蘋果醋活性成分總黃酮和總多酚生物活性機制研究

閆慧君，韓玉彬

(1.河南財政金融學院，鄭州 450046；2.河南理工大學，河南 焦作 454000)

在我國傳統(tǒng)的食醋中，醋類產(chǎn)品的加工主要以糧食為主，其乳酸的含量高[1-2]，產(chǎn)出和投入的比例相對較小，根據(jù)統(tǒng)計結(jié)果，我國每年消耗大量糧食用于生產(chǎn)食醋[3]。如果每年將剩余的大量蘋果均用于生產(chǎn)蘋果醋，那么蘋果醋不僅可以被當作食用調(diào)味醋的一種替代品，而且能夠減少糧食的浪費。

酚類化合物是指芳香烴化合物的苯環(huán)上，一個氫原子被羥基所替代的化合物，根據(jù)所替換羥基的數(shù)量，酚類化合物又可以分為一元酚和多元酚兩類，由于酚類物質(zhì)的生物學功效，越來越多的酚類物質(zhì)被發(fā)現(xiàn)和利用，而蘋果醋中粗提取的酚類化合物也被統(tǒng)稱為總多酚[4]。

黃酮類化合物是指2個苯環(huán)通過3個碳原子連接之后形成的一系列化合物，這類化合物的顏色一般都呈現(xiàn)黃色或者淡黃色，從蘋果醋中粗提取的總黃酮主要包括黃酮、異黃酮、花色素、二氫黃酮和黃酮醇等多種酮類化合物[5]。

發(fā)達國家的蘋果醋工業(yè)發(fā)展相對較為迅速，在歐美地區(qū)，平均每人每年消耗2 L的醋類產(chǎn)品[6]。而我國的蘋果醋產(chǎn)業(yè)起步相對較晚，主要集中于研究蘋果醋制作過程中的菌種篩選、成分測定和工藝優(yōu)化。在蘋果醋產(chǎn)品的研究和開發(fā)方面尚存在很多不足[7-8]。

為了研究蘋果醋作為功能飲品所發(fā)揮的作用，通過粗提取蘋果醋中總多酚和總黃酮，研究蘋果醋中總多酚和總黃酮的抗疲勞功效，旨在為蘋果醋產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗試劑盒材料

蘋果醋、大孔吸附樹脂LS-46、XDA-8和HPD-600、無水乙醇、硝酸鈉、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、福林酚、碳酸鈉、鹽酸、硫酸亞鐵、鄰苯三酚、三氧化鐵、三氧化鋁、冰醋酸、鈉石灰、肌糖原和肝糖原試劑盒歧化酶。

1.2 試驗儀器

紫外分光光度計、電子稱、精密pH計、粉碎機、恒溫水浴鍋、臺式離心機、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)機、烘箱、真空泵、電子天平、萬能爐。

1.3 試驗方法

1.3.1 蘋果醋加工工藝流程

蘋果→洗凈→粉碎→酒精發(fā)酵→醋酸發(fā)酵→加熱→過濾→離心→調(diào)味→精細過濾→灌裝→殺菌。

1.3.2 蘆丁標準液體的制作

將蘆丁標準品放于烘箱中干燥，一直到重量不減少為止，之后準確稱取109.1 mg蘆丁標準液，放于100 mL的容量瓶中，加入濃度為30%的乙醇溶液，使蘆丁標準品完全溶解，放置5 min，待溶液的溫度降至室溫，再加入30%的乙醇溶液，將其搖勻，制成蘆丁標準溶液，待用[9-10]。

為了獲得最佳吸收波長的吸光度，準備350～700 nm的蘆丁標準溶液，將最大吸收峰的波長作為測定波長。將蘋果醋樣品取10 mL放于燒杯中，添加少量濃度為30%的無水乙醇，將其移動至50 mL的容量瓶中，按照上述方法對樣品進行測定。根據(jù)標準曲線對方程中的總黃酮進行測定[11]。

