越冬脅迫對(duì)草魚(yú)抗氧化能力及脂肪酸組成的影響

武文一 吉 紅

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院, 楊凌 712100)

在水產(chǎn)養(yǎng)殖中, 越冬(尤其是北方地區(qū))是一個(gè)特殊的階段, 魚(yú)類(lèi)遭受多種越冬應(yīng)激影響, 例如食物匱乏、水溫低和光照[1]。魚(yú)類(lèi)的免疫反應(yīng)隨著季節(jié)變化而變化, 冬季魚(yú)類(lèi)的免疫功能受到抑制, 同時(shí)造成較高的氧化應(yīng)激反應(yīng), 進(jìn)而導(dǎo)致魚(yú)類(lèi)高死亡率[2]。魚(yú)類(lèi)動(dòng)員機(jī)體儲(chǔ)備的能量物質(zhì), 以度過(guò)食物短缺時(shí)期, 例如在越冬期間[3]。這種動(dòng)員不僅僅包括肝胰臟, 還包括肌肉和脂肪組織中的脂質(zhì)分解;以肌肉中蛋白質(zhì)為主要能量來(lái)源; 或者將肝糖原或肌糖原分解成葡萄糖作為能量底物[4]。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室的前期的研究結(jié)果, 越冬期間, 脂質(zhì)動(dòng)員是作為魚(yú)類(lèi)應(yīng)對(duì)越冬脅迫的最重要能量供應(yīng)方式之一, 自始至終從越冬開(kāi)始到越冬結(jié)束維持魚(yú)體能量之穩(wěn)態(tài)[5]。有研究表明, 魚(yú)類(lèi)在長(zhǎng)期營(yíng)養(yǎng)匱乏脅迫下, 動(dòng)員能量抵御不利應(yīng)激的同時(shí), 誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生了活性氧自由基(ROS), 長(zhǎng)期累積造成氧化應(yīng)激[6,7]。過(guò)多的ROS會(huì)破壞機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的平衡以及穩(wěn)定, 造成細(xì)胞的損傷、細(xì)胞核的凋亡以及脂肪酸過(guò)氧化[8,9]。尤其在越冬期間作為主要供能物質(zhì)的脂肪酸, 其供能作用受到巨大威脅以及挑戰(zhàn)。最直接結(jié)果就是降低供能水平, 造成機(jī)體抗氧化力以及免疫力的進(jìn)一步降低, 故而提高了死亡率[10]。越冬期間造成了氧化應(yīng)激的過(guò)度產(chǎn)生, 提高了魚(yú)體死亡, 因此探索并解決越冬脅迫對(duì)魚(yú)體抗氧化力乃至免疫力之間的相互作用關(guān)系具有重要的意義。

草魚(yú)(Ctenopharyngodon idellus)作為我國(guó)主要經(jīng)濟(jì)淡水魚(yú)之一, 其產(chǎn)量居2019年中國(guó)養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)產(chǎn)量的榜首, 達(dá)553.3×107kg[11]。由于草魚(yú)生長(zhǎng)迅速,繁育技術(shù)較為成熟, 價(jià)格親民, 營(yíng)養(yǎng)豐富, 因此深受養(yǎng)殖者以及消費(fèi)者的歡迎[12]。但是在越冬脅迫下面臨著魚(yú)體內(nèi)ROS的過(guò)量生成, 誘導(dǎo)了氧化應(yīng)激脅迫。而過(guò)度的氧化應(yīng)激可能導(dǎo)致機(jī)體免疫力下降,誘發(fā)疾病甚至死亡率的提高, 不利于草魚(yú)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。為了建立有效的策略, 并指導(dǎo)管理決策以改善該草魚(yú)的越冬存活率, 因而需要更好地了解越冬驅(qū)動(dòng)的高度氧化應(yīng)激的相互作用。因此,本研究以草魚(yú)為研究對(duì)象, 探索越冬條件下氧化應(yīng)激對(duì)草魚(yú)免疫和抗氧化能力的影響, 以及與機(jī)體脂肪酸組成變化之間的相互聯(lián)系, 為緩解草魚(yú)越冬期間產(chǎn)生過(guò)度的氧化應(yīng)激的反應(yīng)以及降低魚(yú)體死亡率提供相關(guān)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用魚(yú)均取自西北農(nóng)林科技大學(xué)安康水產(chǎn)試驗(yàn)示范站室外培育池塘, 選擇同一批次養(yǎng)成商品規(guī)格的草魚(yú), 挑選大小整齊以及健壯的個(gè)體作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象, 實(shí)驗(yàn)魚(yú)體重(1053.33±16.11) g。同時(shí)在室外培育水泥池中馴化兩周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn), 馴化期間每日正常投喂商品飼料(粗蛋白28%, 粗脂肪6%)。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件和方法

