多穗石柯中根皮苷的提取及其功效評價(jià)

張少芹 方一泓 寧夢玲 阮姿姿 吳長機(jī) 盧玉棟*

(1. 福建師范大學(xué) 化學(xué)與材料學(xué)院，福建 福州 350117; 2. 福州力鈞本草生物科技有限公司，福建 福州 350007)

多穗石柯，也被稱為甜茶，英文名為Lithocarpuspolystachyus(Wall.)Rehd，隸屬于殼斗科屬，具有良好的降血脂、抗腫瘤、抗氧化以及抗皮膚過敏等作用，被稱為“樹上蟲草”[1，2]。檢測含有多穗石柯產(chǎn)品的各項(xiàng)成分證明，它的甜味源于其中的根皮苷，大致含量為12.6%。根皮苷隸屬于黃酮類中的二氫查爾酮類物質(zhì)。中國科學(xué)院藥物研究所發(fā)現(xiàn)，根皮苷能在肌體對糖的吸收過程中發(fā)揮作用，具有幫助修復(fù)胰臟分泌胰島素的能力[3-6]。

根皮苷系統(tǒng)命名為1-(2-(B-D-吡喃葡萄糖氧基)-4,6-二羥基苯基)-3-(4-羥基苯基)-丙酮，根皮苷具有許多重要的生物活性，如改善記憶力、降血糖、抗腫瘤、抗過敏等，可很好地應(yīng)用于食品、美容、保健行業(yè)。其易溶于高于80 ℃的熱水，不溶于常溫的水，在乙醇、甲醇、戊醇、丙酮、乙酸乙酯、吡啶、冰醋酸等有機(jī)溶劑中均易溶解，在乙醚、氯仿、苯等有機(jī)溶劑中不溶解[7]。通常在蘋果樹的莖、皮、嫩葉和果實(shí)中發(fā)現(xiàn)有根皮苷的存在，杜鵑花、菊科、豆科、百合科、殼寒科等植物中含有少量的根皮苷[8]。

多穗石柯主要用于醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域，在日化領(lǐng)域應(yīng)用少。研究方向大多為藥理活性等，鮮少在日化領(lǐng)域做深入評價(jià)。本文對多穗石柯中根皮苷進(jìn)行提取，并對多穗石柯根皮苷提取物的體外抗氧化作用、對水分的保濕能力、對酪氨酸酶抑制能力、體外抑制細(xì)菌水平、體外細(xì)胞抗炎能力等開展相關(guān)聯(lián)的測評。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 藥品與儀器

1.1.1 試劑藥品

無水乙醇、十二水合磷酸二氫鈉、二水合磷酸二氫鈉(西隴科學(xué)股份有限公司)，均為分析純;碳酸鉀、甘油(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，均為分析純；營養(yǎng)瓊脂粉(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)；瓊脂條(福建省金燕海洋生物科技股份有限公司)；1,1-二苯基-2-三硝基苯胺(DPPH，武漢卡諾斯科技有限公司，分析純)；硝酸鉀(江蘇銳陽生物科技有限公司)；酪氨酸酶25KU/480(美國worthington)；L-多巴(南京奧多福尼生物科技有限公司)；根皮苷，阿拉丁試劑；多穗石柯購自福建湖南綏寧縣黃桑坪鄉(xiāng)；菌種由福建師范大學(xué)生科院提供。

1.1.2 主要儀器

雙光束紫外可見分光光度TU-1901(上海佑科儀器儀表廠)；細(xì)菌培養(yǎng)箱DHP-9082、霉菌培養(yǎng)箱LRH-500F(上海一恒科技有限公司)；無菌操作臺SW-CJ-1D(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；生物安全柜HFsafo-1200LC(上海力申科學(xué)儀器有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-52AA(臨沂正衡化玻儀器有限公司)。

1.2 多穗石柯根皮苷提取及含量測定

1.2.1 根皮苷的提取

取部分多穗石柯干燥至恒重，用破壁機(jī)破碎成粉末，40目篩過濾，準(zhǔn)確稱量出10.000 0 g，采用1∶20的料液比，加入200 mL 75%的乙醇，通過水回流的方法進(jìn)行2次提取，水浴鍋恒溫75 ℃，提取時(shí)間分別是4 h和3 h。反應(yīng)結(jié)束，把兩次濾液合并后減壓過濾，然后轉(zhuǎn)至旋蒸儀中，減壓下濃縮至原溶液體積的一半，得多穗石柯醇提取物，備用[9]。

