齊墩果酸對衰老大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞胰島素/IGF1通路關(guān)鍵基因表達(dá)的影響

李少華牛雙董子怡宋邑誠牛嗣云

(1.河北大學(xué)附屬醫(yī)院 新生兒科,河北 保定 071000;2.河北大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,河北 保定 071000)

老化是機(jī)體在年齡增長過程中表現(xiàn)出的形態(tài)變化、功能衰退和新陳代謝障礙的綜合狀態(tài)[1].男性生殖衰老特點(diǎn)是血漿和睪丸中睪酮水平的持續(xù)性降低、生精小管改變、生精功能低下[2].齊墩果酸是一種天然的五環(huán)三萜,廣泛存在于包括紫荊、女貞子、葡萄和接骨木等近200 多種植物中[3].據(jù)報(bào)道齊墩果酸具有降血脂[4]、保護(hù)肝臟[5]和恢復(fù)睪丸功能[6]等功效,并且齊墩果酸通過其抗炎抗氧化活性發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)性作用[7],但其對男性生殖衰老的影響及可能的分子機(jī)制尚無報(bào)道.胰島素/胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor 1,IGF1)信號(hào)通路調(diào)控著各種細(xì)胞活動(dòng),包括生長、增殖和分化等,在哺乳動(dòng)物性發(fā)育和睪丸功能發(fā)揮中起關(guān)鍵作用[8].本文旨在探討齊墩果酸通過胰島素/IGF1通路延緩男性生殖衰老.

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)用SPF級(jí)Wistar大鼠購自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理中心 (動(dòng)物許可證號(hào)1510063),飼養(yǎng)于河北大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理中心,許可證號(hào):SYXK(冀)2017-002.取4只2月齡雄鼠和2月齡雌鼠合籠,繁殖新生鼠,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn).

1.2睪丸間質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定

17～25 d Wistar大鼠,頸椎脫臼處死,以無菌操作方式取出雙側(cè)睪丸,無菌預(yù)冷PBS中分離脂肪墊和筋膜,保持睪丸的完整性.采用Ⅰ型膠原酶處理睪丸以獲得生精小管周圍的間質(zhì)細(xì)胞.將細(xì)胞培養(yǎng)在含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清(Biological Industries,以色列)的DMEM/F12培養(yǎng)液(Gibco,美國)中,以1×107/m L的密度鋪勻,1 h后換液.然后進(jìn)行細(xì)胞鑒定,即加入3β-羥類固醇脫氫酶,灰色為鑒定成功[9].融合度到達(dá)80%左右時(shí),按照第1代和第2代1∶2比例傳代,傳到第3代以后,鋪于6孔板內(nèi),密度為1×106/m L,培養(yǎng)2 d后備用.

1.3 MTT確定齊墩果酸作用最適濃度及時(shí)間

將齊墩果酸(成都植標(biāo)化有限公司,中國)溶于無血培養(yǎng)基中,其終濃度設(shè)定為0、20、40、60、80μmol/L,作用時(shí)間設(shè)定為24、48、72 h,分別作用于已培養(yǎng)了2 d的睪丸間質(zhì)細(xì)胞,用酶標(biāo)儀檢測不同組的吸光度,計(jì)算細(xì)胞活力,選定細(xì)胞活力最佳組的作用濃度及作用時(shí)間.

細(xì)胞活力=Ai/A0,其中,Ai為各組吸光度;A0為對照組吸光度.

1.4 細(xì)胞衰老模型建立及分組

氧化應(yīng)激創(chuàng)建細(xì)胞衰老模型,將其分為正常組、衰老組和齊墩果酸組.處理方式見表1.

1.5 β-半乳糖苷酶染色

將各組細(xì)胞移除其培養(yǎng)液,預(yù)冷PBS清洗2次.β-半乳糖苷酶試劑盒(碧云天,中國)染色,藍(lán)綠色的細(xì)胞質(zhì)為陽性細(xì)胞.顯微鏡(200倍)觀察,記錄其數(shù)目,每組觀察10個(gè)視野,計(jì)算平均陽性率.重復(fù)3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn).