實(shí)驗(yàn)在室外培育水泥池中進(jìn)行(4 m×4 m×1 m),選取8個(gè)實(shí)驗(yàn)池, 中間用隔網(wǎng)隔開(kāi), 上面架設(shè)遮陽(yáng)網(wǎng),水深控制0.50 m左右, 水容量8 m3左右。經(jīng)過(guò)2周投飼馴化后, 停食1天進(jìn)行分組; 隨機(jī)分為7組, 每組3個(gè)重復(fù), 每個(gè)重復(fù)15尾魚(yú)。當(dāng)水溫自然下降到草魚(yú)停止攝食(水溫: 15℃)時(shí), 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始; 當(dāng)水溫自然升高到草魚(yú)開(kāi)始重新覓食(水溫: 15℃)時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)束,此過(guò)程即為越冬期。實(shí)驗(yàn)共計(jì)7 組, 分別為饑餓0周(Week 0)、1周(Week 1)、2周(Week 2)、4周(Week 4)、8周(Week 8)、12周(Week 12)和16周(Week 16)。實(shí)驗(yàn)用水為曝氣后井水, 流水環(huán)境, 每2周清污一次。每日定時(shí)監(jiān)測(cè)水溫、水質(zhì), 同時(shí)觀(guān)察實(shí)驗(yàn)魚(yú)魚(yú)體的健康狀況以及死亡狀況。實(shí)驗(yàn)用水條件:pH 7.8—8.2, 溶解氧5—6 mg/L, 氨氮<0.1 mg/L, 亞硝酸鹽<0.01 mg/L, 硫化物<0.05 mg/L。

1.3 樣品采集

采樣程序經(jīng)過(guò)西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物保護(hù)與利用委員會(huì)批準(zhǔn), 同時(shí)按照動(dòng)物福利與道德規(guī)范進(jìn)行執(zhí)行。在各實(shí)驗(yàn)組饑餓處理結(jié)束后, 所有魚(yú)均用50 mg/L MS222麻醉后, 再對(duì)其進(jìn)行取樣。每組實(shí)驗(yàn)魚(yú), 逐一測(cè)量體質(zhì)量、體長(zhǎng)和全長(zhǎng)等指標(biāo),計(jì)算肥滿(mǎn)度。每個(gè)平行隨機(jī)抽取2尾魚(yú)進(jìn)行尾靜脈采血, 4℃冰箱靜置2h后, 4℃離心(3000 r/min,15min), 上層澄清透明淡黃色的血清速凍于液氮中, 而后轉(zhuǎn)入–80℃冰箱保存, 用作血清抗氧化酶活性指標(biāo)測(cè)定; 每個(gè)平行隨機(jī)抽取2尾魚(yú)在冰盤(pán)上進(jìn)行解剖, 取其內(nèi)臟團(tuán), 分離肝胰臟、腎、脾及腹腔脂肪等組織, 稱(chēng)重, 同時(shí)量取腸道長(zhǎng)度, 計(jì)算臟體比、肝體比、腎指數(shù)、脾指數(shù)、腹腔脂肪指數(shù)及腸體比等指標(biāo)。隨后在上述分離組織中, 取部分肝胰臟、肌肉、前腸和腹腔脂肪組織速凍于液氮中, 隨后轉(zhuǎn)–80℃冰箱保存, 用作酶活性測(cè)量及脂肪酸的測(cè)定。

1.4 測(cè)定指標(biāo)和方法

根據(jù)以下公式, 計(jì)算肥滿(mǎn)度、肝體比、臟體比、腸體比、腎指數(shù)、脾指數(shù)和腹腔脂肪指數(shù):

肥滿(mǎn)度(Condition factor,CF, g/cm3)=魚(yú)體重×100/體長(zhǎng)3;

肝體比(Hepatosomatic index,HSI)=肝胰臟重×100/魚(yú)體重;

臟體比(Viscerosomatic index,VSI)=內(nèi)臟重×100/魚(yú)體重;

腸體比(Relative intestine length,RIL)=腸長(zhǎng)×100/體長(zhǎng);

腎指數(shù)(Kidney index,KI)= 腎臟重×100/魚(yú)體重;

脾指數(shù)(Spleen index,SI)= 脾臟重×100/魚(yú)體重;

腹腔脂肪指數(shù)(Intraperitoneal fat body index,IPFI)=腹腔脂肪重×100/魚(yú)體重;

