NH4+雙階段發(fā)酵控制谷氨酸工藝研究

劉景陽(yáng)，余子辰，徐慶陽(yáng),2,3*

(1.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津 300457；2.天津市氨基酸高效綠色制造工程實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；3.代謝控制發(fā)酵技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，天津 300457)

谷氨酸是生物體中蛋白質(zhì)的主要構(gòu)成成分之一，也是參與機(jī)體氮代謝的基本氨基酸之一，在生命代謝活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用[1]。因此，L-谷氨酸被廣泛應(yīng)用到食品、醫(yī)藥、化工、化妝品、飼料等行業(yè)中，已經(jīng)成為世界上應(yīng)用范圍較廣的氨基酸產(chǎn)品，年產(chǎn)量接近200萬(wàn)噸，產(chǎn)值超過(guò)200億，市場(chǎng)前景廣闊，潛力巨大[2-3]。但是，相較于國(guó)外的發(fā)酵技術(shù)，我國(guó)的谷氨酸發(fā)酵技術(shù)產(chǎn)酸率僅在15%左右，糖酸轉(zhuǎn)化率在64%左右，與國(guó)際領(lǐng)先水平仍有較大差距。究其原因，主要是我國(guó)谷氨酸發(fā)酵行業(yè)發(fā)酵工藝簡(jiǎn)陋，發(fā)酵過(guò)程調(diào)控粗放，進(jìn)而導(dǎo)致菌體活力不足，產(chǎn)酸能力弱。因此，采用合適的發(fā)酵控制工藝成為提高谷氨酸產(chǎn)量的有效途徑[4-5]。

NH4+在微生物發(fā)酵過(guò)程中常被用作氮源，在細(xì)胞內(nèi)參與輔因子、氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸等含氮化合物的合成，在菌體生長(zhǎng)代謝中扮演著重要角色[6]。鄭夢(mèng)杰等[7]在研究銨離子抑制 avermectin 生物合成的機(jī)理時(shí)發(fā)現(xiàn)，NH4+能直接或間接地影響菌體代謝過(guò)程中各種酶的活力，導(dǎo)致菌體內(nèi)部TCA循環(huán)加強(qiáng)，丙酮酸含量降低，同時(shí)由于能量代謝加快，ATP大量生成，過(guò)量的ATP經(jīng)反饋后會(huì)抑制糖酵解過(guò)程中的酶，從而降低糖酵解效率。馮寧等[8]在探究NH4+濃度對(duì)黃色短桿菌XV0505發(fā)酵生產(chǎn)L-纈氨酸的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)NH4+濃度過(guò)高會(huì)抑制菌體生長(zhǎng)，使得菌體量較少，從而影響產(chǎn)酸期產(chǎn)量，另外，發(fā)酵前期高濃度的NH4+會(huì)產(chǎn)生一定程度的阻遏效應(yīng)，使發(fā)酵產(chǎn)酸階段對(duì)于NH4+的同化作用減弱，降低產(chǎn)酸。同樣，對(duì)于谷氨酸發(fā)酵而言，合適的NH4+濃度對(duì)谷氨酸發(fā)酵過(guò)程中菌體活力和菌體產(chǎn)酸能力尤為重要，在以菌體生長(zhǎng)為主的階段，過(guò)高的NH4+濃度會(huì)抑制菌體生長(zhǎng)，降低菌體活力；在以產(chǎn)酸為主的階段，NH4+濃度過(guò)低會(huì)使得α-酮戊二酸不能被還原成氨基酸，無(wú)法生成谷氨酸，造成α-酮戊二酸積累[9-10]。

目前，谷氨酸的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法、酶解法和微生物發(fā)酵法，其中由于微生物發(fā)酵法原料成本低、反應(yīng)條件溫和、易于擴(kuò)大生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為L(zhǎng)-谷氨酸行業(yè)普遍采用的大規(guī)模L-谷氨酸生產(chǎn)方法[11-13]。發(fā)酵法生產(chǎn)谷氨酸時(shí)通常需要流加氨水，一方面用于維持適宜的發(fā)酵環(huán)境pH，保證菌體的正常生長(zhǎng)；另一方面提供谷氨酸發(fā)酵所需的NH4+，保證菌體的產(chǎn)酸性能[14]。但是，由于發(fā)酵過(guò)程中用于調(diào)節(jié)pH的氨水中的NH4+并不能被全部用來(lái)生產(chǎn)谷氨酸，NH4+過(guò)量積累，最終高濃度的NH4+會(huì)導(dǎo)致菌體活力和產(chǎn)酸性能下降，發(fā)酵上表現(xiàn)為菌體衰老死亡，產(chǎn)酸量和糖酸轉(zhuǎn)化率降低[15-16]。