1.2.2 多穗石柯固含量的測定

取50.000 0 g的嫩葉濃縮液，設(shè)置旋蒸儀恒溫55 ℃，加熱蒸發(fā)至約為3 mL后，保鮮膜封口，放置于烘箱內(nèi)，至恒重，稱量，計(jì)算得固含量[10]。

1.2.3 多穗石柯中根皮苷含量的測定

(1) 根皮苷標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.4 mg/mL)：準(zhǔn)確稱取根皮苷標(biāo)準(zhǔn)品20 mg，溶于10 mL 75%的乙醇溶液中，快速攪拌溶解，在50 mL容量瓶中用75%的乙醇溶液定容，晃勻備用。

(2) 待測原液(1.0 g/100 mL):準(zhǔn)確稱取多穗石柯濃縮液1.0 g，溶于30 mL 75%的乙醇溶液中，快速攪拌溶解，在100 mL容量瓶中用75%的乙醇溶液定容，晃勻備用。

(3) 準(zhǔn)確吸取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL 根皮苷標(biāo)準(zhǔn)溶液于25 mL的容量瓶中，分別用75%的乙醇定容至刻度，搖勻。此根皮苷的濃度分別為2 mg/250 mL、4 mg/250 mL、6 mg/250 mL、8 mg/250 mL、10 mg/250 mL、12 mg/250 mL、14 mg/250 mL、16 mg/250 mL。調(diào)節(jié)波長為284.6 nm，按濃度由小到大測量吸光度，記錄吸光度，繪制吸光度-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(4) 待測溶液的測定：吸取待測原液2 mL于25 mL 容量瓶中，用75%的乙醇溶液定容至刻度，搖勻。在與標(biāo)準(zhǔn)溶液同樣的條件下測定其吸光度，進(jìn)行三次平行測定，記錄數(shù)據(jù)。

1.3 多穗石柯提取物對酪氨酸酶的抑制研究

1.3.1 溶液的配制

用75%的乙醇配制不同濃度的多穗石柯提取物溶液。

按文獻(xiàn)[11]配制磷酸鹽緩沖鹽溶液(PBS)。

取一管酶總活力25 KU的酪氨酸酶，用pH=6.8的PBS溶液配制成250 mL酶活力為100 U/mL的酪氨酸酶溶液，錫紙包裹，冷藏備用[12]。實(shí)驗(yàn)開始前，將酶放于37.5 ℃恒溫水浴鍋中待用。

在避光的實(shí)驗(yàn)條件下，準(zhǔn)確稱量0.098 6 g L-多巴，用pH=6.8的PBS溶液將其溶解，并配置成250 mL，2.0 mmol/L的L-(左旋)多巴溶液，錫紙包裹低溫存放于冰箱中(現(xiàn)配現(xiàn)用)[12]。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)操作

1.3.2.1 測定酪氨酸酶的活力

準(zhǔn)確量取4 mL 2 mmol/L的L-多巴溶液、1.0 mL PBS溶液和1.0 mL酪氨酸酶溶液，按順序加入試管中，迅速搖勻，轉(zhuǎn)移至玻璃比色皿中，紫外-可見分光光度計(jì)用PBS溶液調(diào)零，設(shè)置波長為475 nm，測定吸光度隨時(shí)間變化的曲線。

1.3.2.2 多穗石柯提取物對酪氨酸酶的抑制作用

取10根試管，各加入4 mL 2 mmol/L的L-多巴溶液和1.0 mL按1.3.1配置的系列濃度的多穗石柯提取物溶液，快速加入1.0 mL酪氨酸酶，搖勻，放置一定時(shí)間至酶活力數(shù)據(jù)穩(wěn)定，設(shè)置波長為475 nm，用PBS溶液對紫外-可見分光光度計(jì)進(jìn)行調(diào)零校準(zhǔn)，記錄其吸光度值。

