辣椒油樹(shù)脂揮發(fā)性成分分析及其抗氧化活性研究

王瑩瑩，汪學(xué)德，王東營(yíng)，苗紅梅

(1.河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，鄭州 450001；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院芝麻研究中心，鄭州 450002；3.河南省特色油料作物基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院芝麻研究中心)，鄭州 450002)

辣椒(CapsicumannumL.)，又名牛角椒，為茄科辣椒屬草本類(lèi)植物，原產(chǎn)于中南美洲[1]，在明朝時(shí)期引入我國(guó)，現(xiàn)大量種植于我國(guó)新疆、云南、貴州等地[2]。目前，我國(guó)已經(jīng)成為世界最大的辣椒生產(chǎn)國(guó)、出口國(guó)、消費(fèi)國(guó)[3]。辣椒油樹(shù)脂(capsicum oleoresin)又稱(chēng)辣椒精、辣椒精油，通常是用有機(jī)溶劑索氏抽提后經(jīng)真空濃縮得到的深紅色黏稠狀的液體，氣味辛辣，流動(dòng)性較小，不溶于水，易溶于丙酮、正己烷、石油醚等有機(jī)溶劑[4]。辣椒油樹(shù)脂中含有辣椒色素類(lèi)物質(zhì)(如辣椒紅色素、辣椒黃素、辣椒玉紅素等)，以及大量的辣椒堿類(lèi)物質(zhì)(如高辣椒堿、二氫辣椒堿)[5]。辣椒堿是辣椒油樹(shù)脂中的辛辣物質(zhì)，用來(lái)提供辣味[6]。辣椒油樹(shù)脂可應(yīng)用于食品行業(yè)與精細(xì)化工領(lǐng)域。在食品中，辣椒油樹(shù)脂主要用于生產(chǎn)日用調(diào)味料(如火鍋底料、辣椒油等)以及腌制、調(diào)理食品中。辣椒油樹(shù)脂也可進(jìn)一步用于提取辣椒紅色素與辣椒堿等精細(xì)化工產(chǎn)品。

截至目前，學(xué)者們對(duì)于辣椒油樹(shù)脂的研究多集中于對(duì)其提取與純化工藝的優(yōu)化。在辣椒油樹(shù)脂組成成分方面，劉佳等[7]以海南黃燈籠辣椒為原料，優(yōu)化了超臨界CO2法提取辣椒油樹(shù)脂的工藝條件，并運(yùn)用GC-MS對(duì)樹(shù)脂的化學(xué)成分進(jìn)行了分析。在辣椒油樹(shù)脂抑菌及抗氧化活性方面，范三紅等[8]以市售干紅辣椒為原料，采用超聲輔助法提取了辣椒油樹(shù)脂，并以瓊脂打孔法和自由基清除試驗(yàn)研究樹(shù)脂的抑菌效果和抗氧化能力。然而，在辣椒油樹(shù)脂化學(xué)成分及其表現(xiàn)出的抗氧化活性關(guān)聯(lián)方面研究報(bào)道較少。

因此，為進(jìn)一步探明辣椒油樹(shù)脂的化學(xué)成分與抗氧化活性之間的關(guān)聯(lián)，本文以貴州干紅辣椒為原料，提取了辣椒油樹(shù)脂，采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，分析了辣椒油樹(shù)脂中的揮發(fā)性化學(xué)成分，并對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行了探究。該研究為辣椒油樹(shù)脂的高效利用提供了理論和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

干紅辣椒(貴州條椒)：購(gòu)于淘寶商城線(xiàn)上超市。

1.2 試劑

鹽酸、三氯化鐵、甲醇(均為分析純)：天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical, DPPH)：美國(guó)Sigma公司；2,4,6-三吡啶基三嗪(2,4,6-Tri(2-pyridyl)-s-triazine, TPTZ)、2,2′-聯(lián)氮-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(2,2′-Azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate),ABTS)：阿拉丁試劑有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

AL204電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；UV-6000PC紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；KQ-300DE超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；DZKW-S-4電熱恒溫水浴鍋 北京市永光明醫(yī)療器械有限公司；DVB-CAR-PDMS手動(dòng)固相微萃取(SPME)進(jìn)樣器 美國(guó)Sigma公司；7890B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)Agilent公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 辣椒油樹(shù)脂提取及揮發(fā)性成分分析