針對(duì)上述問(wèn)題，本研究以生物素亞適量型菌株黃色短桿菌GDK-9為供試菌株，分析NH4+對(duì)谷氨酸生產(chǎn)菌株的生長(zhǎng)特性和生產(chǎn)性能的影響，同時(shí)構(gòu)建L-谷氨酸生物合成的代謝網(wǎng)絡(luò)模型[17]，對(duì)其進(jìn)行代謝流分析，針對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸的不同階段，探究NH4+雙階段控制工藝，從而提高菌體活力和L-谷氨酸產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 菌種

L-谷氨酸生產(chǎn)菌：生物素亞適量型菌株黃色短桿菌GDK-9，天津科技大學(xué)代謝工程研究室保藏。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 活化斜面培養(yǎng)基

葡萄糖2 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母粉5 g/L，KH2PO4·3H2O 1 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，瓊脂粉25 g/L。

1.2.2 種子培養(yǎng)基

葡萄糖35 g/L，玉米漿干粉15 g/L，氯化膽堿0.1 g/L，丁二酸1 g/L，豆粕水解液22 mL/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，蛋氨酸0.5 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 5 mg/L，VB50.5 mg/L，MnSO4·H2O 5 mg/L，VB10.5 mg/L，VB30.5 mg/L，K2HPO4·3H2O 3 g/L，VB120.5 mg/L，甜菜堿0.1 g/L。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基

MnSO4·H2O 10 mg/L，氯化膽堿0.1 g/L，MgSO4·7H2O 1.8 g/L，KCl 1.8 g/L，豆粕水解液15 mL/L，VB30.5 mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 5 mg/L，Na2HPO4·12H2O 3.5 g/L，VB10.5 mg/L，VB50.5 mg/L，VB120.5 mg/L，糖蜜1.2 g/L，玉米漿干粉2.5 g/L，甜菜堿0.1 g/L。

1.3 主要儀器

LDZH-100KBS型全自動(dòng)立式蒸汽滅菌器 天津博鑫生物科技有限公司；5 L自動(dòng)控制發(fā)酵罐 上海保興生物設(shè)備工程有限公司；SBA-40E生物傳感分析儀 山東省科學(xué)院生物研究所;Agilent 1200高效液相色譜儀 安捷倫科技有限公司；奧林巴斯高壓蒸汽發(fā)生器 上海奉賢協(xié)新機(jī)電廠；752分光光度計(jì) 上海分析儀器廠；Olympus生物顯微鏡 日本Olympus株式會(huì)社。

1.4 培養(yǎng)方法

1.4.1 菌種活化

使用接種環(huán)從保藏在-80 ℃的甘油管中蘸取2～3環(huán)菌液，然后均勻接種于2支一代斜面上，在32 ℃培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng)12 h，之后從培養(yǎng)好的一代斜面中取1環(huán)菌體接種于二代斜面上，在32 ℃培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng)12 h。

1.4.2 一級(jí)種子培養(yǎng)

將活化好的菌種斜面分別接種到3個(gè)1 L圓底燒瓶中，每個(gè)燒瓶中含有100 mL的種子培養(yǎng)基，然后將其置于32 ℃，220 r/min的搖床上，連續(xù)培養(yǎng)6～8 h。

1.4.3 二級(jí)種子培養(yǎng)

將培養(yǎng)好的一級(jí)種子通過(guò)發(fā)酵罐進(jìn)樣口接種到含有種子培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐中，通過(guò)流加氨水控制pH在7.0左右，溫度34 ℃，溶氧維持在30%～50%。

1.4.4 發(fā)酵培養(yǎng)

當(dāng)OD600達(dá)到15左右時(shí)，按20%的接種量接入含有發(fā)酵培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐中。發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)流加調(diào)節(jié)液(用于調(diào)節(jié)pH)，將pH控制在7.0左右，通過(guò)控制轉(zhuǎn)速和通風(fēng)量將溶氧穩(wěn)定在30%～50%。初始發(fā)酵溫度為36 ℃，發(fā)酵時(shí)間為30～32 h。