成活率(Survival rate,SR, %)=最終魚(yú)數(shù)×100/初始魚(yú)數(shù)。

肝胰臟、肌肉、前腸、脂肪組織和血清中的丙二醛(MDA)、過(guò)氧化氫酶(CAT)和總超氧化物歧化酶(SOD)活性/含量使用南京建成生物工程研究所試劑盒測(cè)定(貨號(hào)分別是: A003-1-2、A007-1-1和A001-3-2), 谷胱甘肽 S-轉(zhuǎn)移酶(GST)活性和超氧陰離子含量使用北京索萊寶科技有限公司試劑盒測(cè)定(貨號(hào)分別是: SN101和BC1295), 蛋白質(zhì)濃度使用南京建成生物工程研究所考馬斯亮藍(lán)染色法試劑盒(貨號(hào): A045)測(cè)定。

脂肪酸測(cè)定分析過(guò)程中, 脂肪提取參照Tian等[13]的方法。取組織樣品大約5 g, 放置于10 mL離心管;加入氯仿?甲醇混合液(體積比2﹕1)溶液5 mL, 高速勻漿后, 搖床震蕩2h使之充分混勻, 隨后再用定量濾紙過(guò)濾。加入4 mL 去離子水, 震蕩混勻后在離心機(jī)上進(jìn)行3000 r/min離心5min, 棄上清液及中間組織蛋白層, 下層40℃水浴蒸干。蒸干后加入1 mL正己烷(色譜純)溶解提取出的油脂。油脂的皂化及甲酯化參照Tian等[13]的方法, 加入1 mL 氫氧化鉀/甲醇溶液(0.4 mol/L), 再進(jìn)行30min的甲酯化。最終加入2 mL去離子水, 震蕩混勻后在離心機(jī)上進(jìn)行3000 r/min離心5min, 取上層溶液–20℃保存。樣品首先皂化以及甲酯化后, 使用氣相色譜儀(Agilent7820a, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)進(jìn)行測(cè)定。脂肪酸甲酯樣品, 通過(guò)與脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品(47015-U, Sigma-Aldrich, USA)進(jìn)行比較鑒定。取1 μL混合物進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)。脂肪酸組成的相對(duì)值分析按面積歸一化法計(jì)算, 以總脂肪酸的百分比形式呈現(xiàn)[14]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件(19.0版, Chicago, IL, USA)的單因素方差分析和Duncan’s多重比較檢驗(yàn)進(jìn)行分析。使用Origin Pro 2017C(Northampton,MA, USA)軟件, 采用協(xié)方差矩陣法(Covariance matrix)對(duì)不同組織抗氧化酶活性數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析(Principal component analysis, PCA)分析, 解釋不同越冬時(shí)間對(duì)不同組織抗氧化能力的相對(duì)影響和差異; 同時(shí)采用協(xié)方差矩陣法(Covariance matrix)對(duì)肝胰臟、肌肉和脂肪組織脂肪酸數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析分析[15], 解釋不同越冬時(shí)間對(duì)上述組織脂肪酸組成的相對(duì)差異。采用相關(guān)矩陣法(Correlation matrix)對(duì)肝胰臟、肌肉和脂肪組織脂肪酸與酶活性數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析分析[16], 解釋不同越冬時(shí)間處理對(duì)肝胰臟、肌肉和脂肪組織中的抗氧化能力與脂肪酸組成的相對(duì)差異。其中, 各組織脂肪酸數(shù)據(jù)首先進(jìn)行正(余)弦或?qū)?shù)轉(zhuǎn)換, 使之方差齊性, 以適應(yīng)PCA分析對(duì)線(xiàn)性關(guān)系的要求[17], 再進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)和Duncan’s多重比較檢驗(yàn); 主成分分析中的因子提取使用, 按特征值大于0.5的標(biāo)準(zhǔn)確定, 為了使因子易于解釋和命名, 采用方差最大正交旋轉(zhuǎn)法對(duì)其進(jìn)行旋轉(zhuǎn)處理。所有數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)的方式表示。P<0.05為差異顯著。柱狀圖采用Prism 7 軟件(Graph Pad Software Inc., San Diego, USA)進(jìn)行繪制。

2 結(jié)果

2.1 不同越冬時(shí)間對(duì)草魚(yú)生物學(xué)性狀的影響

隨著越冬時(shí)間延長(zhǎng), 越冬草魚(yú)體重、肝胰臟重量、肥滿(mǎn)度、肝體比、臟體比、腸體比和腹腔脂肪指數(shù)等指標(biāo)均呈現(xiàn)顯著下降的趨勢(shì)(P<0.05); 而腎指數(shù)和脾指數(shù)呈現(xiàn)顯著上升的趨勢(shì)(P>0.05; 表 1)。