選用鮮干紅辣椒，去蒂除籽后，采用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)40目篩。稱(chēng)取80 g辣椒粉末，以丙酮為提取溶劑，進(jìn)行索氏抽提，將提取液減壓蒸餾，得到的暗紅色黏稠狀液體即為辣椒油樹(shù)脂。

1.4.1.1 萃取方法

將3 g辣椒油樹(shù)脂置于20 mL頂空瓶中，放入50 ℃水浴中平衡30 min；頂空萃取20 min，在氣相色譜儀進(jìn)樣口熱解吸5 min；隨后進(jìn)行GC-MS分析。

1.4.1.2 色譜條件

色譜柱為HP-5MS 毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)和VF-WAX MS氣相色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)。升溫程序：起始溫度40 ℃，在40 ℃條件下保持3.5 min，以4 ℃/min的速率升溫到230 ℃，保持8 min；以10 ℃/min 的速率升溫至280 ℃，保持5 min。四級(jí)桿溫度為150 ℃；載氣為高純氦氣，流速為1.8 mL/min。

1.4.1.3 質(zhì)譜條件

電子轟擊(EI)離子源，電子能量 70 eV，傳輸線(xiàn)溫度 280 ℃，離子源溫度 230 ℃，四級(jí)桿溫度 150 ℃，質(zhì)量掃描范圍(m/z)30～500，全掃描采集模式。

1.4.1.4 數(shù)據(jù)處理

采用 Agilent MSD化學(xué)工作站，將辣椒油樹(shù)脂揮發(fā)性成分的GC-MS譜圖與Agilent NIST 17質(zhì)譜庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。根據(jù)匹配度(≥80)和保留指數(shù)定性，并利用面積歸一化法計(jì)算每種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相對(duì)百分含量。

1.4.2 辣椒油樹(shù)脂抗氧化活性測(cè)試

1.4.2.1 DPPH自由基清除率測(cè)定

參照Ma等[9]的方法并稍加改動(dòng)，測(cè)定DPPH自由基清除率。將辣椒油樹(shù)脂與甲醇溶液混合，配制成不同濃度的辣椒油樹(shù)脂溶液(0.6，1.2，1.8，2.4，3.0 mg/mL)。隨后，將0.5 mL不同濃度的辣椒油樹(shù)脂溶液與3 mL 0.2 mmol/L的DPPH-甲醇溶液混合均勻后避光反應(yīng)30 min。采用分光光度計(jì)在517 nm處測(cè)定吸光度值(Asample)。甲醇溶液作為背景(Abackground)，以去除辣椒油樹(shù)脂本身顏色對(duì)吸光度值的干擾?？瞻捉M為一級(jí)水(Ablank)，陽(yáng)性對(duì)照為抗壞血酸(VC，100 μg/mL)。按下式計(jì)算DPPH·清除率：

DPPH·清除率(%)=[1-(Asample-Abackground)/Ablank]×100。

1.4.2.2 ABTS+自由基清除率測(cè)定

參考Pang等[10]的方法并稍加改動(dòng)，測(cè)定ABTS自由基清除率。將ABTS與磷酸緩沖鹽(PBS)溶液混合配制成7 mmol/L ABTS母液。將10 mL ABTS母液與178 μL 140 mmol/L過(guò)硫酸鉀溶液混合，避光反應(yīng)12～16 h，即為ABTS儲(chǔ)備液。

測(cè)定時(shí)，用PBS溶液稀釋ABTS儲(chǔ)備液，使ABTS反應(yīng)液的吸光度在0.7±0.05。溶液配制完成后，將0.1 mL不同濃度的辣椒油樹(shù)脂溶液(0.6，1.2，1.8，2.4，3.0 mg/mL)與3.9 mL ABTS反應(yīng)液混合，避光條件下反應(yīng)10 min。使用分光光度計(jì)測(cè)量混合液在734 nm處的吸光度。一級(jí)水作為空白(Ablank)，抗壞血酸(VC，100 μg/mL)作為陽(yáng)性對(duì)照。按下式計(jì)算ABTS+·清除率：

