飼料中添加膽酸鈉對(duì)大口黑鱸生長(zhǎng)及糖代謝的影響

丁斐斐 周楠楠 張 樂(lè) 喬 芳 杜震宇 張美玲

(華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 水生動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與環(huán)境健康實(shí)驗(yàn)室, 上海 200241)

膽汁酸(Bile acids, BAs)是生物體在肝中以膽固醇為前體合成并在膽囊中儲(chǔ)存的黃綠色混合物。在生理?xiàng)l件下, 膽汁酸以鹽形式存在, 具有多種生理功能[1]。此外, 膽汁酸還可影響腸道微生物的定植和組成, 從而影響機(jī)體代謝[2]。目前, 膽汁酸作為飼料添加劑在魚類的生長(zhǎng)性能[3—7]、抗氧化能力[6,8,9]、免疫功能[6,9]、脂代謝[10—12]及腸道菌群組成變化[13,14]中的作用已受到廣泛關(guān)注, 但在魚類的糖代謝方面[7]的研究鮮少見(jiàn)報(bào)道。已知在哺乳動(dòng)物中, 膽汁酸可參與調(diào)節(jié)生物體的糖代謝穩(wěn)態(tài), 例如,膽酸-7-硫酸 (Cholic acid-7-sulfate, CA7S)可降低肥胖小鼠(Mus musculus)的血糖含量[15]; 6α位羥基膽汁酸可顯著提高豬(Sus scrofa)的糖耐受能力[16], 并且研究發(fā)現(xiàn), 腸道菌群的組成變化也會(huì)影響生物體的糖代謝。例如, 二甲雙胍可通過(guò)改變腸道菌群中脆弱擬桿菌的豐度從而改變膽汁酸譜, 最終改善小鼠2型糖尿病[17]。在水產(chǎn)動(dòng)物中, 對(duì)魚類糖代謝的研究?jī)H見(jiàn)于飼料中添加混合膽汁酸可抑制大口黑鱸(Micropterus salmoides)的肝臟糖異生[7], 膽汁酸對(duì)魚類糖代謝改變的具體機(jī)制的探究還較為有限。

目前, 水產(chǎn)上常用的膽汁酸添加劑主要是豬脫氧膽酸(Hyodeoxycholic acid, HDCA)、豬膽酸(Hyocholic acid, HCA)和鵝脫氧膽酸(Chenodeoxycholic acid, CDCA)的混合物[3,7,14]。高等動(dòng)物中的研究已經(jīng)表明不同膽汁酸可能具有不同的功能, 例如,僅膽酸-7-硫酸可通過(guò)G蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體(Takeda G protein-coupled receptor 5, TGR5)依賴性方式降低肥胖小鼠的血糖[15]; 豬中一類6α位羥基的膽汁酸能提高豬的糖耐受能力[16], 表明系統(tǒng)評(píng)估單一膽汁酸的作用效果非常重要。在水產(chǎn)上, 已有部分研究揭示在飼料中添加單一膽汁酸對(duì)水生動(dòng)物的作用效果, 如7-脫氧膽酸(7-Deoxycholic acid, 7-DCA)可以增強(qiáng)生長(zhǎng)激素對(duì)鯉(Cyprinus carpio)的促生長(zhǎng)作用[18]; ?；鞘懰徕c(Sodium taurolithocholate,TLCAS)可以改變草魚(Ctenopharyngodon idella)肝轉(zhuǎn)錄組和腸道菌群的組成[19]。然而, 也有研究發(fā)現(xiàn)膳食補(bǔ)充?；悄懰徕c(Sodium taurocholate, TCAS)并不能改善大西洋鮭(Salmo salar)的生長(zhǎng)、營(yíng)養(yǎng)代謝和腸道炎癥[20], 這說(shuō)明不同類型的膽汁酸對(duì)魚體生長(zhǎng)和生理代謝的調(diào)控作用并不相同。目前的研究表明大部分魚類中主要的膽汁酸種類為膽酸、鵝脫氧膽酸和牛磺膽酸[21—24], 膽酸作為魚類中最豐富的膽汁酸之一, 對(duì)魚類的生長(zhǎng)和代謝調(diào)節(jié)作用尚不明確。