以475 nm下的吸光度值，計(jì)算多穗石柯提取物溶液對酪氨酸酶活力的抑制率(%)。

上述所提及的A、B、C、D分別表示的是L-多巴溶液、酪氨酸酶溶液、磷酸鹽緩沖液、提取物溶液測定的吸光度。

1.4 多穗石柯根皮苷溶液體外抗氧化評價(jià)

根據(jù)唐健民等[5]的方法測定多穗石柯提取物溶液對DPPH自由基清除力。

準(zhǔn)備8根試管，各加2 mL DPPH溶液，分別添加相同體積不同濃度的多穗石柯提取物溶液，快速加入75%乙醇至溶液體積為6 mL，立刻混勻，靜置30 min，調(diào)節(jié)波長為517 nm，用75%酒精調(diào)零，測得吸光度記錄為A1。

用等量的75%乙醇替代DPPH作為空白對照組，搖晃均勻等待0.5 h，測量吸光度并記錄為A2。

準(zhǔn)確量取DPPH溶液2.0 mL，添入4 mL 75%乙醇，搖晃均勻等待0.5 h，測量吸光度并記錄為A3。

DPPH自由基清除率的計(jì)算公式：

1.5 多穗石柯提取物的對水分保濕效果的評價(jià)

1.5.1 吸濕率的實(shí)驗(yàn)測定

(1) 實(shí)驗(yàn)前一天，于干燥器最底部放50 mL飽和KNO3溶液，保持25 ℃，營造93%相對濕度的實(shí)驗(yàn)狀態(tài)。

(2) 將醫(yī)用膠帶貼在干凈干燥的載玻片上。準(zhǔn)確稱取0.50 g的0.021 6 g/mL多穗石柯醇提物和0.50 g的3%、1%甘油溶液，均勻涂至膠帶上，平行稱量三次，并記錄均值W1。

(3) 在已經(jīng)營造好所需相對濕度的干燥器中間，整齊放置涂抹好的載玻片，2 h后快速取出稱重，平行稱量三次，并記錄均值W2，共耗費(fèi)約6 h。

(4) 樣品的吸濕率計(jì)算公式：

1.5.2 失水率的實(shí)驗(yàn)測定

(1) 用飽和K2CO3溶液代替飽和KNO3溶液，恒溫25 ℃，營造43%相對濕度的實(shí)驗(yàn)狀態(tài)。

(2) 將醫(yī)用膠帶貼在干凈干燥的載玻片上。準(zhǔn)確0.50 g的0.021 6 g/mL多穗石柯提取物和0.50 g的1%、3%甘油溶液，均勻涂至膠帶上，平行稱量三次，并記錄均值M1。

(3) 在已經(jīng)營造好所需相對濕度的干燥器中間，整齊放置涂抹好的載玻片，2 h后快速取出稱重，平行稱重三次，并記錄均值M2，共耗費(fèi)約6 h。

(4) 樣品的失水率計(jì)算公式：

1.6 多穗石柯提取物的體外抑菌評價(jià)

根據(jù)抑菌圈實(shí)驗(yàn)評估多穗石柯提取物及根皮苷標(biāo)準(zhǔn)溶液的體外抑菌能力[13]。

1.7 多穗石柯提取物的細(xì)胞抗炎評價(jià)

把稀釋成一定濃度的多穗石柯提取物和根皮苷標(biāo)準(zhǔn)品加入抗小鼠IL-6單克隆抗體預(yù)包被酶標(biāo)板中，板中IL-6將會和單克隆抗體組合，洗去剩余的未結(jié)合組成；加入生物素化的抗小鼠IL-6抗體，該抗體會和結(jié)合在單抗上的小鼠IL-6相結(jié)合，并生成免疫復(fù)合物，洗去剩余未結(jié)合的組成；添加HRP標(biāo)記過的親合素，二者有特異性結(jié)合發(fā)生，洗去剩余酶結(jié)合物；在顯色劑的作用下，如果孔中含IL-6，HRP會讓沒有顏色的顯色劑呈藍(lán)色；而添入終止液后會變黃。設(shè)置波長450nm，測各孔中溶液的OD值，繪制IL-6 濃度與OD值的曲線，可以發(fā)現(xiàn)二者呈正比，將其作為標(biāo)準(zhǔn)曲線，由此算出待測樣品中的IL-6濃度[14-16]。