ABTS+·清除率(%)=(1-Asample/Ablank)×100。

1.4.2.3 總還原能力測(cè)定

參照Srivastava等[11]的方法并稍加改動(dòng)，測(cè)定總還原力。吸取1 mL不同濃度的辣椒油樹(shù)脂溶液(0.6，1.2，1.8，2.4，3.0 mg/mL)，依次加入1 mL 0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 6.6)和1 mL 1%鐵氰化鉀溶液(K3[Fe(CN)6])，劇烈搖晃，使其混合均勻。50 ℃條件下水浴20 min，加入1 mL 10%三氯乙酸，3500 r/min離心10 min。取上清液1.5 mL，依次加入1.5 mL一級(jí)水和0.15 mL 0.1%的FeCl3，繼續(xù)反應(yīng)10 min。采用分光光度計(jì)在700 nm處測(cè)定吸光度值，以抗壞血酸(VC，100 μg/mL)作為陽(yáng)性對(duì)照。吸光度值表明還原能力的大小。

1.4.2.4 總抗氧化能力測(cè)定

根據(jù)Xu等[12]的方法測(cè)定鐵離子還原能力(Ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP)。將FeCl3·6H2O(20 mmol/L)、TPTZ(10 mmol/L)和HCl(40 mmol/L)與乙酸鹽的緩沖液(300 mmol/L，pH 3.6)按照1∶1∶10的比例混合來(lái)制備FRAP反應(yīng)液。首先將FRAP反應(yīng)液加熱至37 ℃，然后將0.1 mL不同濃度的辣椒油樹(shù)脂溶液(0.6，1.2，1.8，2.4，3.0 mg/mL)與3 mL FRAP工作液和0.3 mL一級(jí)水混合，混合液反應(yīng)4 min。使用分光光度計(jì)測(cè)量混合液在593 nm處的吸光度值。以抗壞血酸(VC，100 μg/mL)為陽(yáng)性對(duì)照。根據(jù)上述方法，用Fe2+標(biāo)準(zhǔn)溶液代替樣品，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(R2=0.9959)。精確計(jì)算FRAP值，校準(zhǔn)曲線(xiàn)為每升該濃度辣椒油樹(shù)脂樣品的毫摩爾Fe2+當(dāng)量。

1.4.2.5 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2016記錄和分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用GraphPad Prism 8.0軟件繪圖。

如圖5所示，基于流體力學(xué)理論，采用有限元方法，建立二維幾何模型來(lái)模擬毫秒激光對(duì)鋁板的打孔過(guò)程。為簡(jiǎn)化計(jì)算過(guò)程，對(duì)模型提出如下假設(shè)：1) 將計(jì)算中涉及的流體作為不可壓縮牛頓流體處理；2) 將金屬蒸氣作為理想氣體處理，且對(duì)于入射的激光無(wú)影響；3) 鋁液的沸點(diǎn)不受其他因素影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒油樹(shù)脂揮發(fā)性化學(xué)成分分析

為明確辣椒油樹(shù)脂中的揮發(fā)性化學(xué)成分，對(duì)提取所得辣椒油樹(shù)脂進(jìn)行了HS-SPME-GC-MS分析。通過(guò)Agilent MSD化學(xué)工作站，將辣椒油樹(shù)脂揮發(fā)性成分的GC-MS 譜圖與Agilent NIST 17標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)質(zhì)譜庫(kù)進(jìn)行比對(duì)鑒定，根據(jù)匹配度(≥80)和保留指數(shù)定性，并利用面積歸一化法計(jì)算每種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相對(duì)百分含量。結(jié)果顯示，從貴州條椒樣本中鑒定出了47種化合物，見(jiàn)表1。分別包括15種烷烴類(lèi)化合物、13種萜烯類(lèi)化合物、9種酯類(lèi)化合物、5種醛類(lèi)化合物、3種醇類(lèi)化合物，以及2種呋喃類(lèi)化合物。

表1 辣椒油樹(shù)脂化學(xué)成分及相對(duì)含量表

2.2 辣椒油樹(shù)脂體外抗氧化活性

2.2.1 DPPH自由基清除率

DPPH基團(tuán)具有單電子，是以氮為中心的一種穩(wěn)定自由基，其甲醇溶液呈紫色，在517 nm處有強(qiáng)吸收[13]。抗氧化劑可使體系褪色，從而減小吸光度值。因此DPPH·清除率可通過(guò)吸光度值的變化進(jìn)行分析。