魚類尤其是肉食性魚類, 對(duì)碳水化合物的代謝能力有限。大口黑鱸是一種典型的肉食性魚類, 對(duì)碳水化合物的利用能力較差。在對(duì)大口黑鱸的研究中, 以生長(zhǎng)和抗氧化性能為評(píng)價(jià)指標(biāo), 通過(guò)折線回歸模型獲得大口黑鱸飼料中混合膽汁酸最適添加量分別為440.5、283.3和253.8 mg/kg。方差分析和后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在飼料中添加300 mg/kg膽汁酸對(duì)大口黑鱸的生長(zhǎng)、抗氧化和肪代謝等功能具有最佳的調(diào)節(jié)能力[5]。隨后, 研究發(fā)現(xiàn)日糧添加350 mg/kg的混合膽汁酸可以有效改善高淀粉飼料飼喂下大口黑鱸幼魚的生長(zhǎng)性能, 增強(qiáng)肝功能和免疫能力,并減少其應(yīng)激反應(yīng)[6]。另一項(xiàng)研究表明, 300 mg/kg混合膽汁酸(8.0%豬膽酸、70.9%豬脫氧膽酸和20.2%鵝脫氧膽酸)可有效緩解由高淀粉飲食引起的大口黑鱸的低增重率, 并可以通過(guò)抑制肝脂合成和肝臟糖異生改善高淀粉飲食引起的肝纖維化[7]。以上研究顯示, 飼喂大口黑鱸的膽汁酸最適添加量約為300 mg/kg。因此本實(shí)驗(yàn)以300 mg/kg的膽酸鈉作為飼料添加劑, 測(cè)定大口黑鱸的生長(zhǎng)性能、腸道菌群和糖代謝指標(biāo), 為膽酸鈉在飼料中的合理應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)飼料

參考已有研究[5—7]基礎(chǔ)確定大口黑鱸的營(yíng)養(yǎng)需求, 以進(jìn)口魚粉、豆粕和雞肉粉為主要蛋白源,豆油為主要脂肪源, 面粉、谷朊粉和木薯淀粉為糖源配制了2種實(shí)驗(yàn)飼料, 實(shí)驗(yàn)用膽酸鈉(來(lái)源于牛或羊膽汁, ≥99%)購(gòu)自Sigma-aldrich(上海)貿(mào)易有限公司, 在2種飼料中的添加量分別為0和300 mg/kg。將飼料原料用粉碎機(jī)粉碎并過(guò)60目篩網(wǎng), 準(zhǔn)確稱量后按照逐級(jí)放大法充分混勻, 然后加入油脂和水混合揉勻, 制成粒徑為3 mm的顆粒餌料, 自然風(fēng)干至水分低于10%, 自封袋包裝后放于?20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩＞唧w飼料原料與營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)表 1。

表1 實(shí)驗(yàn)飼料組成和營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Tab. 1 Experimental diet composition and nutritional levels (airdried basis)

1.2 飼養(yǎng)管理

實(shí)驗(yàn)用大口黑鱸的魚苗從廣州市添發(fā)魚苗發(fā)展有限公司購(gòu)買, 養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)在華東師范大學(xué)水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖基地進(jìn)行。在養(yǎng)殖系統(tǒng)中用購(gòu)自無(wú)錫通威生物科技有限公司的商品飼料馴化魚苗, 1個(gè)月后開始正式實(shí)驗(yàn)。正式實(shí)驗(yàn)分成兩組, 每組設(shè)置3個(gè)平行。魚苗禁食24h后開始分選。將隨機(jī)挑選的狀態(tài)良好的魚苗(10.7±0.2) g以每缸30尾的規(guī)格均勻分配到6個(gè)養(yǎng)殖缸中, 養(yǎng)殖缸的位置隨機(jī)排列。兩組實(shí)驗(yàn)分別飼喂添加有0和300 mg/kg膽酸鈉的配合飼料共8周, 每日按魚苗體重的4%(飽食投喂)分別在8:00和16:00各投喂1次, 每2周稱一次體質(zhì)量以調(diào)整飼料投喂量。實(shí)驗(yàn)期間養(yǎng)殖水源為充分曝氣的自來(lái)水, 水溫26.0℃左右, 溶氧量6.0 mg/L左右,pH 7.0—8.0。