表1 不同越冬時(shí)間處理對(duì)草魚(yú)生物學(xué)性狀的影響Tab. 1 Effects of different overwintering time treatment on biometric parameters in grass carp (n=3)

2.2 不同越冬時(shí)間對(duì)草魚(yú)組織抗氧化指標(biāo)的影響

如圖 1所示, 隨著越冬時(shí)間延長(zhǎng), 肝胰臟、肌肉、前腸、脂肪組織和血清中抗氧化能力相關(guān)指標(biāo)均發(fā)生了顯著變化(圖 1A—E;P<0.05), 故而采用主成分分析法降低原有多個(gè)組織中抗氧化能力相關(guān)指標(biāo)變量的維度, 用較少的獨(dú)立公因子反映原有變量的絕大部分信息。圖 2顯示了經(jīng)PCA處理后形成的評(píng)分圖和載荷圖。載荷特征值如表 2所示, 只有特征值大于1.0才被視為數(shù)據(jù)差異的重要主成分(根據(jù)Kaiser規(guī)則)。前3個(gè)公因子的特征值均大于1.0, 表明這3個(gè)公因子對(duì)PCA解釋的累計(jì)方差有著重要貢獻(xiàn)。PC1和PC2一起解釋了98.96%的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率(方差貢獻(xiàn)率分別為84.79%和14.17%),PC3只解釋0.96%方差貢獻(xiàn)率。因此, 3個(gè)公因子足以解釋不同越冬處理下, 不同組織中不同抗氧化能力相關(guān)指標(biāo)的變化。在評(píng)分圖中, 不同顏色橢圓面積大小表示不同組織中抗氧化能力相關(guān)指標(biāo)在不同越冬時(shí)間處理下的變化趨勢(shì), 面積越大, 表示抗氧化能力相關(guān)指標(biāo)在越冬時(shí)間處理下變化程度越大, 那么該組織在越冬時(shí)間內(nèi)其抗氧化能力指標(biāo)體系變化越劇烈。橢圓面積由大到小依次是: 脂肪組織>肝胰臟>肌肉>前腸>血清。顯示脂肪組織在越冬時(shí)間內(nèi)其抗氧化能力指標(biāo)體系變化程度最劇烈,間接體現(xiàn)脂肪組織在越冬期間所有氧化應(yīng)激程度最大; 其次是肝胰臟和肌肉, 變化最小的是前腸和血清。而載荷圖顯示, SOD和CAT對(duì)總體抗氧化能力的貢獻(xiàn)中起主要影響(主成分載荷特征值絕對(duì)值大于0.5)。

表2 協(xié)方差矩陣法下的顯著主成分載荷特征值分析Tab. 2 Eigen analysis of the covariance matrix loadings for significant principal components

圖1 不同越冬時(shí)間處理對(duì)草魚(yú)各組織抗氧化指標(biāo)的影響Fig. 1 Effects of different overwintering time treatment on antioxidant indexes in tissues of grass carp (n=3)

圖2 通過(guò)分析不同越冬時(shí)間處理下草魚(yú)各組織中抗氧化能力, 根據(jù)選定的抗氧化酶活性含量變量(圖 1)生成PCA評(píng)分圖和載荷圖Fig. 2 PCA score plot and loading plot are generated based on selected antioxidant capacity variables (Fig. 1) obtained by analyzing the fatty acid composition in tissue and serum of grass carp under different overwintering time treatments