用不同濃度的辣椒油樹(shù)脂溶液對(duì)DPPH·清除率進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 辣椒油樹(shù)脂清除DPPH·能力

由圖1可知，隨著辣椒油樹(shù)脂濃度的增大(0.6～3.0 mg/mL)，辣椒油樹(shù)脂對(duì)DPPH·的清除率逐步提升。當(dāng)辣椒油樹(shù)脂濃度為0.6 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH·的清除率為21.1%。當(dāng)濃度達(dá)到3.0 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH·的清除率達(dá)到了78.0%，并接近VC的作用效果(清除率為94.8%)。

2.2.2 ABTS自由基清除率

ABTS是測(cè)定親脂性和親水性物質(zhì)抗氧化能力的一種間接方法，氧化后生成的藍(lán)綠色ABTS+·可溶于水相及醇溶液中，在734 nm處有最大吸收峰[14]。樣品中的抗氧化成分可與ABTS+·反應(yīng)而使體系褪色，因此可根據(jù)吸光度值的變化計(jì)算出ABTS+·自由基清除率。

用不同濃度的辣椒油樹(shù)脂溶液對(duì)ABTS+·清除率進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 辣椒油樹(shù)脂清除ABTS+ ·能力

由圖2可知，辣椒油樹(shù)脂清除ABTS+·的能力隨著濃度的升高而升高，在濃度為1.8 mg/mL時(shí)辣椒油樹(shù)脂對(duì)ABTS+·的清除率為39.8%，超過(guò)了VC對(duì)該自由基的清除率(39.4%)；在濃度為3.0 mg/mL時(shí)辣椒油樹(shù)脂對(duì)ABTS+·的清除率可達(dá)67.9%。

2.2.3 總還原力測(cè)定

還原力是以普魯士藍(lán)(Fe4[Fe(CN)6]3)的生成量為指標(biāo)，樣品中的抗氧化成分將Fe3+還原為Fe2+，再與FeCl3反應(yīng)生成普魯士藍(lán)，在700 nm處有最大吸收峰[15]。因此，樣品還原力可通過(guò)吸光度值的變化進(jìn)行分析。

對(duì)不同濃度辣椒油樹(shù)脂的總還原力進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 辣椒油樹(shù)脂總還原力

由圖3可知，辣椒油樹(shù)脂總還原能力隨著濃度的升高而升高，在濃度為0.6 mg/mL時(shí)，辣椒油樹(shù)脂顯示出的還原能力較低，為0.30。當(dāng)濃度達(dá)到3.0 mg/mL時(shí)，辣椒油樹(shù)脂的還原力為0.81。與對(duì)照VC相比，辣椒油樹(shù)脂的還原能力相對(duì)較差。

2.2.4 總抗氧化能力測(cè)定

FRAP(Ferric ion reducing antioxidant power)是一種在低pH條件下利用Fe2+與TPTZ生成藍(lán)紫色復(fù)合物(在593 nm處有強(qiáng)吸收)來(lái)測(cè)定樣品抗氧化能力的方法，廣泛運(yùn)用于食品的抗氧化能力分析[16]。

首先建立Fe2+溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(Y=0.9536X-0.0686，R2=0.9959)，用于精確計(jì)算FRAP值。隨后，檢測(cè)不同濃度辣椒油樹(shù)脂溶液的總抗氧化能力，見(jiàn)圖4。

圖4 辣椒油樹(shù)脂總抗氧化能力

由圖4可知，辣椒油樹(shù)脂總抗氧化能力隨著濃度的增大而升高，在濃度為1.8 mg/mL時(shí)，F(xiàn)RAP值為0.51 mmol/L，已高于VC的總抗氧化能力(0.46 mmol/L)；在濃度為3.0 mg/mL時(shí)辣椒油樹(shù)脂的FRAP值為0.77 mmol/L。

3 結(jié)論

本研究鑒定出了辣椒油樹(shù)脂中47種揮發(fā)性化學(xué)成分，其主要化學(xué)成分(相對(duì)含量高于1.0%)為：甲基戊酮醇(27.56%)、苯乙醛(15.05%)、糠醛(8.89%)、香橙烯(6.75%)、茴香腦(5.89%)、苯甲醛(5.48%)、γ-丁內(nèi)酯(4.55%)、2-甲基十三烷(3.20%)、檸檬烯(2.57%)、月桂烯(2.05%)、癸烷(1.87%)、2-甲基四癸烷(1.26%)、(E)-β-羅勒烯(1.22%)、(2S,3S)-2,3-丁二醇(1.16%)、十一烷(1.10%)、2-甲基-1-十四碳烯(1.10%)共16種物質(zhì)，占揮發(fā)性成分總量的89.70%。同時(shí)，在體外抗氧化活性測(cè)試中確定了辣椒油樹(shù)脂具有良好的自由基清除能力、總還原能力及總抗氧化能力。