1.5 檢測(cè)方法

1.5.1 pH的測(cè)定

采用發(fā)酵罐自帶的梅特勒pH電極進(jìn)行測(cè)定，用pH 6.4～8.0的精密pH試紙輔助測(cè)定。

1.5.2 殘?zhí)呛康臋z測(cè)

每隔2 h取樣，離心，取上清液，將上清液稀釋100倍，用SBA-40E生物傳感分析儀檢測(cè)殘?zhí)呛俊?/p>

1.5.3 菌體量的檢測(cè)

每隔2 h取樣，分別稀釋10，20，50，100倍，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)量 OD600。

菌體生物量=吸光值 OD600×稀釋倍數(shù)。

注：吸光值范圍在0.2～0.8，超過(guò)量程后需換下一個(gè)稀釋倍數(shù)。

1.5.4 有機(jī)酸和氨基酸的測(cè)定

使用高效液相色譜分析儀進(jìn)行有機(jī)酸測(cè)定，首先，取1 mL的發(fā)酵液置于1.5 mL的離心管中，12000 r/min離心5 min，取其上清液并進(jìn)行適當(dāng)倍數(shù)稀釋?zhuān)缓筮^(guò)0.22 μm微孔濾膜，最后采用液相色譜分析儀進(jìn)行含量檢測(cè)；色譜柱條件：色譜柱型號(hào)為Bio-Rad Aminex HPX-87H(300 mm×7.8 mm，8 μm)，用0.04 mol/L硫酸緩沖液洗脫，柱溫32 ℃，流速0.4 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm。

發(fā)酵液中氨基酸(副產(chǎn)物)含量采用氨基酸分析儀進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)酵液的預(yù)處理方式同上述有機(jī)酸測(cè)定，稀釋適當(dāng)倍數(shù)后，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，最后使用氨基酸分析儀進(jìn)行定量檢測(cè)；色譜條件：LCAK06/Na型色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，體積分?jǐn)?shù)為50%的乙腈溶液緩沖液A和4.1 g/L的乙酸鈉緩沖液B同時(shí)洗脫，柱溫58 ℃，流速0.50 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)分別為570 nm和440 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 L-谷氨酸發(fā)酵過(guò)程分析

在5 L自控發(fā)酵罐中進(jìn)行L-谷氨酸補(bǔ)料分批發(fā)酵，在發(fā)酵過(guò)程中每2 h測(cè)定菌體量(OD600)、L-谷氨酸產(chǎn)量和NH4+濃度，繪制L-谷氨酸發(fā)酵過(guò)程曲線，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 L-谷氨酸發(fā)酵過(guò)程曲線

由圖1可知，NH4+濃度在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢(shì)，其中有2個(gè)增長(zhǎng)趨勢(shì)明顯加快的時(shí)間點(diǎn)，分別為4 h和20 h。在4 h時(shí)，由于菌體量快速上升，菌體開(kāi)始轉(zhuǎn)型，導(dǎo)致L-谷氨酸分泌，因而需要流加氨水以平衡發(fā)酵環(huán)境的pH,發(fā)酵液中NH4+濃度明顯上升。到了20 h時(shí)，NH4+濃度已經(jīng)超過(guò)了500 mmol/L，高濃度的NH4+嚴(yán)重影響菌體的生長(zhǎng)，菌體活力開(kāi)始下降，菌體量出現(xiàn)下降趨勢(shì)，L-谷氨酸生產(chǎn)速率也趨于平緩，同時(shí)由于菌體活力的下降，菌體代謝流異常，轉(zhuǎn)而生產(chǎn)副產(chǎn)物乳酸、丙氨酸，這些副產(chǎn)物同樣需要氨水來(lái)平衡發(fā)酵液中的pH，最終導(dǎo)致NH4+補(bǔ)充量大于消耗量，進(jìn)而使得NH4+在發(fā)酵液中繼續(xù)積累。

由此可見(jiàn)，NH4+濃度的控制主要有兩個(gè)階段：第一階段為發(fā)酵前、中期，要盡可能地維持NH4+濃度使其既能保證菌體快速生長(zhǎng)，又不影響菌體產(chǎn)酸；第二階段為發(fā)酵后期，由于長(zhǎng)時(shí)間的發(fā)酵，菌體活力開(kāi)始下降，如何避免高濃度NH4+對(duì)菌體的進(jìn)一步毒害，從而保證菌體產(chǎn)酸速率成為重中之重。

