S100A6對人肺癌細胞株Calu-6分化的影響研究

王婷，牛蔓，張奕

在世界范圍內，肺癌是病死率最高的腫瘤。2020年全球癌癥數據顯示，肺癌在全球185個國家共造成180萬死亡病例，位居36種癌癥之首［1］。按照病理類型，肺癌可分為小細胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）和非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），NSCLC又進一步分為腺癌（38.5%）、鱗癌（30.0%）、大細胞癌（2.9%）及其他［2］。因大多數肺癌患者就診時處于疾病的中晚期，故含鉑雙藥化療成為治療肺癌的主要手段。然而，即使接受標準化療方案，中晚期肺癌患者預后仍較差，其中SCLC患者平均總生存期不足1年［3］。近些年，因突變位點被發(fā)現，部分肺腺癌患者預后得到極大改善，靶向藥物也逐步在早期有位點突變肺癌患者的術后輔助治療及晚期有位點突變肺癌患者一線治療中被廣泛使用［4］。積極探索肺癌發(fā)生及發(fā)展的分子機制也成為眾多科研工作者的首要任務。

S100蛋白為小分子鈣結合蛋白，家族中共包含25個成員，其中至少有16個成員基因位于易發(fā)生重排的1號染色體長臂2區(qū)1帶（1q21）［5］。S100A6作為該家族中的重要一員，被證實與包括肺癌在內的多種腫瘤生物學功能相關［6］。本課題組前期研究發(fā)現，S100A6可抑制肺癌細胞株Calu-6增殖、侵襲和遷移，在裸鼠肺癌模型中可促進細胞凋亡，在細胞水平上有抑癌作用［7］。本研究進一步證實S100A6可抑制腫瘤的增殖，同時比較常見NSCLC標志物表達的差異，探討S100A6對人肺癌細胞株Calu-6分化的影響，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗時間 本實驗時間為2021年6月至2022年2月。

1.2 實驗材料

1.2.1 實驗動物 8～10周齡BALB/c裸鼠15只，購于武漢優(yōu)爾生生命科學裝備有限公司。飼養(yǎng)條件為：室溫26～28 ℃，相對濕度50%左右，保持通風，適當光照，所供飼料經滅菌處理。

1.2.2 實驗細胞 肺癌細胞株Calu-6（人肺退行性肺癌可傳代細胞系，未分化）購于中國科學院，293T細胞（人胚腎細胞）購于武漢優(yōu)爾生生命科學裝備有限公司，保存于CO2培養(yǎng)箱，2 h后開始實驗。

1.2.3 實驗試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)基（賽默飛世爾科技有限公司，貨號：121000061），MTT檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，貨號：M1020），細胞周期檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，貨號：CA1510），細胞凋亡檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，貨號：CA1040），T25細胞培養(yǎng)板（廣州碩譜生物科技有限公司，貨號：T25-011-050），6孔細胞培養(yǎng)板（廣州碩譜生物科技有限公司，貨號：T25-010-006），CO2培養(yǎng)箱（賽默飛世爾科技有限公司），CX33顯微鏡〔奧林巴斯（中國）有限公司〕。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)及pLVX-AcGFP1-N1-S100A6的構建 將肺癌細胞株Calu-6保存于37 ℃、5% CO2條件下，于高糖DMEM培養(yǎng)基（含15%熱滅活胎牛血清、100 U/ml鏈霉素、100 U/ml青霉素）中培養(yǎng)擴增。2周后，采用聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）制備PLVX-AcGFP1-N1-S100A6，引物信息為：正向引物5'-CCCAAGCTTA CCATGGCATGCCCCCTGGTCA-3'，反向引物5'-C GGAATTCCGGTCAGCCCTTGAGGGCTTCATT-3'。PCR的具體步驟和條件為：孵育（95 ℃、5 min）、變性（94 ℃、30 s，共44周）、退火（55 ℃、30 s）、延伸（72 ℃、30 s）。