1.3.3 總多酚含量測定

將沒食子酸標準品放于烘箱中烘干至恒定重量，然后稱取沒食子酸0.11 g，將其放置于100 mL的容量瓶中，再添加水至容量瓶中，將沒食子酸溶液進行稀釋，搖勻后待用[12-13]。

使用移液槍，將1，2，3，4，5 mL的沒食子酸加入5個100 mL的容量瓶中，再添加去離子水，將水添加至刻度處，獲得不同濃度的沒食子酸標準液，待用[14]。

為了在最佳的波長條件下進行吸光度的測定，準備100 mL沒食子酸的標準溶液，在測定波長為500～900 nm條件下，尋找最大的吸收峰，將最大吸收峰的波長作為測定波長[15]。

取10 mL的蘋果醋溶液，將其移至燒杯中，加入10%的福林酚試劑5 mL，混勻，放置5～8 min，使其發(fā)生生化反應，之后加入7%的碳酸鈉2 mL，將其稀釋至容量瓶的刻度，在波長為500～900 nm的條件下測定其吸光值[16-17]。

1.3.4 大孔吸附樹脂的預處理

將3種大孔吸附樹脂LS-46、XDA-8和HPD-600分別進行裝柱。先用4%的氫氧化鈉溶液對樹脂柱進行清洗，一般清洗液大致為樹脂柱的3倍，清洗時，大孔吸附樹脂柱的流速為1 BV/h。當大孔吸附樹脂中的氫氧化鈉溶液全部通過樹脂柱時，一直到大孔吸附樹脂柱中的體積下降至20 mm高度，將其放置在環(huán)境中2 h，采用去離子水將氫氧化鈉沖洗干凈[18]。之后按照上述方法，用體積為3倍的鹽酸、濃度為4%的溶液對大孔吸附樹脂柱進行沖洗，鹽酸的溶液面保持在大孔吸附樹脂上界面20 mm的高度，放置2 h，用純水將其沖洗干凈。最后使用3倍體積的95%無水乙醇按照上述方法對其進行沖洗，乙醇保留20 mm，為了防止大孔吸附樹脂柱干涸，大孔吸附樹脂預處理完成。

1.3.5 大孔吸附樹脂的吸附率

將處理完成后的LS-46、XDA-8和HPD-600 3種吸附柱，準確量取20 mL的蘋果醋溶液，將其裝入150 mL的錐形瓶中。將EUE配制成200 mg/mL的水溶液，將其作為吸附液使用。加入100 mL待測物質(zhì)于錐形瓶中，將其放置在25 ℃的水溫中，用搖床振蕩12 h，之后將其取出，然后測定吸附液中的總黃酮和總多酚[19]，根據(jù)下式進行計算：

吸附率(%)=(x1-x2)/x1。

式中：x1表示樣品吸附前總多酚和總黃酮總質(zhì)量；x2表示樣品吸附后總多酚和總黃酮總質(zhì)量。

1.3.6 大孔吸附樹脂的解吸率

將3種經(jīng)過處理的LS-46、XDA-8和HPD-600吸附樹脂裝入層析柱中。將EUE配制成濃度為200 mg/mL的水溶液上柱液，計算上柱液中總黃酮和總多酚的含量。上柱液的體積控制在100 mL，以1 mL/min的速度進行洗脫，收集各個濃度的洗脫液，之后靜置。使用樹脂靜態(tài)吸附，調(diào)節(jié)吸附時間為10 h，然后測定吸附前樹脂中的粗提取物總黃酮和總多酚含量，再使用純凈水將其沖洗至無色。用濃度為20%、40%、60%和80%的無水乙醇對脫樹脂進行洗脫，收集各個濃度條件下的洗脫液，并測定洗脫液中總多酚和總黃酮的量。根據(jù)下式計算總黃酮和總多酚的解吸率。

