大蒜心腐病菌室內(nèi)防治藥劑篩選

趙永強(qiáng).楊峰.陸信娟.劉燦玉.張碧薇.楊青青.葛潔.史新敏.樊繼德

（江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 徐州 221121）

大蒜（L.）是一種重要的調(diào)味類蔬菜，同時(shí)也是一種具有保健功能的特殊食品，深受我國(guó)消費(fèi)者歡迎。目前，我國(guó)大蒜產(chǎn)區(qū)主要集中在山東省、江蘇省和河南省，種植面積逐漸擴(kuò)大。近年來(lái)隨著大蒜種植收益的提高，我國(guó)大蒜主產(chǎn)區(qū)連種年限逐漸延長(zhǎng)，各種病蟲(chóng)害發(fā)生日益嚴(yán)重，特別是大蒜心腐病的為害逐年加重，嚴(yán)重影響大蒜產(chǎn)量和品質(zhì)。

大蒜心腐病是一種由細(xì)菌侵染引起的病害，2002年首先在江蘇鹽城、太倉(cāng)的大蒜田發(fā)現(xiàn)，并由胡白石等人將其病原細(xì)菌鑒定并暫命名為熒光假單胞菌蔥屬致病變種（pv.Hu et Xu）。大蒜受到該病菌侵染后表現(xiàn)為生理性失調(diào)，植株生長(zhǎng)受挫、畸形，葉片自葉尖向里變紅褐色。病菌首先感染莖盤(pán)基部，產(chǎn)生褐色病斑，病斑逐漸向上擴(kuò)展到葉片組織，導(dǎo)致莖盤(pán)和假莖由內(nèi)而外腐爛，并散發(fā)出魚(yú)腥味惡臭。

目前，大蒜心腐病僅在我國(guó)報(bào)道發(fā)生，受關(guān)注較少，且尚未有關(guān)于該病害防控技術(shù)方面的研究報(bào)道。為了促進(jìn)對(duì)大蒜心腐病防控技術(shù)的研究，本團(tuán)隊(duì)選擇了抗生素類、噻二唑類和有機(jī)銅類等三類殺菌劑中對(duì)細(xì)菌性病害有防治效果的藥劑14種，進(jìn)行大蒜心腐病菌室內(nèi)防治藥劑篩選，以期為大蒜心腐病菌的有效防控提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試大蒜心腐病菌菌株由本實(shí)驗(yàn)室分離并保存，該菌株分離于江蘇省邳州市宿羊山鎮(zhèn)大蒜心腐病典型癥狀植株，采集日期為2019年3月27日，菌株經(jīng)過(guò)3次單菌落純化、致病性驗(yàn)證和16S序列比對(duì)。

1.2 供試藥劑

選取了三類市售的細(xì)菌性殺菌劑共計(jì)14種，包括（1）抗生素類殺菌劑：0.3%四霉素水劑（遼寧微科生物工程有限公司）、3%中生菌素可濕性粉劑（深圳諾普信農(nóng)化股份有限公司）、2%春雷霉素水劑（日本北興化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社）、8%寧南霉素水劑（德強(qiáng)生物股份有限公司）、72%農(nóng)用鏈霉素可濕性粉劑（成都普惠生物工程有限公司）；（2）噻二唑類殺菌劑：30%噻唑鋅懸浮劑（浙江新農(nóng)化工股份有限公司）、60%葉枯唑粉劑（北美農(nóng)大集團(tuán)）；（3）有機(jī)銅類殺菌劑：30%壬菌銅微乳劑（西安近代科技實(shí)業(yè)有限公司）、15%絡(luò)氨銅水劑（天津博克百勝科技有限公司）、30%琥膠肥酸銅可濕性粉劑（齊齊哈爾四友化工有限公司）、23%松脂酸銅乳油（山東禾宜生物科技有限公司）、20%噻菌銅懸浮劑（浙江龍灣化工有限公司）、33.5%喹啉銅懸浮劑［興農(nóng)藥業(yè)（中國(guó)）有限公司］、20%噻森銅懸浮劑（浙江東風(fēng)化工有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 供試菌株準(zhǔn)備

于試驗(yàn)前1 d將大蒜心腐病菌接種到LB液體培養(yǎng)基，置于恒溫?fù)u床28℃活化12 h左右。用無(wú)菌水調(diào)配菌液濃度為1×10CFU/mL。

1.3.2 藥劑配制

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，用LB液體培養(yǎng)基配制各參試藥劑高濃度母液（按照各藥劑活性成分計(jì)算）：8%寧南霉素水劑、23%松脂酸銅乳油、72%農(nóng)用鏈霉素可濕性粉劑、20%噻森銅懸浮劑、33.5%喹啉銅懸浮劑、20%噻菌銅懸浮劑51200 mg/L，0.3%四霉素水劑、3%中生菌素可濕性粉劑、2%春雷霉素水劑、30%噻唑鋅懸浮劑、60%葉枯唑粉劑、30%琥膠肥酸銅可濕性粉劑、30%壬菌銅微乳劑、15%絡(luò)氨銅水劑1600 mg/L。