2.2 L-谷氨酸發(fā)酵前、中期NH4+發(fā)酵控制對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響

本研究采用NaOH和氨水混合調(diào)節(jié)pH的方法，取代了傳統(tǒng)發(fā)酵中的全氨水調(diào)節(jié)，通過(guò)調(diào)節(jié)配比從而控制發(fā)酵液中NH4+的濃度。對(duì)于發(fā)酵前、中期的NH4+控制，本研究在發(fā)酵開(kāi)始時(shí)分別采用NaOH∶氨水的摩爾比例為1∶3(A)、1∶5(B)、1∶7(C)、1∶9(D)、全氨水(E)的調(diào)節(jié)液代替氨水調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH，通過(guò)測(cè)定發(fā)酵過(guò)程中NH4+濃度、OD600和L-谷氨酸產(chǎn)量，明確了不同配比對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酸情況的影響，從而確定最佳混合比例，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 發(fā)酵前、中期NH4+控制的發(fā)酵過(guò)程曲線

E為全氨水調(diào)節(jié)，即基礎(chǔ)發(fā)酵，其發(fā)酵液中NH4+濃度增長(zhǎng)速度最快，最大NH4+濃度為679 mmol/L，而隨著氨水比例的下降，NH4+的增長(zhǎng)趨緩，A、B、C、D的最終NH4+濃度分別為101，203，486，590 mmol/L，較E分別降低了85.1%、70.1%、28.4%、13.1%。

另外，隨著氨水比例的下降，菌體量OD600的值逐漸升高，E的最大菌體量為51，最終菌體量為38，菌體量下降幅度為13，而A、B、C、D的最大菌體量分別為70，66，61，57，較E分別提高了37.3%、29.4%、19.6%、11.8%，最終菌體量分別為64，59，52，47，菌體量下降幅度分別為6，7，9，10，較E分別降低了53.8%、46.2%、30.7%、23.1%。對(duì)于L-谷氨酸來(lái)說(shuō)，當(dāng)NH4+下降時(shí)，L-谷氨酸產(chǎn)量表現(xiàn)為先升高后下降的趨勢(shì)，E的L-谷氨酸產(chǎn)量為153 g/L，A、B、C、D的L-谷氨酸產(chǎn)量分別為62，129，162，156 g/L，其中A、B較E分別下降了59.5%和17.3%，C、D較E分別提高了5.8%和2.0%。綜合結(jié)果來(lái)看，在發(fā)酵前、中期選擇NaOH和氨水混合比例為1∶7的調(diào)節(jié)液替代氨水，效果最好，其最大菌體量為61，最終菌體量為52，L-谷氨酸產(chǎn)量為162 g/L。

從上述結(jié)果分析可以看出，NH4+濃度對(duì)L-谷氨酸發(fā)酵產(chǎn)酸具有十分重要的影響：氨基酸中所需要的氮素來(lái)源是NH4+的同化，丙酮酸、α-酮戊二酸是L-谷氨酸代謝中的重要物質(zhì)，在低NH4+環(huán)境下，丙酮酸和α-酮戊二酸這些參與銨同化的有機(jī)酸不能被利用，從而被排出細(xì)胞，影響L-谷氨酸的生產(chǎn)；當(dāng)NH4+濃度過(guò)高時(shí)，在發(fā)酵初期菌體活力不足，菌體增長(zhǎng)速率和最大菌體量都較低，當(dāng)菌體增長(zhǎng)速率不足時(shí)，會(huì)導(dǎo)致菌體間競(jìng)爭(zhēng)生物素能力下降，進(jìn)而使得菌體轉(zhuǎn)型不充分，影響菌體產(chǎn)酸，同時(shí)，過(guò)高的NH4+濃度在發(fā)酵后期會(huì)導(dǎo)致菌體衰老得更早，甚至自溶裂解，增加發(fā)酵液的黏度，影響氧的傳遞，對(duì)最終的L-谷氨酸產(chǎn)量以及后續(xù)的提取造成不良后果。