1.3.2 病毒載體構建 以2∶1∶1的比例將pLVXAcGFP1-N1-S100A6、pMD2.G和psPAX2共同轉染293T細胞，構建S100A6過表達慢病毒；以2∶1∶1的比例將pLVX-AcGFP1-N1、pMD2.G和psPAX2共同轉染293T細胞，構建空載體慢病毒。

1.4 動物模型制備 BALB/c裸鼠采用簡單隨機法分為S100A6實驗組7只、空載體組4只、空白對照組4只，將S100A6過表達慢病毒、空載體慢病毒及空細胞分別注射到S100A6實驗組、空載體組、空白對照組BALB/c裸鼠右前背部。第2周開始每周測量BALB/c裸鼠的腫瘤體積，5周后處死裸鼠，取出腫瘤組織。

1.5 免疫組化印記法檢測經典NSCLC標志物 采用免疫組化印記法檢測5個經典NSCLC標志物在腫瘤組織中的表達情況，包括腺癌標志物〔甲狀腺轉移因子（thyroid transcription factor，TTF）-1、天冬氨酸蛋白酶A（NapsinA）〕及鱗癌標志物（P40、CK5/6、P63）。具體過程：使用3%過氧化氫去除腫瘤組織內源性過氧化物酶活性，后使用標志物一抗（TTF-1兔單抗，Abcam ab76013；NapsinA兔單抗，Abcam ab248340；P40兔單抗，Abcam ab76158；CK5/6鼠單抗，Abcam ab17133；P63兔單抗，Abcam ab124762）孵育，250倍稀釋，4 ℃過夜。加入辣根過氧化物酶標記的二抗（室溫，30 min）后使用二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）處理、蘇木素染色。使用200倍顯微鏡隨機選擇10個視野觀察上述標志物表達情況。表達程度評分標準為：25%細胞表達陽性為1分，26%～50%細胞表達陽性為2分，51%～75%細胞表達陽性為3分，＞75%細胞表達陽性為4分。強度評分標準為：無染色為0分，弱染色為1分，中等程度染色為2分，強染色為3分。表達程度評分加強度評分為最終評分結果，根據最終評分結果，判定＜4分為陰性，≥4分為陽性。

1.6 統計學方法 采用SPSS 26.0統計學軟件進行數據分析。計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腫瘤體積 第2、3、4、5周三組裸鼠腫瘤體積比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；其中S100A6實驗組裸鼠腫瘤體積小于空載體組和空白對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 三組裸鼠腫瘤體積比較（±s，mm3）Table 1 Comparison of tumor volume in three groups of nude mice

表1 三組裸鼠腫瘤體積比較（±s，mm3）Table 1 Comparison of tumor volume in three groups of nude mice

注：a表示與空白對照組比較，P＜0.05；b表示與空載體組比較，P＜0.05

組別 只數 第2周 第3周 第4周 第5周空白對照組 4 13.1±4.4 31.7±3.9 153.8±16.9 332.5±53.0空載體組 4 12.4±0.8 32.9±1.9 147.4±17.5 318.2±53.3 S100A6實驗組 7 1.4±1.4ab 7.0±3.5ab 54.2±8.6ab 107.4±14.2ab F值 9.12 19.55 20.52 14.01 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.2 經典NSCLC標志物 三組腫瘤組織中TTF-1、NapsinA、P40、CK5/6均表達陽性，S100A6實驗組、空載體組、空白對照組腫瘤組織中P63表達陽性率分別為7/7、3/4、3/4，見圖1。

圖1 經典NSCLC標志物在三組腫瘤組織中的表達（蘇木素染色，×200）Figure 1 Expression of classic NSCLC markers in three groups of tumor tissues