1.3 樣品采集

大口黑鱸8周養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束后禁食12h。依次將各個(gè)缸中的大口黑鱸撈出, 使用20 mg/L的MS-222麻醉劑麻醉后稱重。每缸隨機(jī)選取12尾魚, 使用1 mL的無(wú)菌注射器尾靜脈采集血液, 4℃靜置過(guò)夜, 3000 r/min離心10min, 取上層血清于1.5 mL離心管中并儲(chǔ)存在?80℃冰箱中待測(cè)。測(cè)定隨機(jī)選取的12尾魚的體長(zhǎng)、體質(zhì)量、內(nèi)臟團(tuán)、肝和腹部脂肪重, 去頭和去鰭后精確稱量軀殼重, 用于生長(zhǎng)指標(biāo)分析。用75%酒精擦拭消毒魚體體表后, 在無(wú)菌操作條件下收集新鮮的肌肉、肝、腸組織和腸道內(nèi)容物, 儲(chǔ)存在?80℃冰箱中待測(cè)。取1/3新鮮的肝和肌肉固定在4%的多聚甲醛中, 用于制備高碘酸希夫氏(Periodic acid-schiff stain, PAS)染色法的糖原染色切片。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組預(yù)留6尾魚用于全魚水分、粗脂肪、粗蛋白和粗灰分的測(cè)定。

大口黑鱸飼養(yǎng)8周后的增重率、肥滿度、軀殼比、臟體比、肝體比和脂體比的計(jì)算如下:

式中,Wt為終末體重(g),W0為初始體重(g),L為魚體長(zhǎng)(cm),Wd為魚頭重(g),Ws為魚鰭重(g),Wv為魚內(nèi)臟重(g),Wh為魚肝重(g),Wm為魚腹腔脂肪重(g),W為魚體重(g)。

每組實(shí)驗(yàn)取6尾魚檢測(cè)全魚體成分, 2組飼料做2個(gè)技術(shù)重復(fù)檢測(cè)飼料組成。全魚和飼料粗蛋白采用凱氏定氮法(FOSS Kjeltec 8200)測(cè)定, 全魚和飼料粗脂肪采用氯仿-甲醇法(FOSS Soxtec 2055), 全魚水分在105℃下烘干至恒重(24h)檢測(cè), 全魚灰分用馬弗爐灼燒法在550℃下灼燒14h測(cè)定。以上檢測(cè)均按照國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)法AOAC(1995)[25]。

大口黑鱸的肝和肌肉組織用4%多聚甲醛固定24h, 脫水后用石蠟包埋, 切成6 μm薄的切片。PAS染色法染色, 在尼康顯微鏡(Nikon Eclipse TS100)下對(duì)染色切片進(jìn)行分析。

每組12條魚的糖原和血糖的檢測(cè)均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的相關(guān)試劑盒測(cè)定, 每組實(shí)驗(yàn)隨機(jī)選擇3個(gè)樣本檢測(cè)肝和肌肉的糖原合成酶(Glycogen synthase, GCS)和糖原磷酸化酶a(Glycogen phosphorylase a, GPa)的酶活使用北京百奧萊博科技有限公司生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定, 所有實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格參照說(shuō)明書進(jìn)行。

1.4 基因表達(dá)檢測(cè)

每組取6尾大口黑鱸的肝、肌肉或腸組織20 mg,采用MagZol Reagent(Magen)提取總RNA, 經(jīng)Nanodrop 2000紫外分光光度計(jì)(Thermo)檢測(cè)總RNA的濃度, 并用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性。取2 μgA260/280值在1.8—2.2、電泳后28S rRNA﹕18S rRNA條帶亮度約等于2﹕1的質(zhì)量和完整性良好的RNA, 按照FastKing RT Kit with gDNase Fastking cDNA(Tiangen)說(shuō)明書去基因組后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA, 保存于–80℃用于檢測(cè)基因mRNA的表達(dá)。

根據(jù)已有文獻(xiàn)報(bào)道[6, 7]和NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中法尼醇X受體(Farnesoid X receptor,FXR)基因序列(Gen-Bank登錄號(hào)為KT827789.1)設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR, qPCR)引物(表 2), 選擇β-actin和延伸因子 1α (Elongation factor 1α ,EF1-1α）作為雙內(nèi)參基因, 以保證內(nèi)參基因在不同處理中的穩(wěn)定性。qPCR檢測(cè)方法是將1 μL合成的cDNA用3 μL的無(wú)菌水稀釋后, 將0.5 μL的上游引物、0.5 μL的下游引物和5 μL的2×SYBR qPCR Mix(艾德萊)混勻后于CFX ManagerTMSoftware 3.1(Bio-Rad)檢測(cè)基因mRNA表達(dá)。反應(yīng)條件: 95℃預(yù)熱10min; 95℃ 5s, 60℃ 15s, 共40個(gè)循環(huán), 每個(gè)循環(huán)均采集熒光。樣品設(shè)置2個(gè)技術(shù)重復(fù)。用2???Ct方法[26]計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)。