1.3.3 參試藥劑對(duì)大蒜心腐病菌最低有效抑菌濃度（MIC）測(cè)定

參試藥劑MIC的測(cè)定采用含毒介質(zhì)法：將500 μL大蒜心腐病菌懸液加入到20 mL LB液體培養(yǎng)基中，搖勻。取滅菌細(xì)胞培養(yǎng)板，每個(gè)孔內(nèi)加入上述LB液體培養(yǎng)基200 μL。將200 μL高濃度藥劑母液加入細(xì)胞培養(yǎng)板A排孔內(nèi)，混勻，按比例吸取混合后的藥液加入B排孔，依次操作到G排孔為止。將H排孔設(shè)置為空白對(duì)照，加入等量無(wú)菌LB液體培養(yǎng)基，混勻。棄掉各孔內(nèi)多余混合液，使各個(gè)孔內(nèi)的混合液體積保留200 μL，各藥劑設(shè)3次重復(fù)。將細(xì)胞培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內(nèi)28℃恒溫培養(yǎng)，待空白對(duì)照混合液出現(xiàn)渾濁，將各孔混合液再次混勻后，吸取20 μL加入到新的滅菌培養(yǎng)板對(duì)應(yīng)孔內(nèi)，孔內(nèi)預(yù)先加入180 μL無(wú)菌LB液體培養(yǎng)基，重新置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待空白對(duì)照混合液再次出現(xiàn)渾濁，觀察比較結(jié)果。

1.3.4 活性藥劑對(duì)大蒜心腐病菌抑菌效果測(cè)定

根據(jù)MIC值測(cè)定結(jié)果，選取對(duì)大蒜心腐病菌有抑菌活性的藥劑，采用抑菌圈法測(cè)定其抑菌效果。選取藥劑的參試濃度設(shè)置為：0.3%四霉素水劑200 mg/L、100 mg/L、50 mg/L、25 mg/L、12.5 mg/L；3%中生菌素可濕性粉劑600 mg/L、400 mg/L、200 mg/L、100 mg/L、50 mg/L；2% 春 雷 霉 素水劑800 mg/L、600 mg/L、400 mg/L、200 mg/L、100 mg/L；30% 噻唑鋅懸浮劑、15%絡(luò)氨銅水劑、60%葉枯唑粉劑、30%壬菌銅微乳劑、30%琥膠肥酸銅可濕性粉劑2400 mg/L、2000 mg/L、1600 mg/L、1200 mg/L、800 mg/L；23%松脂酸銅乳油16000 mg/L、12800 mg/L、9600 mg/L、6400 mg/L、3200 mg/L；8%寧南霉素水劑22400 mg/L、19200 mg/L、16000 mg/L、12800 mg/L、9600 mg/L。藥劑用無(wú)菌水稀釋。

1.3.5 盆栽驗(yàn)證四霉素水劑對(duì)大蒜心腐病的防治效果

選擇四霉素水劑進(jìn)行盆栽防治試驗(yàn)，用量參照花生拌種推薦濃度160 mL·100 kg種子。選擇大蒜品種“徐蒜6號(hào)”為參試品種，挑選大小較為一致的蒜瓣，清水浸泡約15 h，取出瀝干水分，四霉素藥劑拌種，清水作為對(duì)照，處理后蒜瓣種植于花盆中，每盆均勻播種20個(gè)，每處理各栽種6盆。蒜瓣覆土前，各澆施菌懸液1 mL?；ㄅ柚糜谌斯夂蚴?6℃、12 h/12 h光暗交替培養(yǎng)，分別于栽種后12 d和36 d按植株病情分級(jí)記錄心腐病發(fā)生情況，計(jì)算病情指數(shù)及防治效果。

大蒜植株心腐病發(fā)病情況調(diào)查時(shí)，橫向切去大蒜植株莖盤(pán)底部1～2 mm，按照莖盤(pán)基部剖面病斑面積占剖面總面積的百分比將病情分為5級(jí)。

0級(jí)：莖盤(pán)剖面無(wú)病斑；

1級(jí)：莖盤(pán)剖面病斑面積＜25%；

3級(jí)：25%≤莖盤(pán)剖面病斑面積＜50%；

5級(jí)：50%≤莖盤(pán)剖面病斑面積＜75%；

7級(jí)：莖盤(pán)剖面病斑面積≥75%。

病情指數(shù)計(jì)算公式為：

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)的整理與分析采用軟件 Microsoft Office Excel 2007 完成 。