2.3 不同越冬時(shí)間對(duì)草魚(yú)肝胰臟、肌肉和脂肪組織脂肪酸組成的影響

根據(jù)上述結(jié)果, 不同越冬時(shí)間內(nèi)肝胰臟、肌肉和脂肪組織中抗氧化體系變化最劇烈, 故而選定這3種組織進(jìn)行脂肪酸比例測(cè)定。隨著越冬時(shí)間的增長(zhǎng), 肝胰臟、肌肉和脂肪組織中各類(lèi)脂肪酸組成比例均產(chǎn)生了顯著差異(P<0.05; 表 3—5)。通過(guò)主成分分析, 圖 3中評(píng)分圖表示不同越冬時(shí)間處理下草魚(yú)肝胰臟、肌肉和脂肪組織中脂肪酸比例的變化趨勢(shì), 各組織在不同越冬時(shí)間處理下, 均表現(xiàn)出了較大的差異性; 在肝胰臟中, 越冬第0、第1和第4周處理組在評(píng)分圖第一四象限, 越冬第2和第12周處理組在第二象限, 越冬第8和16周處理組在第三象限; 在肌肉中, 越冬第0、第1、第4和第8周處理組在評(píng)分圖第三四象限, 越冬第2周處理組在第一象限, 越冬第12和第16周處理組在第二象限; 脂肪組織中, 越冬第2周處理組在第一象限, 越冬第0、第8、第12和第16周處理組在評(píng)分圖第二三象限, 越冬第1和第4周處理組在評(píng)分圖第四象限。表 6中,主成分分析后, 對(duì)肝胰臟、肌肉和脂肪組織分析得出: 前3個(gè)公因子累計(jì)貢獻(xiàn)率均超過(guò)95%, 表明可以使用上述3個(gè)主因子(PC1、PC2和PC3)較好地代表18項(xiàng)脂肪酸變量指標(biāo)。結(jié)合圖 3, 對(duì)肝胰臟、肌肉和脂肪組織載荷圖進(jìn)行分析可得: 肝胰臟PUFA比例變化對(duì)總體脂肪酸比例變化產(chǎn)生主要影響(主成分載荷特征值大于0.5), 在越冬期間, PUFA比例變化呈現(xiàn)顯著上升(P<0.05); 肌肉C18:2n-6和C16:0比例變化對(duì)總體脂肪酸組成產(chǎn)生了主要影響, C18:2n-6比例變化在越冬期間呈現(xiàn)先顯著下降而后顯著上升, C16:0比例變化顯著下降(P<0.05); 腹腔脂肪PUFA、n-6PUFA、SFA和MUFA比例變化對(duì)總體脂肪酸比例產(chǎn)生了主要影響, 越冬脅迫期間, PUFA、n-6PUFA和MUFA比例變化呈現(xiàn)顯著下降后上升保持穩(wěn)定, SFA比例變化呈現(xiàn)顯著上升后下降保持穩(wěn)定(P<0.05)。

表6 協(xié)方差矩陣法下的顯著主成分載荷特征值分析Tab. 6 Eigen analysis of the covariance matrix loadings for significant principal components

圖3 通過(guò)分析不同越冬時(shí)間處理下草魚(yú)肝胰臟、肌肉和脂肪組織脂肪酸組成, 根據(jù)選定的脂肪酸變量(表 3—5)生成PCA評(píng)分圖和載荷圖Fig. 3 PCA score plot and loading plot are generated based on selected fatty acid variables (Tab. 3—5) obtained by analyzing the fatty acid composition in hepatopancreas, muscle and adipose tissue of grass carp under different overwintering time treatments

表3 不同越冬時(shí)間處理對(duì)草魚(yú)肝胰臟組織脂肪酸組成的影響Tab. 3 Fatty acid composition of hepatopancreas in grass carp under different overwintering time treatments (% total fatty acid; mean±SD;n=3)

表4 不同越冬時(shí)間處理對(duì)草魚(yú)肌肉組織脂肪酸組成的影響Tab. 4 Fatty acid composition of muscle in grass carp under different overwintering time treatments (% total fatty acid; mean±SD; n=3)

2.4 不同越冬時(shí)間對(duì)草魚(yú)肝胰臟、肌肉和脂肪組織脂肪酸組成和抗氧化能力相關(guān)指標(biāo)關(guān)聯(lián)性的影響

對(duì)越冬脅迫下, 草魚(yú)肝胰臟、肌肉和脂肪組織脂肪酸組成以及抗氧化能力的相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行了相關(guān)矩陣法主成分分析之關(guān)聯(lián)性分析(圖 4)。載荷特征值如表 7可得: 當(dāng)特征值大于1.0才會(huì)認(rèn)為是數(shù)據(jù)差異的重要主成分(Kaiser規(guī)則)。由于前3個(gè)公因子特征值均大于1.0, 表明前3個(gè)公因子對(duì)PCA解釋累計(jì)方差貢獻(xiàn)率有著極其重要的貢獻(xiàn)。肝胰臟和肌肉PC1、PC2和PC3累計(jì)方差的貢獻(xiàn)率超過(guò)了80%, 脂肪組織累計(jì)方差貢獻(xiàn)率則超過(guò)了75%。但是載荷特征值表 7顯示, 沒(méi)有任何指標(biāo)變量起到了主要影響(主成分載荷特征值絕對(duì)值大于0.5), 但是按高低排序, 發(fā)現(xiàn)其中最具有影響作用的3個(gè)變量,分別是肝胰臟中的MUFA、n-3PUFA和PUFA; 肌肉中的DHA、n-3PUFA和MUFA; 脂肪組織中的SFA、C16﹕1n-7和PUFA。圖 4中, 肝胰臟脂肪酸組成的比例和抗氧化能力指標(biāo)位于得分圖的同一區(qū)域, 如CAT、SOD、GST和脂肪酸C18﹕2n-6、C18﹕3n-6、n-6PUFA、PUFA均在第二象限緊密聚集, MDA和脂肪酸C20﹕3n-6、C18﹕1n-9、MUFA均在第一象限緊密聚集, 表明存在正相關(guān); 肌肉脂肪酸組成比例和抗氧化能力指標(biāo)位于得分圖的同一區(qū)域, 如MDA、SOD、GST和脂肪酸C18﹕1n-9、MUFA均在第一象限緊密聚集, CAT和脂肪酸C16﹕0、C16﹕1n-7、C22﹕4n-6、DHA均在第二象限緊密聚集, 表明存在正相關(guān); 脂肪組織脂肪酸組成比例和抗氧化能力指標(biāo)位于得分圖的同一區(qū)域,如CAT、SOD、GST和脂肪酸C16﹕0、C18﹕0、C20﹕3n-6均在第四象限緊密聚集, MDA和脂肪酸SFA、MUFA、EPA均在第一象限緊密聚集, 表明存在正相關(guān); 雖然這些變量對(duì)方差貢獻(xiàn)較小, 但從該分析中依然獲得了組織脂肪酸組成與抗氧化能力相關(guān)變量間較為積極的關(guān)聯(lián)性的結(jié)果。