解吸率(%)=M2/(M1-M)。

式中：M2為吸附前總黃酮和總多酚類物質(zhì)的總量；M1為吸附后總黃酮和總多酚類物質(zhì)的總量；M為洗脫液中總黃酮和總多酚的物質(zhì)總量。

1.3.7 試驗動物小鼠的飼養(yǎng)

小鼠在飼養(yǎng)之前，均要對其進行稱重，體重差異不明顯的小鼠均被隨機分配，分為3個小組，每個小組10只小鼠。

1.3.8 血乳酸(LA)測定試驗

胃灌小鼠1 h之后，每個小組隨機抽取5只小鼠，在小鼠的尾尖1 cm處，用棉繩系體重4%的橡皮泥。將小鼠放于水深30 cm，溫度為室溫(25 ℃左右)，讓其游泳30 min，之后立即在小鼠的眼球部位取血，利用LA試劑盒對小鼠中的乳酸進行測定。

1.3.9 統(tǒng)計分析方法

數(shù)據(jù)均采用平均數(shù)±標準差，采用T-檢驗法，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 大孔吸附樹脂的吸附率

樹脂對某種成分的吸附率越高，則表示這種選擇性吸附的效果越高，吸收該種成分越有利，但是對于樹脂而言，并不是吸附效率越高越好，需要結(jié)合這種成分的洗脫效果進行解吸率的分析，只有當吸附率和解吸率均存在一個合適的范圍，才更有利于分離該成分。

2.2 大孔吸附樹脂的解吸率

樹脂吸附成分之后，需要經(jīng)過洗脫的工序，對該成分的解吸率越好，則表示這種樹脂的解吸效果越好，更加有利于分離和解吸。只有當吸附率達到一定的程度，才能更好地被樹脂吸收，此時的解吸才有一定的意義，需要同時研究樹脂的吸附率和解吸率，才能獲得最適合蘋果醋粗分離總黃酮和總多酚的條件。3種脂類和不同乙醇濃度對蘋果醋中總黃酮和總多酚的吸附率的影響見表1和表2。

表1 吸附樹脂對蘋果醋中粗提取物總黃酮和總多酚吸附效果的影響

表2 不同乙醇濃度和不同樹脂類型對蘋果醋中粗提取物總多酚和總黃酮解吸效果的影響

由表1和表2可知，不同的樹脂對蘋果醋中總黃酮和總多酚的吸附率和解吸率均存在一定的影響，綜合總黃酮和總多酚得率，選擇XDA-8樹脂對蘋果醋中的總多酚和多糖進行分離。由表2可知，當使用濃度較低的乙醇濃度進行提純時，獲得的粗提取物主要以多酚類為主；當使用濃度較高的乙醇進行提純時，獲得的粗提取物主要以黃酮類為主。

2.3 不同酒精濃度對蘋果醋粗提取物總多酚和總黃酮的影響

由圖1可知，不同的酒精濃度對蘋果醋中粗提取物總黃酮和總多酚的影響不同。無論是黃酮類還是多酚類化合物，在提取的過程中，均隨著酒精濃度的升高而呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。當酒精濃度達到20%時，蘋果醋中的黃酮類化合物提取率最高。當酒精濃度為0%～20%時，黃酮類的提取率隨著酒精濃度的升高而升高，當酒精的濃度大于20%時，蘋果醋中黃酮類化合物隨著酒精濃度的升高而逐漸降低。對于總多酚而言，當酒精濃度為60%時，蘋果醋中的總多酚提取量最高，為43%。當酒精濃度小于60%時，總多酚的含量隨著酒精濃度的升高而逐漸增高。當酒精濃度大于60%時，總多酚的含量隨著酒精濃度的升高而逐漸降低。而當酒精濃度為20%時，總混合液中總多酚和總多糖的粗提取量相同。所以，對蘋果醋中多酚類化合物采用60%的酒精濃度進行洗脫，黃酮類化合物采用20%的酒精進行洗脫。

