醋酸法提取刺葡萄皮渣中花色苷的研究*

李 娜，蘇紫凌，謝鈺婷，蘇澤琳，林元山△

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)東方科技學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生科院，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

1 前言

刺葡萄屬東亞種群刺葡萄系列，為我國(guó)道地葡萄品種，風(fēng)味獨(dú)特，既可鮮食又可釀酒。湖南省懷化市、湘西州，貴州省銅仁市、凱里市，湖北省恩施等種植面積1.33萬(wàn)hm2以上[1]?；ㄉ帐瞧咸压ぶ兄饕噬狞S酮類(lèi)物質(zhì)，以C6-C3-C6 為基本骨架，以糖苷鍵與糖結(jié)合而成[2-3]。刺葡萄花色苷是天然色素，不僅食用安全，而且具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎癥的生物學(xué)功能[4-6]。刺葡萄經(jīng)釀造后的皮渣中含豐富的花色苷，若未加以處理，不僅造成資源浪費(fèi)，還會(huì)引起環(huán)境污染。為此，本研究探索簡(jiǎn)潔經(jīng)濟(jì)、環(huán)保友好的花色苷提取工藝，為刺葡萄釀造生產(chǎn)提供依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 材料

本試驗(yàn)選用刺葡萄高山2號(hào)品種的釀酒皮渣，葡萄產(chǎn)自湖南懷化市會(huì)同縣團(tuán)河鎮(zhèn)向陽(yáng)紫族葡萄專(zhuān)業(yè)合作社，經(jīng)80～90 d發(fā)酵后壓榨過(guò)濾葡萄酒而得，含水量約80%，密封后，-20 ℃冰箱冷藏備用。鹽酸，醋酸，乙酸乙酯，甲醇，乙醇，氯化鉀，無(wú)水乙酸鈉等試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

2.2 試驗(yàn)方法

2.2.1 確定提取條件

參照龍葵果花色苷的提取工藝條件[7]并作適當(dāng)調(diào)整，將高山2號(hào)刺葡萄釀酒皮渣，準(zhǔn)確稱取2.0 g釀酒皮渣若干份，葡萄皮渣與溶劑的固液比為1∶10（g∶mL），鹽酸5%用為浸提溶劑，在40 ℃條件下提取時(shí)間90 min為花色苷基本提取工藝，經(jīng)四層紗布過(guò)濾，采用pH示差法測(cè)定花色苷的含量。分別配制pH1.0、pH4.5的緩沖液，靜置15 min使其顯色穩(wěn)定，采用光程為1 cm的比色皿在510 nm、700 nm下測(cè)定吸光度，根據(jù)式（1）計(jì)算提取液中花色苷含量。

式中：ΔD=（D510～D700 nm）pH1.0－（D510～D700 nm）pH4.5，Mw、ε分別為葡萄中常見(jiàn)花色苷錦葵色素-3-葡萄糖苷的相對(duì)分子質(zhì)量和摩爾消光系數(shù)，其值均參照文獻(xiàn)，Mw=493.2 g/moL，ε=28 000 L/（moL·cm）；L為比色皿光程，其值為1 cm；N為樣品稀釋倍數(shù)。

2.2.2 花色苷提取的單因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在花色苷基本提取工藝條件下，分別以固液比（1∶8，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25）；提取溶劑種類(lèi)（水；鹽酸、醋酸、乙醇、乙酸乙酯、甲醇等濃度為5 %）；溫度（30℃～70℃）；提時(shí)間（30min，60min，90min，120min，150 min）；醋酸溶劑體積分?jǐn)?shù)（5%～30%）設(shè)計(jì)單因子試驗(yàn)處理，并計(jì)算花色苷的含量。

2.2.3 花色苷提取正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)參照單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇醋酸體積分?jǐn)?shù)、浸提溫度、浸提時(shí)間三因素三同水平上設(shè)計(jì)L9（33）正交試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)選，設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 刺葡萄酒渣提取花色苷的因素與水平設(shè)計(jì)

2.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2020軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 溶劑對(duì)花色苷浸提的影響

花色苷溶于水和多種極性溶劑，試驗(yàn)用蒸餾水和含量為5%不同溶劑進(jìn)行花色苷的浸提，結(jié)果見(jiàn)圖1，從圖1 可以看出，溶劑提取差異顯著（P＜0.05，下同）。溶劑對(duì)花色苷提取效果由大到小依次為：甲醇＞醋酸＞乙酸乙酯＞乙醇＞鹽酸＞水，其中醋酸和甲醇濃度下提取液的顏色為紫紅色，水、乙醇和鹽酸提取液顏色偏青綠色。5%的甲醇溶液和5%的醋酸溶液提取花色苷含量分別達(dá)3.75 mg/g、3.22 mg/L，其顯色度也較高?？紤]到甲醇的毒性、低濃度的醋酸的安全性以及環(huán)境清潔的持續(xù)性，故選取醋酸作為提取溶劑。食用醋的主要成分為乙酸，作為食用輔料的歷史悠久，已為廣大民眾接受，因此，本研究將進(jìn)一步探索醋酸提取葡萄皮渣中花色苷的條件。