2.3 L-谷氨酸發(fā)酵后期NH4+發(fā)酵控制對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響

通過(guò)對(duì)發(fā)酵前、中期的NH4+發(fā)酵控制可以發(fā)現(xiàn)，僅在前、中期對(duì)NH4+濃度控制是不夠的，發(fā)酵后期NH4+依然處于較高濃度且有一直增長(zhǎng)的趨勢(shì)，這表明L-谷氨酸發(fā)酵前、中期與發(fā)酵后期對(duì)于NH4+的需求并不一樣，為了保證L-谷氨酸發(fā)酵過(guò)程中NH4+濃度始終處于較為適宜的情況，為此本研究在L-谷氨酸發(fā)酵前、中期NH4+發(fā)酵控制的基礎(chǔ)上，對(duì)發(fā)酵后期的NH4+濃度進(jìn)行控制優(yōu)化，在發(fā)酵18 h開(kāi)始采用NaOH和氨水混合比例(摩爾濃度)為1∶1(A)、1∶3(B)、1∶5(C)、1∶7(D)，通過(guò)每2 h測(cè)定發(fā)酵液中的NH4+濃度、OD600和L-谷氨酸產(chǎn)量，繪制過(guò)程曲線，見(jiàn)圖3。

圖3 發(fā)酵后期NH4+控制的發(fā)酵過(guò)程曲線

由圖3可知，D為NaOH和氨水的混合比例(摩爾濃度)1∶7，即全程1∶7調(diào)節(jié)發(fā)酵，D的NH4+濃度曲線處于持續(xù)增長(zhǎng)趨勢(shì)，最終NH4+濃度為486 mmol/L。C的NH4+濃度曲線與D的NH4+濃度曲線趨勢(shì)相同，但相較于D來(lái)說(shuō)較為平緩，24 h之后NH4+濃度又快速上升，最終NH4+濃度為400 mmol/L。A與B的NH4+濃度曲線在替換調(diào)節(jié)液后，NH4+濃度先是出現(xiàn)了下降趨勢(shì)，而后趨于平穩(wěn)，且B相較于A較為平緩，A和B的最終NH4+濃度分別為72 mmol/L和121 mmol/L，表明在發(fā)酵后期NH4+濃度維持在100 mmol/L左右即可滿足菌體對(duì)于NH4+的需求。

由圖3中的菌體生長(zhǎng)曲線和L-谷氨酸產(chǎn)量曲線可知，D的最大菌體量為62.4，最終菌體量為52.1，菌體量下降幅度為10.3，L-谷氨酸產(chǎn)量為158 g/L。A、B、C的最大菌體量基本相同，分別為63，63，62.1，最終菌體量分別為60.2，58，54.4，菌體量下降幅度分別為2.8，5，7.7，較D降低了72.8%、51.5%、25.2%。A、B、C的L-谷氨酸產(chǎn)量分別為159，167，161 g/L，較D分別提高了0.6%、5.7%、1.9%。

綜上所述，在發(fā)酵后期，發(fā)酵液中NH4+濃度越高，菌體活力下降越嚴(yán)重，表現(xiàn)為菌體產(chǎn)酸速率和產(chǎn)酸量下降，菌體衰老自溶，同時(shí)由于菌體自溶釋放的菌體碎片、菌體蛋白、內(nèi)毒素等物質(zhì)會(huì)進(jìn)一步降低菌體活力，降低氧的傳遞效率，影響菌體的發(fā)酵性能，造成惡性循環(huán)；當(dāng)發(fā)酵液中NH4+濃度過(guò)低時(shí)，NH4+對(duì)菌體生長(zhǎng)的抑制作用解除，保證了菌體活力，但過(guò)少的NH4+又成為菌體產(chǎn)酸的限制因素，最終依然會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)酸速率和產(chǎn)酸量的降低。因此，發(fā)酵后期合適的NH4+濃度對(duì)菌體的生長(zhǎng)和生產(chǎn)性能有很大影響，通過(guò)上述結(jié)果分析，最終決定在發(fā)酵后期選擇NaOH和氨水的摩爾混合比例為1∶3的調(diào)節(jié)液作為替代，既保證菌體活力又不會(huì)成為產(chǎn)酸的限制因素，能夠提高L-谷氨酸的產(chǎn)量。

2.4 L-谷氨酸發(fā)酵過(guò)程中轉(zhuǎn)換時(shí)間對(duì)雙階段NH4+控制發(fā)酵結(jié)果的影響

為了探究雙階段NH4+控制的轉(zhuǎn)換時(shí)間對(duì)L-谷氨酸發(fā)酵結(jié)果的影響，本研究選擇在16 h(A)、19 h(B)、21 h(C)、24 h(D)進(jìn)行兩個(gè)階段調(diào)節(jié)液的替換，通過(guò)對(duì)整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中NH4+濃度、OD600、L-谷氨酸產(chǎn)量進(jìn)行測(cè)定，明確不同轉(zhuǎn)換時(shí)間對(duì)雙階段NH4+濃度控制發(fā)酵結(jié)果的影響，從而確定最佳轉(zhuǎn)換時(shí)間，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 轉(zhuǎn)換時(shí)間對(duì)雙階段NH4+控制發(fā)酵結(jié)果的影響

