mm的黃色花冠,更大更艷麗,能夠吸引更多的昆蟲訪花,如蜜蜂、大黃蜂等。然而,隨著快速城市化和過度放牧,國(guó)內(nèi)的野生苜蓿資源受到人為干擾和城市化進(jìn)程的影響,種群數(shù)量和規(guī)模大幅減少,其野生種質(zhì)資源調(diào)查和保護(hù)需引起重視。

苜蓿屬和胡盧巴屬植物具有相似的特征,長(zhǎng)期以來(lái),二者之間的進(jìn)化分類界限不明顯,部分物種的歸屬存在爭(zhēng)議,兩個(gè)屬之間存在“類苜蓿植物(Medicagoid)”或“類胡盧巴植物(Trigonelloid)”[40]。鄧宏超等[4]開展了苜蓿屬和胡盧巴屬植物形態(tài)特征及數(shù)量分類研究發(fā)現(xiàn),直果胡盧巴和單花胡盧巴屬于角形果組,聚類結(jié)果顯示它們與苜蓿屬植物之間存在較近的親緣關(guān)系,建議進(jìn)一步開展深入研究確定其能否歸并到苜蓿屬。而早期Small等[41]也曾提出將胡盧巴歸至角形果組并合并到苜蓿屬中。本研究基于葉綠體基因組及ITS序列重新構(gòu)建了苜蓿屬系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,我國(guó)苜蓿屬物種的基因分化式樣與傳統(tǒng)分類的紫苜蓿組、南苜蓿組、闊莢苜蓿組和天藍(lán)苜蓿組基本吻合。其中,直果胡盧巴和單花胡盧巴與毛莢苜蓿形成一枝,分子證據(jù)支持將苜蓿屬和胡盧巴屬之間的過渡類型“類苜蓿植物”獨(dú)立出來(lái)(圖4和圖5)。由此可見,葉綠體基因組大量的系統(tǒng)發(fā)育信息位點(diǎn),不僅有助于闡明苜蓿屬和胡盧巴屬之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,而且可建立高分辨率的苜蓿屬和胡盧巴屬種間的生態(tài)進(jìn)化關(guān)系。生命形式、交配系統(tǒng)和種子傳播是影響苜蓿屬植物種群的遺傳結(jié)構(gòu)塑造和地理分布的適應(yīng)性性狀。以上苜蓿屬植物葉綠體和核基因組分析連同生態(tài)、表型數(shù)據(jù)可為該屬植物的演化路徑提供依據(jù),并有助于確定自然種群的進(jìn)化潛力和保護(hù)策略。