圖1 溶劑對(duì)提取刺葡萄花色苷的影響

3.2 醋酸濃度對(duì)提取花色苷的影響

醋酸濃度對(duì)提取花色苷的影響見(jiàn)圖2。從圖2可以看出，醋酸在體積分?jǐn)?shù)5%～20%，花色苷含量隨著醋酸體積分?jǐn)?shù)的增大而增大，但是在超過(guò)20%的時(shí)候，花色苷含量開(kāi)始下降，醋酸濃度在15%～20%時(shí)，花色苷的含量無(wú)顯著差異，在體積分?jǐn)?shù)為15%、20%時(shí)，花色苷質(zhì)量濃度分別為為3.91 mg/L、3.99 mg/L，故選取15%體積分?jǐn)?shù)的醋酸溶液比較適宜。

圖2 醋酸體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取刺葡萄花色苷的影響

3.3 料液比對(duì)提取花色苷的影響

刺葡萄皮渣與溶劑的比例對(duì)花色苷浸提的影響結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，以15%醋酸為溶劑，浸提90 min，40 ℃條件下，料液為1∶8～1∶25，花色苷提取的濃度由3.52 mg/L逐漸降至1.69 mg/L，但花色苷提取總量由28.2 mg逐漸提升降至42.3 mg。料液比在1∶15～1∶25，花色苷提取總量差異不明顯，料液比在1∶15時(shí)，花色苷提取總量為38.7 mg，考慮到溶劑體積過(guò)大對(duì)后續(xù)工藝濃縮的負(fù)面影響，優(yōu)選料液比在1∶15為宜。

圖3 料液比對(duì)浸提花色苷的影響

3.4 提取溫度對(duì)提取花色苷的影響

花色苷為黃酮類(lèi)物質(zhì)，具有抗氧化的功能，在花色苷提取過(guò)程中與空氣接觸能發(fā)生氧氣反應(yīng)，溫度越高反應(yīng)越快。圖4顯示30 ℃～70 ℃溫度對(duì)提取花色苷的影響關(guān)系，溫度超過(guò)35 ℃，花色苷含量隨著溫度增加而減少，可能是溫度過(guò)高引起花色苷氧化，花色苷顏色偏暗。低于35 ℃時(shí)，可能花色苷溶解度偏低，35℃時(shí)，花色苷的含量達(dá)3.63 mg/L，此時(shí)提取溫度較佳。

圖4 溫度對(duì)花色苷浸提的影響

3.5 浸提時(shí)間對(duì)花色苷提取的影響

浸提時(shí)間對(duì)花色苷提取的含量影響結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知，浸提60 min時(shí)，花色苷含量最優(yōu)，達(dá)4.60 mg/L，隨著浸提時(shí)間延長(zhǎng)，花色苷還略有降低，花色苷不適宜長(zhǎng)時(shí)間浸提。

圖5 處理時(shí)間對(duì)提取花色苷的影響

3.6 刺葡萄釀酒皮渣提取花色苷的正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇醋酸體積分?jǐn)?shù)、浸提溫度、浸提時(shí)間三要素三水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，在料液比為1∶15的條件下，提取花色苷，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，因素A極差最大，其次是因素B，因素C影響最弱。影響刺葡萄酒渣提取花色苷因素順序?yàn)锳＞B＞C，這時(shí)，最優(yōu)處理組合為A3B2C3，但該組合未出現(xiàn)在處理中。經(jīng)驗(yàn)證，在料液比1∶15，醋酸體積分?jǐn)?shù)20%，提取溫度40 ℃，浸提時(shí)間60 min 條件下，花色苷含量達(dá)到率為5.18 mg/L，折算成刺葡萄皮渣干重的花色苷得到率為2.59‰。

表2 刺葡萄酒渣提取花色苷正交試驗(yàn)分析

4 討論與結(jié)論

花色苷中多酚羥基的結(jié)構(gòu)，具有抗氧化、清除自由基的功能。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中可觀察到花色苷在丙酮、醋酸乙酯等有機(jī)溶劑顯色為青綠色，在醋酸、鹽酸等酸性試劑下顯色紫紅，并隨著濃度的增大而顯色加深。國(guó)內(nèi)研究文獻(xiàn)主要用鹽酸、甲醇等溶劑提取花色苷，鮮見(jiàn)醋酸在花色苷方面的提取應(yīng)用[9]。本研究發(fā)現(xiàn)醋酸提取刺葡萄皮渣的花色苷提取效率優(yōu)于鹽酸，其安全性優(yōu)于甲醇，這可為刺葡萄的花色苷在食品、保健、藥物的應(yīng)用方面提供安全保障，同時(shí)減輕了工業(yè)化應(yīng)用時(shí)的環(huán)境污染壓力。

刺葡萄在湖南懷化、吉首、邵陽(yáng)等地屬于土著品種，具有“皮厚肉少色素多”的特征，藥食安全且歷史悠久，非常適合釀造半甜型、甜型葡萄酒[10]。本研究中使用的高山2號(hào)刺葡萄，花色苷含量高，經(jīng)醋酸工藝浸提，醋酸體積分?jǐn)?shù)15%，料液比1∶15，提取溫度40 ℃，浸提60 min，花色苷得率達(dá)259.00 mg/100 g，優(yōu)于藍(lán)莓花色苷得率207.39 mg/100 g[11]。這為刺葡萄釀酒皮渣中花色苷的大規(guī)模應(yīng)用提供了理論支持。