2 結(jié)果與分析

2.1 參試藥劑對(duì)大蒜心腐病菌最低有效抑菌濃度（MIC）

參試藥劑對(duì)大蒜心腐病菌MIC測(cè)定結(jié)果如表1所示，供試的14種藥劑中0.3%四霉素水劑、3%中生菌素可濕性粉劑、2%春雷霉素水劑、30%噻唑鋅懸浮劑、30%壬菌銅微乳劑、15%絡(luò)氨銅水劑、30%琥膠肥酸銅可濕性粉劑、60%葉枯唑粉劑、23%松脂酸銅乳油、8%寧南霉素水劑等10種藥劑在參試濃度范圍內(nèi)對(duì)大蒜心腐病菌有抑制效果。其中，抑菌活性最高的是0.3%四霉素水劑、3%中生菌素可濕性粉劑和2%春雷霉素水劑，MIC分別為0.20 mg/L、50.00 mg/L和100.00 mg/L。20%噻菌銅懸浮劑、72%農(nóng)用鏈霉素可濕性粉劑、33.5%喹啉銅懸浮劑、20%噻森銅懸浮劑等4種藥劑在有效成分濃度25600.00 mg/L時(shí)仍無(wú)抑菌效果。

表1 參試藥劑對(duì)大蒜心腐病菌MIC測(cè)定結(jié)果

2.2 活性藥劑對(duì)大蒜心腐病菌的抑菌效果

上述10種活性藥劑對(duì)大蒜心腐病菌的抑菌效果測(cè)定表明，在參試濃度范圍內(nèi)僅0.3%四霉素水劑產(chǎn)生抑菌圈，且經(jīng)3次重復(fù)驗(yàn)證均得到相同的結(jié)果。0.3%四霉素水劑200 mg/L、100 mg/L、50 mg/L、25 mg/L、12.5 mg/L處理產(chǎn)生的抑菌圈直徑平均為2.26 cm、1.93 cm、1.35 cm、0.82 cm、0.44 cm。 以藥劑濃度的對(duì)數(shù)為自變量，抑菌圈的平均直徑為因變量，求出毒力回歸方程為=0.6853-1.3208，=0.9926。

2.3 四霉素對(duì)大蒜心腐病的盆栽防治效果

四霉素水劑拌種對(duì)大蒜心腐病的防治效果如表2所示，四霉素水劑按照160 mL·100 kg大蒜種子的用量拌種，可以有效降低大蒜心腐病的發(fā)生，處理后12 d防治效果可達(dá)65.59%，但是隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，其防治效果逐漸降低，處理后36 d的防治效果降為43.41%，降幅為33.82%。

表2 四霉素水劑拌種對(duì)大蒜心腐病的防治效果

3 討論與結(jié)論

山東省、河南省和江蘇省是我國(guó)大蒜三大優(yōu)勢(shì)產(chǎn)區(qū)，近年來(lái)三大主產(chǎn)區(qū)大蒜苗期“死苗”現(xiàn)象越來(lái)越嚴(yán)重，嚴(yán)重地塊死苗率可達(dá)30%、感染率達(dá)到80%以上，給大蒜生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失。根據(jù)本團(tuán)隊(duì)多年實(shí)地調(diào)查與研究發(fā)現(xiàn)，大蒜“死苗”現(xiàn)象主要是由細(xì)菌性病害大蒜心腐病和蟲(chóng)害蒜蛆、刺足根螨單獨(dú)或共同為害引起。

本研究根據(jù)細(xì)菌性病害防治藥劑類型特征，從抗生素類、噻二唑類和有機(jī)銅類等三類殺菌劑中選擇對(duì)細(xì)菌性病害有防治效果的藥劑14種，依次通過(guò)測(cè)定最低有效抑菌濃度、抑菌效果、盆栽防治效果等室內(nèi)藥劑篩選方法，確定四霉素水劑對(duì)大蒜心腐病菌具有較高的抑菌活性，并且盆栽條件下對(duì)大蒜心腐病也有較好的防治效果，可用于大蒜心腐病的防治。

雖然本研究結(jié)果表明，除四霉素水劑外其余13種藥劑對(duì)大蒜心腐病菌的抑制效果較差，但是由于各藥劑的作用機(jī)理不同，如噻菌銅懸乳劑等有機(jī)銅類殺菌劑并非直接作用于病原菌，在抑菌方面表現(xiàn)較差，但可能在大田有較好的防治效果。因此，需要通過(guò)更廣泛的盆栽或田間試驗(yàn)，以進(jìn)一步篩選大蒜心腐病適用藥劑，從而可以輪換或復(fù)配使用，以達(dá)到提高防治效果和延緩抗藥性產(chǎn)生的目的。