表7 相關(guān)矩陣法下的顯著主成分載荷特征值分析Tab. 7 Eigen analysis of the correlation matrix loadings for significant principal components

圖4 不同越冬時(shí)間處理對(duì)草魚(yú)肝胰臟、肌肉和脂肪組織脂肪酸組成及抗氧化能力的主成分分析Fig. 4 Principal component analysis (PCA) of fatty acid composition and antioxidant capacity variables in hepatopancreas,muscle, foregut, adipose tissue and serum of grass carp under different overwintering time treatments

表5 不同越冬時(shí)間處理對(duì)草魚(yú)腹腔脂肪組織脂肪酸組成的影響Tab. 5 Fatty acid composition of adipose tissue in grass carp under different overwintering time treatments (% total fatty acid; mean±SD;n=3)

3 討論

3.1 不同越冬時(shí)間對(duì)草魚(yú)生物學(xué)性狀的影響

魚(yú)類(lèi)在自然界生長(zhǎng)過(guò)程中, 經(jīng)常面臨饑餓這一種自然生理脅迫。在饑餓脅迫影響下, 魚(yú)體往往只能依靠自身的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗來(lái)維持機(jī)體能量的代謝平衡[18]。生物學(xué)性狀是反映不同狀態(tài)下魚(yú)體營(yíng)養(yǎng)儲(chǔ)備消耗情況最直接量化指標(biāo)[19]。本研究結(jié)果表明, 在越冬脅迫下, 草魚(yú)的生物學(xué)性狀參數(shù)中,體重、肝胰臟重量、肥滿(mǎn)度、肝體比、臟體比、腸體比和腹腔脂肪指數(shù)均呈現(xiàn)顯著下降的趨勢(shì), 但是腎指數(shù)和脾指數(shù)呈現(xiàn)顯著上升的趨勢(shì); 相比較肝胰臟質(zhì)量和腹腔脂肪指數(shù), 則在第1和第2周就出現(xiàn)了顯著的下降。這表明在越冬期間, 肝胰臟和腹腔脂肪組織均在第一時(shí)間進(jìn)行了能量動(dòng)員, 供應(yīng)魚(yú)體進(jìn)行了能量消耗, 這也許是魚(yú)體為了適應(yīng)氧化應(yīng)激狀態(tài)下, 需要能量物質(zhì)進(jìn)行消耗進(jìn)而來(lái)維持正常生理狀態(tài)的一種保護(hù)性手段[20]。