3 討論

本課題組前期研究成功構建了S100A6過表達肺癌細胞株Calu-6系，通過比較Calu-6、Calu-6/neo、Calu-6/S100A6細胞生物學行為證實，S100A6可抑制肺癌細胞株Calu-6增殖、侵襲和遷移，將細胞注射裸鼠體內后，S100A6實驗組裸鼠腫瘤體積明顯小于其他兩組［7］。本研究在前期研究的基礎上，采用免疫組化印跡法進一步分析三組腫瘤組織中經典NSCLC標志物的表達。免疫組化印跡法是惡性腫瘤病理診斷極其重要的輔助手段，其中輔助診斷肺癌的標志物已被納入中國臨床腫瘤學會肺癌診療指南［8］。常用的腺癌標志物包括TTF-1、NapsinA，鱗癌標志物包括P40、CK5/6和P63，而SCLC標志物包括CD56、Syn、CgA、TTF-1、CK、Ki-67。本研究納入指南推薦的NSCLC標志物［9］，證實三組腫瘤組織中TTF-1、NapsinA、P40、CK5/6均表達陽性，S100A6實驗組、空載體組、空白對照組腫瘤組織中P63表達陽性率分別為7/7、3/4、3/4，提示S100A6對未分化型肺癌細胞株Calu-6的分化方向（向鱗癌或腺癌方向）可能無明顯影響。

S100蛋白家族與包括肺癌在內多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關。S100A2被證實在進展期NSCLC患者的血清、組織中表達升高，其有促進腫瘤生長的功能［10］。S100A4高表達與NSCLC細胞株的低分化和病程進展有關［11］。作為S100蛋白家族中的一個重要成員，S100A6（Calcylin蛋白）第一個被證實與腫瘤細胞的分化程度有關，同時，該蛋白還被證實與腫瘤細胞侵襲和遷移能力有關［12］。研究發(fā)現，S100A6與骨肉瘤和結腸癌腫瘤高侵襲性相關［12］。在急性白血病和肝癌中，S100A6也呈高表達［13］。在NSCLC細胞系A549、NSCLC患者血漿及胸腔積液中，S100A6表達升高［14］。研究顯示，S100A6可能在不同病理類型肺癌中存在差異表達：與純細支氣管肺泡癌組織（bronchioloalveolar carcinoma，BAC）相比，其他類型肺腺癌+BAC混合組織中S100A6表達升高［15］。ISHII等［16］使用免疫組化法分析了92例肺腺癌患者腫瘤組織中S100A6表達情況，結果證實與癌旁組織相比，S100A6在所有腺癌組織中表達升高，而這種表達升高趨勢在含有BAC成分的肺腺癌組織中更明顯。另一項關于S100A6在177例肺鱗癌患者組織中表達情況的分析發(fā)現，S100A6在肺鱗癌組織中存在差異表達，即在部分肺鱗癌組織中存在高表達，而在部分肺鱗癌組織中無高表達，且S100A6表達升高提示患者預后不佳［17］。本研究結果提示，S100A6可起到抑癌作用，而此結論與先前學者在A549中的結論相反［18］。推測S100A6矛盾研究結論的出現與研究選擇的細胞株不同有關，即本研究選用的是未分化人肺癌細胞株，而后者選用的是腺癌細胞株。目前，尚未見S100A6對肺癌細胞株分化方向影響的研究報道，在骨肉瘤中，過表達S100A6被證實可抑制間充質干細胞向成骨細胞方向分化，從而促進腫瘤發(fā)生［19］。

綜上所述，S100A6可抑制人肺癌細胞株Calu-6增殖，但對未分化型肺癌細胞株的分化可能無明顯影響。雖然本研究未出現陽性數據，但本研究首次探討了S100A6對肺癌細胞株分化的影響，仍期待后續(xù)研究納入多種細胞株進一步探索S100A6對肺癌細胞株分化方向的影響。

作者貢獻：王婷進行文章的構思與設計，論文撰寫；牛蔓進行研究的實施與可行性分析，資料收集、整理；張奕進行統計學處理、論文的修訂，負責文章的質量控制及審校，對文章整體負責、監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。