2 結(jié)果和討論

2.1 多穗石柯提取物

用乙醇對多穗石柯粉末進(jìn)行提取，得到多穗石柯醇提物溶液。

根皮苷標(biāo)準(zhǔn)溶液不同濃度對吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線公式為y=39.049 79x+0.016 96，根據(jù)提取物的吸光度，計(jì)算得到多穗石柯中根皮苷含量為12.58%。

根據(jù)固含量=(溶液蒸發(fā)后剩余固體質(zhì)量/初始多穗石柯葉片質(zhì)量)×100%，計(jì)算得多穗石柯固含量為46.98%。

2.2 多穗石柯提取物對酪氨酸酶的作用研究

2.2.1 酪氨酸酶酶活力測定曲線

為研究L-多巴和酪氨酸酶互相作用和時(shí)間的關(guān)系，開展空白對照實(shí)驗(yàn)，吸光度與時(shí)間關(guān)系的曲線如圖1。

酶的活力變化與時(shí)間的關(guān)系可以由圖1推導(dǎo)出，其活力顯示緩慢增長的趨勢：0～20 min，曲線迅速增長，20～35 min內(nèi)，曲線增長速度降低，35～40 min，曲線大致變平，故35 min后，方可開始測各體系的吸光度。

圖1 酪氨酸酶酶活力隨時(shí)間變化圖

2.2.2 多穗石柯提取物對酪氨酸酶活力的影響

實(shí)驗(yàn)測試了不同濃度下多穗石柯提取物溶液對酪氨酸酶活力的抑制率，進(jìn)而評價(jià)提取物的美白作用。等待相同的時(shí)間，計(jì)算實(shí)驗(yàn)組和空白組的吸光度值，得出抑制率，進(jìn)而獲得多穗石柯提取物對酪氨酸酶的抑制率曲線(圖2)。

圖2 多穗石柯提取物對酪氨酸酶抑制率曲線

細(xì)胞中黑色素分泌多少的關(guān)鍵取決于酪氨酸酶的狀態(tài)和量，多穗石柯提取物溶液對酪氨酸酶的活性抑制率越高對黑色素的抑制效果越好，從而具備美白能力。從圖2中可以看出，多穗石柯提取物溶液在0.003 2 g/mL～0.003 6 g/mL時(shí)有最大抑制率，約為53.05%。對酪氨酸酶有良好地抑制作用，表明多穗石柯提取物具備良好的美白效果。

2.3 多穗石柯提取物體外抗氧化評價(jià)

當(dāng)自由基過多沉積在人體中，會產(chǎn)生皮膚暗沉、衰老等問題，故化妝品原料評價(jià)的指標(biāo)之一是抗氧化評價(jià)。為評價(jià)多穗石柯提取物的抗氧化能力，測試了多濃度梯度下多穗石柯提取物對DPPH自由基的清除率，得到多穗石柯提取物的自由基清除率曲線(圖3)。

由圖3可知，多穗石柯提取物溶液在濃度為0.000 3 g/mL時(shí)，DPPH自由基的清除率達(dá)83.33%，增大濃度后清除率保持在83～89%區(qū)間。

圖3 多穗石柯提取物對DPPH自由基清除率曲線

多穗石柯中總黃酮類成分含量達(dá)22.2%，具有很好的抗氧化功效。唐健民[5]等運(yùn)用大孔樹脂吸附法對多穗石柯提取物進(jìn)行分離純化，確定了純化后的物質(zhì)對DPPH自由基的清除能力，純化分離后獲得的根皮苷組分清除DPPH能力最強(qiáng)，符合實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.4 多穗石柯提取物的保濕評價(jià)

為探究多穗石柯提取物的保濕效果，實(shí)驗(yàn)測定了相同條件下濃度為0.021 6 g/mL的多穗石柯提取物的吸濕率與失水率，同3%甘油、1%甘油進(jìn)行了對比，多穗石柯提取物與1%甘油、3%甘油吸濕率對比如圖4，多穗石柯提取物與1%甘油、3%甘油失水率對比如圖5。