表2 本研究相關(guān)引物Tab. 2 Primers used in this study

1.5 腸道菌群分析

從每個(gè)處理中隨機(jī)選擇5尾大口黑鱸的腸道內(nèi)容物(>0.5 g)送至上海派森諾生物科技股份有限公司,使用正向引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和反向引物806R(5′-GGACTACHVGGGTWTC TAAT-3′)擴(kuò)增腸道細(xì)菌16S rRNA基因的V3—V4可變區(qū)。對(duì)Illumina測(cè)序獲得的原始數(shù)據(jù)初步篩查后,使用QIIME2 dada2分析流程對(duì)獲得的序列進(jìn)行序列質(zhì)控、去噪、連接、去除嵌合體獲得以100%相似度聚類的ASVs(Amplicon sequence variants)。根據(jù)樣品ASVs與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/db/)的相似性對(duì)比結(jié)果進(jìn)行物種注釋。根據(jù)分類學(xué)統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析腸道微生物的群落組成和結(jié)構(gòu), 使用R語(yǔ)言ggplot2包進(jìn)行α多樣性分析, 計(jì)算Chao1、Shannon和Simpson指數(shù), 分析每組組內(nèi)單個(gè)樣本腸道菌群的多樣性, 其中Chao1反應(yīng)菌群的豐富度[27], Shannon和Simpson指數(shù)反應(yīng)菌群的多樣性[28,29]。使用R語(yǔ)言ape包等計(jì)算各樣本的距離矩陣進(jìn)行主坐標(biāo)分析(Principal coordinates analysis, PCoA)的β多樣性分析, PCoA分析中的weighted UniFrac距離分析[30]用于表征這兩個(gè)樣本間的群落差異。以上操作通過(guò)派森諾生物科技股份有限公司的云平臺(tái)分析完成。大口黑鱸腸道菌群測(cè)序原始數(shù)據(jù)上傳至NCBI/SRA數(shù)據(jù)庫(kù), 登錄號(hào)為PRJNA705573。

1.6 數(shù)據(jù)分析

本實(shí)驗(yàn)所有的數(shù)據(jù)分析使用IBM SPSS Statistics 23軟件, 用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)表示。對(duì)照組和膽酸鈉組之間的差異分析使用Student’st檢驗(yàn)分析,P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 飼料添加膽酸鈉對(duì)大口黑鱸生長(zhǎng)和體成分的影響

在8周的養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束后, 為探究膽酸鈉對(duì)大口黑鱸生長(zhǎng)性能和體成分的影響, 本研究分別檢測(cè)增重率、肥滿度、軀殼比、臟體比、肝體比和脂體比6種生長(zhǎng)性能指標(biāo), 和檢測(cè)水分、粗蛋白、粗脂肪和粗灰分4種體成分指標(biāo)。結(jié)果顯示, 與對(duì)照組相比, 膽酸鈉組大口黑鱸的增重率、軀殼比稍有降低, 但沒(méi)有顯著性差異(P>0.05); 而肥滿度、臟體比、肝體比和脂體比略微升高, 也沒(méi)有顯著性差異(P>0.05; 表 3)。該結(jié)果說(shuō)明飼料添加300 mg/kg的膽酸鈉對(duì)大口黑鱸的生長(zhǎng)沒(méi)有顯著影響。此外, 飼料補(bǔ)充膽酸鈉飼喂大口黑鱸后, 大口黑鱸全魚的粗灰分降低, 但沒(méi)有顯著差異(P>0.05); 而水分、粗蛋白和粗脂肪增加, 也沒(méi)有顯著性差異(P>0.05; 表 3),該結(jié)果說(shuō)明300 mg/kg的膽酸鈉對(duì)大口黑鱸的體成分變化未造成顯著影響。

表3 飼料添加膽酸鈉對(duì)大口黑鱸生長(zhǎng)和體成分的影響Tab. 3 Effects of sodium cholate supplementation on the growth and body composition of largemouth bass