3.2 不同越冬時(shí)間對(duì)草魚(yú)組織抗氧化指標(biāo)的影響

肝胰臟是魚(yú)類(lèi)重要的器官, 具有多種代謝及分解功能[21]; 肌肉是魚(yú)類(lèi)重要的運(yùn)動(dòng)組織[22], 前腸是重要的消化器官[23], 腹腔脂肪組織是作為草魚(yú)重要的儲(chǔ)能器官[24], 血清則作為一種組織液, 起維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的作用[25]。生物學(xué)性狀指標(biāo)的變化,如: 肝胰臟質(zhì)量、肝體比、腸體比和腹腔脂肪指數(shù), 也表明了這些組織應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激所做出的適應(yīng)性調(diào)整。在整個(gè)越冬脅迫期間, 對(duì)上述組織及血清抗氧化指標(biāo)的測(cè)定后, 同時(shí)進(jìn)行了PCA分析, 結(jié)果表明, 各個(gè)組織和血清在越冬脅迫期間所受的氧化脅迫的劇烈程度有所不同, 顯示: 脂肪組織>肝胰臟>肌肉>前腸>血清, 表明腹腔脂肪組織在越冬脅迫期間所受氧化應(yīng)激的程度最大, 其次是肝胰臟和肌肉, 變化最小的則是前腸和血清。而SOD和CAT活性大小對(duì)總體抗氧化能力的貢獻(xiàn)中起主要影響[26]。內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)是保護(hù)魚(yú)類(lèi)組織和細(xì)胞免受氧化損傷的系統(tǒng), 而SOD和CAT酶是該系統(tǒng)的主要反應(yīng)元件之一。SOD可將細(xì)胞內(nèi)的超氧陰離子轉(zhuǎn)化成H2O2, 同時(shí)CAT又將H2O2轉(zhuǎn)化成無(wú)毒無(wú)害的H2O以及O2, 進(jìn)而降低組織內(nèi)的氧化應(yīng)激,維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡[27]。MDA水平的高低則間接反映了魚(yú)體遭受氧化自由基損傷后的嚴(yán)重性, 是反映魚(yú)體的細(xì)胞膜受到氧化破壞的重要指示物[28]。GST是組織中存在的較為豐富的抗氧化酶之一, 是抗氧化防御系統(tǒng)組成的關(guān)鍵部分[29]。腹腔脂肪組織作為草魚(yú)體內(nèi)儲(chǔ)存能量物質(zhì)最為豐富的器官[30], 在整個(gè)越冬脅迫期間自始至終保持著能量供應(yīng)的狀態(tài), 脂肪分解供能較其他組織活躍很多,脂肪酸的分解和氧化供能以及脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)也較其他組織活躍, 這可能就是草魚(yú)越冬期間脂肪組織受到較高氧化應(yīng)激的原因之一。

3.3 不同越冬時(shí)間對(duì)草魚(yú)肝胰臟、肌肉和脂肪組織脂肪酸組成的影響

這里選擇越冬脅迫期間所受氧化應(yīng)激程度最大的3個(gè)組織: 肝胰臟、肌肉和脂肪組織。在不同時(shí)間越冬脅迫處理下, 脂肪酸比例均有顯著不同。這反映出了不同時(shí)間越冬脅迫下, 脂質(zhì)動(dòng)員出現(xiàn)了組織特異性。PCA分析表明, 肝胰臟中PUFA比例變化, 肌肉中C18﹕2n-6和C16﹕0比例變化, 腹腔脂肪中PUFA、n-6PUFA、SFA和MUFA比例變化對(duì)總體脂肪酸比例產(chǎn)生了主要影響, 脂肪酸比例種類(lèi)差異較為明顯[16,31]。脂肪組織中PUFA、n-6PUFA和MUFA比例顯著下降后上升保持穩(wěn)定, SFA比例顯著上升后下降保持穩(wěn)定; 肝胰臟PUFA比例顯著上升; 肌肉中C16﹕0和C18﹕2n-6比例顯著下降。尤其是功能性脂肪酸的代表之一PUFA, 在肝胰臟、肌肉和脂肪組織比例變化的趨勢(shì)更能體現(xiàn)越冬脅迫下, 組織應(yīng)對(duì)越冬脅迫所表現(xiàn)的組織特異性, 脂肪組織中PUFA和n-6PUFA也可能進(jìn)行了供能; 肝胰臟PUFA比例變化的上升, 表明魚(yú)體為了維持某些特殊生物學(xué)功能而間接保留PUFA; 肌肉PUFA比例的變化對(duì)總脂肪酸變化貢獻(xiàn)不大, 但C18﹕2n-6比例變化的下降可能預(yù)示著進(jìn)行了供能。

3.4 不同越冬時(shí)間對(duì)草魚(yú)肝胰臟、肌肉和脂肪組織脂肪酸組成和抗氧化能力相關(guān)指標(biāo)關(guān)聯(lián)性的影響