1.6 胰島素/IGF1信號(hào)通路關(guān)鍵基因INSR、IRS 1、IRS 2、IGF 1和IGFBP 3的表達(dá)情況

1.6.1 RT-qPCR

1.6.2 免疫熒光

將所有組細(xì)胞去除其培養(yǎng)液,PBS清洗2次.常溫,體積分?jǐn)?shù)為4%的Paraformaldehyde固定30 min.常溫,體積分?jǐn)?shù)為0.5%的Trition X-100(Sigma, 美國)通透20 min,預(yù)冷PBS清洗2次.常溫,質(zhì)量濃度為50 g/L的完達(dá)山奶粉溶液封閉45 min.4℃,加入INSR、IRS1、IRS2、IGF1和IGFBP3(Santa Cruz,美國)一抗過夜.次日,PBS洗5次.37℃,加入二抗(Abways,中國)孵育30 min,PBS洗5次.封片.各組爬片3張,熒光顯微鏡觀察,隨機(jī)選取10個(gè)視野,重復(fù)3次,Image J軟件計(jì)算各組圖片光密度.

1.6.3 免疫印跡

將各組細(xì)胞移除其培養(yǎng)液,加入含PMSF(體積比為1∶100)的RIPA 裂解液,BSA 法測定各組蛋白濃度.統(tǒng)一取60μg細(xì)胞蛋白裂解物,SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜.常溫,質(zhì)量濃度為50 g/L的完達(dá)山奶粉溶液封閉0.5 h.4℃,加入INSR、IRS1、IRS2、IGF1、IGFBP3(Proteintech,中國)和β-actin(Proteintech,中國)的一抗孵育過夜.次日,PBS-T 洗膜5次.常溫,加入抗兔二抗(Proteintech,中國)孵育2 h,PBS-T 沖洗5次.將膜和發(fā)光液接觸后,顯影.生物學(xué)重復(fù)3次,Image J軟件計(jì)算條帶灰度值,內(nèi)參為β-actin.

1.7 齊墩果酸對睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡率的影響

1.7.1 INSR 抑制劑最適作用濃度及時(shí)間的確定

衰老組細(xì)胞加入BMS-754807(MedChem Express 公司,美國),最終濃度設(shè)定為2.5、5、10μmol/L,作用時(shí)間設(shè)定為24、48、72 h,然后檢測胰島素/IGF1信號(hào)通路下游基因Bcl-2(引物序列見表2)的轉(zhuǎn)錄情況,確定抑制劑的最適濃度及作用時(shí)間.

表2 基因引物序列Tab.2 Gene primer sequences

1.7.2 流式細(xì)胞術(shù)對細(xì)胞凋亡率的檢測

衰老組和齊墩果酸組處理方法見表1,INSR 抑制劑組是在齊墩果酸組的基礎(chǔ)上加入終濃度為5μmol/L的INSR 抑制劑,作用24 h后去除.凋亡檢測試劑盒(Vazyme公司,中國)染色,流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞的凋亡率,生物學(xué)重復(fù)3次.

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.先進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn),后進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn),兩兩比較,齊則采用最小顯著差法,不齊則采用Dunnett′s t3檢驗(yàn),P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 齊墩果酸最佳作用濃度及時(shí)間的確定

MTT 結(jié)果顯示,齊墩果酸作用24 h,不同濃度處理組的細(xì)胞活力無明顯差異,且各處理組細(xì)胞活力較低;作用48 h,細(xì)胞活力隨齊墩果酸濃度的增加而下降;作用72 h,20μmol/L 齊墩果酸處理組細(xì)胞活力最高,總體比較,齊墩果酸作用濃度及作用時(shí)間確定為20μmol/L,72 h(圖1).

圖1 不同濃度的齊墩果酸對睪丸間質(zhì)細(xì)胞活力的影響Fig.1 Effects of oleanolic acid of different concentration on cellular activity of leydig cells

2.2 睪丸間質(zhì)細(xì)胞衰老模型的鑒定

β-半乳糖苷酶經(jīng)染色后陽性細(xì)胞質(zhì)呈青綠色,結(jié)果表明,與正常組相比,衰老組中細(xì)胞質(zhì)青綠色非常明顯,經(jīng)統(tǒng)計(jì),陽性細(xì)胞即衰老細(xì)胞在60%以上(P＜0.05)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2).

圖2 β-半乳糖苷酶染色結(jié)果Fig.2 Results ofβ-galactosidase staining

2.3 齊墩果酸對睪丸間質(zhì)細(xì)胞胰島素/IGF1通路關(guān)鍵基因表達(dá)的影響

2.3.1 齊墩果酸對INSR、IRS1、IRS2、IGF1和IGFBP3的m RNA 轉(zhuǎn)錄水平的影響

衰老組中INSR、IRS1、IRS2和IGF1的m RNA 轉(zhuǎn)錄水平比正常組顯著降低 (P＜0.05),IGFBP3轉(zhuǎn)錄水平顯著升高 (P＜0.05).齊墩果酸組能明顯提高衰老細(xì)胞中INSR、IRS1、IRS2和IGF1的mRNA 轉(zhuǎn)錄,降低IGFBP3的m RNA 轉(zhuǎn)錄(P＜0.05)(圖3).