2.2 飼料添加膽酸鈉對(duì)大口黑鱸腸道菌群的影響

對(duì)照組和膽酸鈉組大口黑鱸腸道內(nèi)容物16S rRNA測(cè)序共獲得631124條ASVs序列, 每個(gè)樣本測(cè)序量超過(guò)35000條, 平均長(zhǎng)度約為418 bp。與對(duì)照組相比, 膽酸鈉組腸道菌群的3種α多樣性指數(shù)Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)略有下降, 但沒(méi)有顯著性差異(圖 1A)。該結(jié)果表明膽酸鈉對(duì)大口黑鱸腸道菌群在α多樣性水平上的物種豐富度和多樣性沒(méi)有顯著影響。基于ASVs的PcoA分析結(jié)果顯示, PC1為54.3%, PC2為20.4%, 且對(duì)照組和膽酸鈉組聚集在一起(圖 1B)。該結(jié)果表明300 mg/kg的膽酸鈉對(duì)腸道菌群的群落組成的β多樣性無(wú)顯著影響。比較分析對(duì)照組和膽酸鈉組大口黑鱸腸道微生物的分類學(xué)組成, 展示相對(duì)豐度最高的10個(gè)物種,其余物種的相對(duì)豐度合并, 并歸為其他(Others)。結(jié)果顯示, 在門分類水平上, 兩組之間的腸道微生物群落組成相似, 腸道優(yōu)勢(shì)菌群也較為一致(圖 1C)。其中軟壁菌門(Tenericutes; 29.62%)、放線菌門(Actinobacteria; 22.21%)、變形菌門(Proteobacteria;18.12%)和梭桿菌門(Fusobacteria; 14.44%)在樣本中的相對(duì)豐度較高, 這4類優(yōu)勢(shì)菌群占腸道菌群的比例為84.39%, 其后依次是擬桿菌門(Bacteroidetes;7.61%)、厚壁菌門(Firmicutes; 4.83%)、疣微菌門(Verrucomicrobia; 1.24%)、異常球菌-棲熱菌門(Deinococcus-Thermus; 0.04%)、浮霉菌門(Planctomycetes; 0.04%)和酸桿菌門(Acidobacteria; 0.03%),排名前10的細(xì)菌豐度之和占腸道菌群的比例超過(guò)98%, 這與我們觀察到的腸道菌群的α多樣性和β多樣性結(jié)果一致, 兩組之間的腸道菌群組成也沒(méi)有顯著性差異。綜上, 飼料添加300 mg/kg的膽酸鈉不能顯著改變大口黑鱸腸道菌群的組成、物種豐富度和多樣性。

圖1 腸道微生物α (A)和β多樣性分析(B)和分類學(xué)組成分析(C)Fig. 1 Intestinal microbial α (A) and β diversity analysis (B) and composition (C)

2.3 飼料添加膽酸鈉對(duì)大口黑鱸糖原合成和血糖的影響

為探究膽酸鈉對(duì)大口黑鱸糖代謝的影響, 本研究檢測(cè)了大口黑鱸糖原和血糖的含量。結(jié)果顯示,飼喂300 mg/kg膽酸鈉的大口黑鱸與對(duì)照相比, 每克組織中肝糖原的含量顯著增加(P<0.05; 圖 2A),但肌糖原的含量幾乎沒(méi)有變化(P>0.05; 圖 2B); 并且血糖含量呈現(xiàn)降低的趨勢(shì), 但無(wú)顯著差異(P>0.05; 圖 2C)。此外, 肝和肌肉的PAS染色切片結(jié)果顯示, 膽酸鈉組大口黑鱸肝中糖原染色比對(duì)照組更加明顯, 而肌肉中糖原染色兩組間無(wú)明顯差異, 這與肝糖原和肌糖原的含量測(cè)定結(jié)果相似(圖 2D)。以上結(jié)果表明, 飼料添加300 mg/kg膽酸鈉可以增加肝糖原合成, 但對(duì)肌糖原的合成和血糖沒(méi)有顯著影響。

圖2 飼料添加膽酸鈉對(duì)大口黑鱸糖原合成和血糖的影響Fig. 2 Effects of sodium cholate on glycogen synthesis and blood glucose of largemouth bass

2.4 飼料添加膽酸鈉對(duì)大口黑鱸糖原合成酶和糖原分解酶a酶活性的影響

探究影響糖原含量的兩個(gè)關(guān)鍵酶的酶活, 包括糖原合成途徑中的關(guān)鍵酶糖原合成酶和糖原分解途徑中的關(guān)鍵酶糖原磷酸化酶a。結(jié)果顯示, 與對(duì)照組相比, 膽酸鈉組大口黑鱸肝中糖原合成酶的活性顯著增加(P<0.05; 圖 3A), 但糖原磷酸化酶a的酶活沒(méi)有顯著變化(P>0.05; 圖 3B)。同樣, 肌肉糖原合成酶和糖原磷酸化酶a的酶活沒(méi)有顯著差異(P>0.05; 圖 3A和3B)。該結(jié)果說(shuō)明飼料添加300 mg/kg膽酸鈉可以增強(qiáng)肝糖原合成酶的活性, 從而增加肝糖原的合成。