在濕潤的環(huán)境狀態(tài)中，保濕樣品對鎖水、吸水的效果越好，則表示保濕效果越好，吸濕率也會越高。由圖4可知，濃度為0.021 6 g/mL多穗石柯提取物溶液吸濕率一直高于3%的甘油溶液的吸濕率，2 h后提取物、1%甘油、3%的甘油吸濕率分別為-11.47%、-50.30%，-50.71%，相差將近5倍。4 h后，提取物與1%甘油的兩條曲線之間距離開始減小，8 h后，多穗石柯提取物、1%甘油、3%甘油的吸濕率分別為-84.04%、-91.69、-94.80%，表示提取物與甘油的保濕能力相近。

圖4 1%甘油、3%甘油與多穗石柯提取物吸濕率對比圖

在干燥的環(huán)境中，保濕樣品揮發(fā)到空氣中的水分越少，則保濕作用越好，失水率越低。由圖5可知，濃度為0.021 6 g/mL多穗石柯提取物溶液在2～8 h間的失水率為22.89～73.12%，低于1%甘油和3%甘油溶液的失水率；由此說明在使用后的2～8 h，0.021 6 g/mL的多穗石柯提取物溶液與1%甘油、3%甘油相比保濕效果更好。

圖5 1%甘油、3%甘油與多穗石柯提取物失水率對比圖

2.5 多穗石柯提取物的體外抑菌評價(jià)

為研究多穗石柯提取物的體外抑菌效果，測量了三種菌種在多穗石柯提取物的作用下的抑菌圈大小，獲得多穗石柯提取物的抑菌圈直徑如表1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)溶液和多穗石柯提取物的抑菌圈直徑

根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)WS/T 650—2019抗菌和抑菌效果評價(jià)方法，當(dāng)研究的樣品抑菌圈直徑>7 mm時(shí)，認(rèn)為有抑菌效果；當(dāng)抑菌圈直徑≤7 mm者，認(rèn)為無抑菌效果。表1中多穗石柯提取物在質(zhì)量濃度為4 g/2 500 mL和根皮苷標(biāo)準(zhǔn)溶液在質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL時(shí)，所接種的三種細(xì)菌的抑菌圈都大于7 mm，故認(rèn)為多穗石柯提取物具有良好的體外抑菌能力，在日化領(lǐng)域中可開發(fā)為抑菌劑。

2.6 多穗石柯提取物的細(xì)胞抗炎評價(jià)

經(jīng)實(shí)驗(yàn)對比，根皮苷標(biāo)準(zhǔn)溶液的抗炎因子OD值平均值為0.132，多穗石柯溶液的抗炎因子OD值平均值為2.511?？寡滓蜃覱D值越高，抗炎效果越差，故根皮苷標(biāo)準(zhǔn)溶液的抗炎效果佳；多穗石柯提取液抗炎性能中等。

3 結(jié)論

多穗石柯中根皮苷含量達(dá)12.58%。多穗石柯提取物在濃度為0.003 2 g/mL時(shí)對酪氨酸酶活性的抑制率達(dá)53.05%。多穗石柯提取物在濃度達(dá)0.000 7 g/mL 時(shí)，對DPPH自由基清除率達(dá)89.03%。與1%、3%甘油相比，多穗石柯提取物溶液有不錯(cuò)的保濕能力。多穗石柯提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為15.8 mm，對大腸桿菌的抑菌圈直徑為13.0 mm。對銅綠單孢菌的抑菌圈直徑為9.5 mm，說明多穗石柯提取物溶液對大腸桿菌與金葡球菌有較好的抑制作用。根皮苷標(biāo)準(zhǔn)溶液在濃度為0.4 mg/mL時(shí)抗炎效果較好，其OD值為0.132，多穗石柯提取液在濃度為0.000 4 g/mL時(shí)抗炎性能中等，其OD值為2.511。測試結(jié)果說明多穗石柯提取物具有良好的抗氧化、保濕、美白亮膚、抑菌和抗細(xì)胞炎癥等作用。