圖3 睪丸間質(zhì)細(xì)胞中INSR、IRS 1、IRS 2、IGF 1和IGFBP 3的mRNA轉(zhuǎn)錄水平Fig.3 mRNA transcription levels of INSR,IRS1,IRS2,IGF 1 and IGFBP 3 in leydig cells

2.3.2 齊墩果酸對INSR、IRS1、IRS2和IGF1的蛋白翻譯水平的影響

免疫熒光結(jié)果顯示,發(fā)紅色熒光的為陽性產(chǎn)物(圖4a).睪丸間質(zhì)細(xì)胞衰老組INSR、IRS1、IRS2、IGF1的平均吸光度(OD)值比正常組有所減少(P＜0.05),IGFBP3無熒光未展示.齊墩果酸組INSR、IRS1、IGF1的平均OD 值比衰老組有所增加(P＜0.05)(圖4b).INSR、IRS1、IRS2和IGF1的免疫印跡趨勢與免疫熒光結(jié)果一致(圖4c-d).間質(zhì)細(xì)胞能夠分泌IGFBP3,但不表達(dá)IGFBP3蛋白,這表明,間質(zhì)細(xì)胞分泌的IGFBP3可能主要作用于支持細(xì)胞和生精細(xì)胞.

圖4 睪丸間質(zhì)細(xì)胞中INSR、IRS1、IRS2和IGF1的蛋白表達(dá)情況Fig.4 Protein expression of INSR,IRS1,IRS2 and IGF1 in leydig cells

2.4 齊墩果酸對睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響

2.4.1 胰島素/IGF1通路受體抑制劑BMS-754807最適作用濃度及時(shí)間的確定

抗凋亡基因Bcl-2為胰島素/IGF1的下游靶基因,抑制通路蛋白可抑制Bcl-2的表達(dá),通過RT-qPCR 檢測Bcl-2的轉(zhuǎn)錄情況來確定抑制劑的最佳作用濃度及時(shí)間.研究結(jié)果顯示,抑制劑的作用濃度為5μmol/L,作用時(shí)間為24 h,此時(shí)Bcl-2的轉(zhuǎn)錄水平明顯低于對照組(P＜0.01)(圖5).

圖5 不同濃度抑制劑BMS-754807處理后睪丸間質(zhì)細(xì)胞中Bcl-2 mRNA的轉(zhuǎn)錄情況Fig.5 Transcription of Bcl-2 mRNA in leydig cells after treatment with different concentrations of inhibitors

2.4.2 齊墩果酸對衰老的睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響

檢測衰老組、齊墩果酸組和抑制劑組睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡率,結(jié)果顯示齊墩果酸能明顯降低衰老組睪丸間質(zhì)細(xì)胞的凋亡率(P＜0.05);加入INSR 抑制劑后,細(xì)胞的凋亡率有所增加(P＜0.05),表明齊墩果酸可能是通過激活I(lǐng)NSR 來減少衰老細(xì)胞的凋亡率(圖6).

圖6 齊墩果酸對衰老誘導(dǎo)的睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響Fig.6 Effect of oleanolic acid on the apoptosis of leydig cells

3 討論

本研究引入了胰島素受體特異性抑制劑BMS-754807,將細(xì)胞分為了衰老組、齊墩果酸組和抑制劑組.流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,齊墩果酸明顯降低衰老后的睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡率,添加抑制劑后能阻斷此現(xiàn)象的發(fā)生,表明齊墩果酸可能是通過激活I(lǐng)NSR 來減少衰老細(xì)胞的凋亡率.

綜上可知,齊墩果酸調(diào)節(jié)胰島素/IGF1通路關(guān)鍵基因表達(dá),激活I(lǐng)NSR 降低衰老睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡率,延緩睪丸間質(zhì)細(xì)胞衰老.齊墩果酸在體內(nèi)延緩衰老的作用還需要進(jìn)一步探究,但此研究結(jié)果為齊墩果酸延緩男性生殖衰老奠定了理論基礎(chǔ).