圖3 飼料添加膽酸鈉對(duì)大口黑鱸糖原合成酶和糖原磷酸化酶a活性的影響Fig. 3 Effects of sodium cholate on glycogen synthase and glycogen phosphorylase a activities of largemouth bass

2.5 飼料添加膽酸鈉對(duì)大口黑鱸糖異生的影響

為探究單一類型膽酸鈉的添加是否可以調(diào)節(jié)大口黑鱸的糖異生, 檢測(cè)糖異生途徑中3個(gè)關(guān)鍵酶基因的mRNA表達(dá), 包括磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶(Phosphoenolpyruvate carboxykinase, PEPCK)、果糖-1,6-二磷酸酶(Fructose-1,6-bisphosphatase, FBPase)和葡萄糖-6-磷酸酶(Glucose-6-phosphatase,G6Pase)。結(jié)果顯示, 與對(duì)照組相比, 日糧添加300 mg/kg膽酸鈉可促進(jìn)肝糖異生途徑中PEPCK基因的表達(dá)(P>0.05), 并顯著促進(jìn)FBPase和G6Pase基因的表達(dá)(P<0.05; 圖 4A)。在肌肉組織中, 膽酸鈉可促進(jìn)FBPase和G6Pase基因的表達(dá), 降低PEPCK基因的表達(dá), 但對(duì)肌肉糖異生基因的表達(dá)無(wú)顯著影響(P>0.05; 圖 4B)。綜上, 飼料添加300 mg/kg膽酸鈉能夠顯著增強(qiáng)肝的糖異生, 但不影響肌肉的糖異生。

圖4 飼料添加膽酸鈉對(duì)大口黑鱸糖異生的影響Fig. 4 Effects of sodium cholate on gluconeogenesis of largemouth bass

2.6 飼料添加膽酸鈉對(duì)大口黑鱸糖酵解的影響

糖酵解也是生物體糖代謝的關(guān)鍵代謝途徑,3個(gè)關(guān)鍵酶為己糖激酶(Hexokinase, HK)、丙酮酸激酶(Pyruvate kinase, PK)和磷酸果糖激酶(Phosphofructokinase, PFK)。研究顯示, 與對(duì)照組相比,添加300 mg/kg的膽酸鈉, 顯著降低大口黑鱸肝中糖酵解關(guān)鍵酶PK基因的表達(dá)(P<0.05), 降低PFK基因的表達(dá)(P>0.05), 但使HK基因的表達(dá)量略微升高(P>0.05; 圖 5A)。在肌肉組織中,PK、HK和PFK基因的表達(dá)量均呈現(xiàn)降低趨勢(shì), 其中HK基因的表達(dá)量顯著降低(P<0.05; 圖 5B)?？傮w而言, 300 mg/kg的膽酸鈉降低大口黑鱸肝和肌肉中的糖酵解。

圖5 飼料添加膽酸鈉對(duì)大口黑鱸糖酵解的影響Fig. 5 Effects of sodium cholate on glycolysis of largemouth bass

2.7 飼料添加膽酸鈉對(duì)膽汁酸受體FXR基因表達(dá)的影響

為探究膽酸鈉的添加是否影響大口黑鱸體內(nèi)膽汁酸受體FXR基因的表達(dá), 檢測(cè)肝和肌肉中FXR的表達(dá)量。結(jié)果顯示, 飼料添加300 mg/kg的膽酸鈉顯著降低大口黑鱸肝中FXR基因mRNA的表達(dá)(P<0.05), 對(duì)腸組織中FXR基因的表達(dá)量無(wú)顯著影響(P>0.05; 圖 6)。結(jié)果說(shuō)明, 膽酸鈉可以調(diào)節(jié)肝中FXR受體的表達(dá)。

圖6 飼料添加膽酸鈉對(duì)膽汁酸受體FXR表達(dá)的影響Fig. 6 Effects of sodium cholate on bile acids receptor FXR of largemouth bass