4 討論

本文在貴州條椒的辣椒油樹(shù)脂中檢測(cè)出了47種揮發(fā)性化學(xué)成分，包括烷烴類(lèi)、萜烯類(lèi)、酯類(lèi)、醛類(lèi)、醇類(lèi)以及呋喃類(lèi)化合物。其主要組成成分及相對(duì)含量與已報(bào)道的樣本存在一定的差異。例如：李洪福等[17]采用GC-MS分析了海南黃燈籠辣椒提取物的化學(xué)成分，結(jié)果表明辣椒提取物的成分為脂肪酸類(lèi)、酰胺類(lèi)、烷烴類(lèi)、甾醇類(lèi)以及維生素類(lèi)化合物。紀(jì)良霞等[18]采用GC-MS對(duì)廣西指天椒的乙酸乙酯提取物進(jìn)行了成分分析，其主要組成成分為脂肪酸類(lèi)、辣椒堿類(lèi)、酯類(lèi)、醇類(lèi)以及呋喃類(lèi)化合物。劉艷敏等[19]采用HS-SPME-GC-MS對(duì)貴州油辣椒中的揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行了分析，其主要組成成分為萜烯類(lèi)、醛類(lèi)、酯類(lèi)、醇類(lèi)、酮類(lèi)、烷烴類(lèi)、呋喃類(lèi)、吡嗪類(lèi)、吡咯類(lèi)和芳香烴類(lèi)化合物。本試驗(yàn)從辣椒油樹(shù)脂中鑒定出的相對(duì)含量最高的2種化合物為甲基戊酮醇(27.56%)、苯乙醛(15.05%)，屬于醛類(lèi)和醇類(lèi)化合物，這可能與所選用的辣椒樣本、辣椒油樹(shù)脂提取方法及成分分析方法有關(guān)。下一步將增加樣本基因型，并對(duì)提取方法和分析方法進(jìn)行比對(duì)，以進(jìn)一步明確影響辣椒油樹(shù)脂主要組成成分的因素。

此外，體外抗氧化測(cè)試結(jié)果證實(shí)了辣椒油樹(shù)脂具備良好的抗氧化活性，該結(jié)果與以往其他類(lèi)似研究結(jié)果較為相似。Tepe等[20]研究發(fā)現(xiàn)含有單萜化合物或者倍半萜的精油一般可表現(xiàn)出較好的抗氧化活性。Ruberto等[21]研究認(rèn)為單萜烯類(lèi)化合物表現(xiàn)出的抗氧化活性源自其中含有活潑的亞甲基基團(tuán)，如α-蒎烯、檸檬烯、γ-松油烯、茴香烯等。本文中辣椒油樹(shù)脂化學(xué)成分分析結(jié)果顯示，單萜類(lèi)物質(zhì)在辣椒油樹(shù)脂中的含量較高，該類(lèi)物質(zhì)對(duì)自由基具有良好的清除作用，因此，辣椒油樹(shù)脂表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性。相比于抗壞血酸(VC)，辣椒油樹(shù)脂的自由基清除活性與還原力要低一些，這可能與辣椒油樹(shù)脂的純度不夠有關(guān)。但是抗壞血酸作為一種強(qiáng)抗氧化劑，天然提取物抗氧化能力存在遜色于抗壞血酸的情況，這在周江菊等[22]對(duì)樗葉花椒葉精油的抗氧化活性測(cè)定中也有體現(xiàn)。

今后將對(duì)辣椒油樹(shù)脂化學(xué)成分與抗氧化能力之間的相關(guān)關(guān)系進(jìn)一步開(kāi)展研究，為揭示辣椒風(fēng)味油脂的氧化穩(wěn)定性及其風(fēng)味物質(zhì)變化規(guī)律奠定理論和技術(shù)基礎(chǔ)。