圖1 不同酒精濃度對蘋果醋粗提取物總多酚和總黃酮含量的影響

2.4 蘋果醋粗提取物的抗疲勞功效

2.4.1 蘋果醋粗提取物總多酚和總黃酮對小鼠體重的影響

飼喂小鼠前后對小鼠體重的影響見圖2。

圖2 蘋果醋粗提取物總黃酮和總多酚對小鼠體重的影響

由圖2可知，灌胃小鼠蘋果醋總黃酮、總多酚化合物和去離子水前后，小鼠體重增長的程度一致。說明無論是蘋果醋中的總多酚還是總黃酮對小鼠的體重增長并沒有明顯影響，蘋果醋中的粗提取物總多酚和總黃酮并未以增加小鼠體重的方式來增強小鼠的抗疲勞作用。

2.4.2 蘋果醋粗提取物總多酚和總黃酮對小鼠游泳時間的影響

蘋果醋中粗提取物總多酚和總黃酮對小鼠游泳時間的影響見圖3。

圖3 蘋果醋粗提取物總多酚和總黃酮對小鼠游泳時間的影響

由圖3可知，無論是飼喂小鼠總多酚還是總多糖，小鼠的游泳時間均有增長。當飼喂小鼠蒸餾水作為空白對照時，小鼠的游泳時長為40 min；當飼喂小鼠總多酚時，小鼠的游泳時長為70 min；當飼喂小鼠總黃酮時，小鼠的游泳時間為55 min。說明無論是飼喂小鼠蘋果醋中的總多酚還是總黃酮，對小鼠的游泳時間均有一定程度的提高。試驗結(jié)果明顯表明飼喂小鼠蘋果醋中粗提取物總多酚和總黃酮都具有一定的抗疲勞功效，且飼喂總多酚的小鼠抗抗疲勞效果強于飼喂總黃酮的小鼠。

2.4.3 蘋果醋粗提取物總黃酮和總多酚對小鼠血LA的影響

蘋果醋中粗提取物總多酚和總多糖對小鼠血中LA含量的影響見圖4。

圖4 蘋果醋粗提取物對小鼠血中LA含量的影響

由圖4可知，飼喂小鼠總多酚和總多糖均能明顯降低小鼠體內(nèi)的血LA含量，差異性顯著性小于0.05，但是總黃酮的抗疲勞能力小于總多酚的抗疲勞能力。蘋果醋中的粗提取物總多酚和總多糖能夠降低小鼠體內(nèi)血清中的乳酸含量。小鼠在劇烈的運動過程中，蘋果醋中的多酚類和黃酮類化合物在無氧的條件下能夠進行糖酵解代謝，從而產(chǎn)生大量的乳酸，這些乳酸在機體內(nèi)如果不能被及時清理干凈，則會堆積在機體內(nèi)，造成機體內(nèi)pH降低，從而引起機體各個方面的不協(xié)調(diào)和不平衡，引發(fā)機體的疲勞。蘋果醋中的粗提取物總多酚和總黃酮能夠減少機體內(nèi)乳酸的產(chǎn)生，加速機體的代謝，最終降低機體乳酸，減緩機體疲勞。

3 小結(jié)

近些年，我國對蘋果醋的研究越來越深入。同時，蘋果醋也是新一代的調(diào)味品，它富含鉀、鋅等多種微量元素、維生素、有機酸和人體必需的氨基酸。這些物質(zhì)具有降低人體膽固醇、血脂，增強機體免疫能力，促進血液循環(huán)，抑制血糖能力和增強消化能力等多種生物活性功能。通過研究發(fā)現(xiàn)，蘋果醋中的粗提取物總多酚和總黃酮的最佳提取工藝為：吸附樹脂為XDA-8，多酚類化合物采用60%的酒精濃度進行洗脫，黃酮類化合物采用20%的酒精濃度進行洗脫，為以后蘋果醋的開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。