3 討論

3.1 飼料添加膽酸鈉對(duì)大口黑鱸生長(zhǎng)性能和體成分的影響

已有研究表明, 混合膽汁酸作為飼料添加劑在適宜濃度下可改善魚類的生長(zhǎng)性能。例如, 0.15 g/kg的混合膽汁酸(豬脫氧膽酸、鵝脫氧膽酸和豬膽酸)顯著提高吉富羅非魚的增重率和肥滿度等, 而1.35 g/kg(過(guò)量)膽汁酸抑制其生長(zhǎng)[3]。同樣, 在大口黑鱸的研究中, 飼料添加混合膽汁酸(豬脫氧膽酸、鵝脫氧膽酸和豬膽酸)0到600 mg/kg, 中間濃度300 mg/kg是促進(jìn)大口黑鱸生長(zhǎng)的最佳劑量[7]。此外, 多項(xiàng)研究表明300 mg/kg的混合膽汁酸可顯著促進(jìn)魚類生長(zhǎng)。例如, 飼料中添加300 mg/kg混合膽汁酸也可顯著提高齊口裂腹魚的增重率和特定生長(zhǎng)率等[10]。因此, 本研究以300 mg/kg作為參考劑量, 探究膽酸鈉對(duì)大口黑鱸的生長(zhǎng)是否有促進(jìn)作用, 但是結(jié)果表明飼料添加300 mg/kg的膽酸鈉對(duì)大口黑鱸的生長(zhǎng)指數(shù)(增重率、肥滿度、軀殼比、臟體比、肝體比和脂體比)均無(wú)顯著影響, 并且膽酸鈉未顯著改變大口黑鱸的體成分組成(水分、粗蛋白、粗脂肪和粗灰分)。推測(cè)膽酸鈉作為單一種類的膽汁酸, 不能夠像混合膽汁酸一樣協(xié)同發(fā)揮促生長(zhǎng)作用。此外, 市面上常見(jiàn)的膽汁酸類飼料添加劑主要是豬膽酸、豬脫氧膽酸和鵝脫氧膽酸的混合物[3,7], 而不同的膽汁酸種類可能具有不同的功能。例如, 在水產(chǎn)動(dòng)物的研究中, 膳食補(bǔ)充單一類型的膽汁酸TCAS也不能改善大西洋鮭的生長(zhǎng)性能[20]。因此, 膽酸鈉是否促進(jìn)魚類生長(zhǎng), 還需要設(shè)置多個(gè)濃度的膽酸鈉添加實(shí)驗(yàn)提供更為全面的數(shù)據(jù), 在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中, 我們將對(duì)多個(gè)濃度梯度的膽酸鈉功能進(jìn)行探究, 評(píng)估其對(duì)魚體生長(zhǎng)性能和體成分的影響。

3.2 飼料添加膽酸鈉對(duì)大口黑鱸腸道菌群的影響

膽汁酸可影響腸道菌群的結(jié)構(gòu)和組成, 腸道微生物的結(jié)構(gòu)和組成又會(huì)影響宿主的能量吸收和代謝穩(wěn)態(tài)[2]。已有研究表明, 膽汁酸作為飼料添加劑可以改變魚類腸道菌群的組成。例如, 豬源混合膽汁酸可以降低歐洲鰻鱺腸道菌群的多樣性, 增加厚壁菌門和擬桿菌門等的豐富度, 降低變形菌門、梭桿菌門和放線菌門等的豐富度[14]?；旌夏懼?豬脫氧膽酸、鵝脫氧膽酸和豬膽酸)降低草魚腸道菌群的多樣性, 增加擬桿菌門、梭桿菌門等和螺旋體門的相對(duì)豐度, 減少厚壁菌門和放線菌門的相對(duì)豐度[13]。此外, 研究還發(fā)現(xiàn)飼料添加單一膽汁酸?；鞘懰徕c可以增加草魚腸道中變形桿菌和厚壁菌的相對(duì)豐度, 降低梭桿菌的相對(duì)豐度[19]。在本研究中, 對(duì)照組和膽酸鈉組的腸道微生物群落組成類似,腸道優(yōu)勢(shì)菌與先前研究相比, 也主要為軟壁菌門、放線菌門、變形菌門和梭桿菌門等, 但α多樣性指數(shù)Chao1、Shannon和Simpson指數(shù)及β多樣性PcoA分析結(jié)果均無(wú)顯著差異, 該研究說(shuō)明300 mg/kg膽酸鈉并不能顯著改變大口黑鱸腸道菌群組成。已有研究發(fā)現(xiàn)某些腸道細(xì)菌如擬桿菌具有龐大的多糖代謝基因, 能夠分解宿主無(wú)法消化吸收的碳水化合物以及動(dòng)物性多糖[31], 厚壁菌門可使多糖在牛蛙體內(nèi)發(fā)酵[32]。然而本研究中大口黑鱸腸道擬桿菌門和厚壁菌門的豐富度并沒(méi)有發(fā)生顯著性的改變,說(shuō)明300 mg/kg的膽酸鈉對(duì)魚體糖代謝的調(diào)節(jié)可能與腸道菌群沒(méi)有直接關(guān)系。