對(duì)肝胰臟、肌肉和脂肪組織中, 抗氧化能力的相關(guān)指標(biāo)與脂肪酸比變化例間的相關(guān)性進(jìn)行的分析結(jié)果表明, 脂肪酸比例變化與各組織抗氧化能力大小有著較強(qiáng)的相關(guān)性, 圖 5展示了脂肪酸組成在越冬脅迫下與機(jī)體抗氧化能力間關(guān)系的示意圖。草魚(yú)肝胰臟中抗氧化指標(biāo)CAT、SOD、GST和脂肪酸變量C18﹕2n-6、C18﹕3n-6、n-6PUFA、PUFA有關(guān)聯(lián)作用, MDA和脂肪酸變量C20﹕3n-6、C18﹕1n-9、MUFA有關(guān)聯(lián)作用; 同時(shí)肝胰臟中脂肪酸變量MUFA、n-3PUFA和PUFA對(duì)關(guān)聯(lián)分析相關(guān)指標(biāo)貢獻(xiàn)排名靠前, 表明肝胰臟中與氧化應(yīng)激指標(biāo)直接關(guān)聯(lián)脂肪酸變量為PUFA, 對(duì)機(jī)體損傷指標(biāo)MDA直接關(guān)聯(lián)脂肪酸變量為MUFA。肌肉中抗氧化指標(biāo)MDA、SOD、GST和脂肪酸變量C18﹕1n-9、MUFA有關(guān)聯(lián)作用, CAT和脂肪酸變量C16﹕0、C16﹕1n-7、C22﹕4n-6、DHA有關(guān)聯(lián)作用;同時(shí)肌肉中脂肪酸變量DHA、n-3PUFA和MUFA對(duì)關(guān)聯(lián)分析相關(guān)指標(biāo)貢獻(xiàn)排名靠前, 表明肌肉中與氧化應(yīng)激指標(biāo)機(jī)體損傷指標(biāo)MDA直接關(guān)聯(lián)脂肪酸變量為MUFA。脂肪組織中抗氧化指標(biāo)CAT、SOD、GST和脂肪酸變量C16﹕0、C18﹕0、C20﹕3n-6有關(guān)聯(lián)作用, MDA和脂肪酸變量SFA、MUFA、EPA有關(guān)聯(lián)作用; 同時(shí)脂肪組織中脂肪酸變量SFA、C16﹕1n-7和PUFA對(duì)關(guān)聯(lián)分析相關(guān)指標(biāo)貢獻(xiàn)排名靠前, 表明脂肪組織與氧化應(yīng)激指標(biāo)直接關(guān)聯(lián)脂肪酸變量為SFA中的C16﹕0, 對(duì)機(jī)體損傷指標(biāo)MDA直接關(guān)聯(lián)脂肪酸為SFA。上述結(jié)果表明: 草魚(yú)腹腔脂肪組織中脂肪酸變量SFA在越冬脅迫期間供應(yīng)能量的同時(shí)與氧化應(yīng)激乃至機(jī)體損傷顯示主要正相關(guān), 肌肉中脂肪酸變量PUFA、MUFA分別與氧化應(yīng)激乃至機(jī)體損傷顯示主要正相關(guān), 而肝胰臟中脂肪酸變量MUFA與氧化應(yīng)激乃至機(jī)體損傷顯示主要正相關(guān)[32,33]。相關(guān)性分析為我們揭示了, 草魚(yú)在越冬脅迫期間, 受到氧化應(yīng)激脅迫最大的3個(gè)組織與脂肪酸變量間產(chǎn)生的某種關(guān)聯(lián), 為越冬脅迫期間草魚(yú)機(jī)體脂肪酸劇烈變化的同時(shí), 將脂肪酸動(dòng)員與氧化應(yīng)激進(jìn)而機(jī)體的損傷聯(lián)系在一起, 提供了一條新的思路和見(jiàn)解。

圖5 越冬脅迫下草魚(yú)組織中脂質(zhì)過(guò)氧化與機(jī)體抗氧化能力間的關(guān)系示意圖Fig. 5 Relationship between lipid peroxidation and antioxidant capacity of grass carp under overwintering stress

4 結(jié)論

綜上所述, 草魚(yú)在越冬脅迫過(guò)程中, 生物學(xué)性狀變化的結(jié)果表明了草魚(yú)為了適應(yīng)越冬脅迫下能量動(dòng)員的需要采取了適應(yīng)性調(diào)節(jié), 同時(shí), 我們證明了越冬期間所有氧化脅迫應(yīng)激最大的3個(gè)組織分別是脂肪組織、肝胰臟和肌肉, 同時(shí)與越冬期間作為主要能量物質(zhì)消耗的脂肪酸間進(jìn)行了一種關(guān)聯(lián)性分析, 確定了幾種主要脂肪酸種類(lèi)(肝胰臟MUFA, 肌肉PUFA、MUFA, 脂肪組織SFA)在越冬期間對(duì)氧化應(yīng)激乃至機(jī)體損傷的直接相互聯(lián)系。本研究提供的基準(zhǔn)信息, 可用于制定有效的越冬脅迫期之前的投喂策略, 同時(shí)在越冬脅迫期間和越冬脅迫后的恢復(fù)階段, 做出適當(dāng)管理和精準(zhǔn)的投喂決策, 以期改善草魚(yú)越冬脅迫后的存活率和生產(chǎn)的效率。