3.3 飼料添加膽酸鈉對(duì)大口黑鱸糖代謝的影響

膽汁酸可調(diào)節(jié)生物體的糖原合成、糖異生和糖酵解等糖代謝過(guò)程并維持血糖穩(wěn)定。在本研究中, 膽酸鈉可顯著促進(jìn)大口黑鱸肝糖原的合成, 增加肝中糖原合成酶GCS的活性, 對(duì)肝中糖原分解酶GPa的活性沒(méi)有顯著影響, 這與哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)膽酸可促進(jìn)小鼠肝糖原合成的情況類似[33,34]。此外,本研究發(fā)現(xiàn), 膽酸鈉可顯著促進(jìn)肝臟糖異生, 而該研究與鵝脫氧膽酸抑制小鼠肝臟糖異生[35]和混合膽汁酸(豬脫氧膽酸、鵝脫氧膽酸和豬膽酸)抑制大口黑鱸肝糖異生[7]結(jié)果相反。推測(cè)原因可能為不同種類的膽汁酸具有不同的功能。已有研究發(fā)現(xiàn), 鵝脫氧膽酸可抑制小鼠肝臟糖酵解[36], 同樣, 本研究發(fā)現(xiàn)膽酸鈉也可抑制大口黑鱸肝和肌肉糖酵解。綜上, 該研究結(jié)果表明膽酸鈉可以促進(jìn)大口黑鱸肝臟糖原合成和糖異生并抑制肝和肌肉糖酵解。

已知膽汁酸主要與肝和腸組織中的FXR作用調(diào)節(jié)生物體的糖代謝, 如哺乳動(dòng)物中的研究表明膽酸可激活小鼠腸FXR最終促進(jìn)肝糖原合成[33,34], 鵝脫氧膽酸可激活小鼠肝FXR抑制糖異生和糖酵解[35,36]。然而在本研究中, 檢測(cè)大口黑鱸肝和腸中FXR的表達(dá)發(fā)現(xiàn), 飼料添加300 mg/kg的膽酸鈉顯著抑制肝中FXR基因的表達(dá), 對(duì)腸中FXR基因的表達(dá)沒(méi)有顯著影響。該研究結(jié)果與小鼠中FXR的激活相反, 分析其可能的原因?yàn)镕XR在進(jìn)化過(guò)程中, 由于從其配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Ligand binding domain, LBD)中缺失序列導(dǎo)致了FXR的膽汁酸配體特異性[37], 從而使不同膽汁酸對(duì)于不同種類的FXR的調(diào)節(jié)結(jié)果不同。比如在水生動(dòng)物猥白鰩(Leucoraja erinacea)的研究中就發(fā)現(xiàn)與人的FXR相比, 猥白鰩FXR對(duì)膽汁酸的感應(yīng)能力較弱[37]; 此外日本青鳉(Oryzias latipes)2個(gè)不同亞型的FXR顯示出對(duì)C24膽汁酸的不同應(yīng)答效果[38]。

4 結(jié)論

本研究探討了飼料添加300 mg/kg的膽酸鈉對(duì)大口黑鱸生長(zhǎng)和糖代謝的影響。結(jié)果表明300 mg/kg的膽酸鈉不能有效提高大口黑鱸的生長(zhǎng)性能和體指數(shù), 不改變腸道菌群組成, 但可能通過(guò)抑制肝FXR基因的表達(dá)實(shí)現(xiàn)對(duì)大口黑鱸糖代謝的調(diào)節(jié), 通過(guò)促進(jìn)大口黑鱸肝糖異生, 抑制肝和肌肉的糖酵解,并促進(jìn)肝糖原合成。該研究表明, 膽酸鈉雖然可調(diào)節(jié)大口黑鱸的糖代謝, 但作為飼料添加劑在水產(chǎn)促生長(zhǎng)等的應(yīng)用上還需設(shè)置多個(gè)濃度梯度系統(tǒng)評(píng)估。