由圖4可知，A和B的NH4+濃度曲線趨勢(shì)大致相同，二者在轉(zhuǎn)換完成后NH4+濃度快速下降，而后趨于平緩，最終NH4+濃度分別維持在50.4 mmol/L和120.1 mmol/L，C和D的NH4+濃度曲線逐漸上升，且C的曲線較D來(lái)說(shuō)較為平緩，最終NH4+濃度分別為394 mmol/L和491 mmol/L。A、B、C、D 4種情況最大菌體量大致相同，分別為63.5，62.2，63，62.6，最終菌體量隨著轉(zhuǎn)換時(shí)間的推后逐漸降低，分別為60.8，59，58，56，下降幅度分別為2.7，3.2，5，6.6，L-谷氨酸最終產(chǎn)量分別為160，170，163，155 g/L。

通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，在16 h和19 h轉(zhuǎn)換調(diào)節(jié)液后，由于此時(shí)L-谷氨酸生產(chǎn)速度較快，因此轉(zhuǎn)換后NH4+被快速消耗，NH4+濃度逐漸降低，適宜的NH4+濃度保證了菌體活力，L-谷氨酸生產(chǎn)速率得以維持，之后趨于平緩。原因是發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)致使菌體衰老，L-谷氨酸生產(chǎn)速率下降，NH4+濃度維持在該水平，但16 h時(shí)，由于過(guò)早進(jìn)行替換導(dǎo)致NH4+濃度過(guò)低，不能滿足菌體生產(chǎn)L-谷氨酸，因此16 h相較于19 h，最終的L-谷氨酸產(chǎn)量較低。在21 h和24 h進(jìn)行轉(zhuǎn)換時(shí)，由于此時(shí)菌體活力已經(jīng)下降，菌體量開(kāi)始下降，菌體裂解死亡，副產(chǎn)物與內(nèi)毒素積累，使得此時(shí)即使轉(zhuǎn)換調(diào)節(jié)液，補(bǔ)充的NH4+也無(wú)法被大量消耗，因而發(fā)酵液中NH4+濃度快速上升，L-谷氨酸產(chǎn)酸速率下降，影響最終的L-谷氨酸產(chǎn)量。綜合上述結(jié)果來(lái)看，最終選擇在19 h進(jìn)行調(diào)節(jié)液的替換，此時(shí)進(jìn)行替換既不影響前、中期L-谷氨酸的生產(chǎn)，同時(shí)還能保證發(fā)酵后期的菌體活力以及菌體的產(chǎn)酸能力。

2.5 最優(yōu)條件下的發(fā)酵結(jié)果驗(yàn)證

通過(guò)對(duì)上述實(shí)驗(yàn)的論證分析可以得出，在采用雙階段NH4+發(fā)酵控制進(jìn)行L-谷氨酸發(fā)酵實(shí)驗(yàn)時(shí)，最佳發(fā)酵條件為在發(fā)酵開(kāi)始時(shí)采用NaOH和氨水摩爾混合比例為1∶7的調(diào)節(jié)液代替純氨水進(jìn)行pH的調(diào)節(jié)，在發(fā)酵19 h時(shí)采用NaOH和氨水摩爾混合比例為1∶3的調(diào)節(jié)液代替1∶7的調(diào)節(jié)液進(jìn)行pH的調(diào)節(jié)，在此優(yōu)化條件下對(duì)雙階段NH4+發(fā)酵控制策略進(jìn)行多批次發(fā)酵結(jié)果驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)圖5和表1。

表1 兩種發(fā)酵方式對(duì)糖酸轉(zhuǎn)化率的影響

圖5 最優(yōu)條件下的發(fā)酵過(guò)程曲線

在基礎(chǔ)發(fā)酵的NH4+濃度過(guò)程曲線中，NH4+濃度呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢(shì)，且上升速度較快，最終的NH4+濃度為678 mmol/L，而采用了雙階段NH4+發(fā)酵控制策略后，在發(fā)酵前、中期，發(fā)酵液中NH4+濃度快速上升，而后當(dāng)L-谷氨酸產(chǎn)酸速率穩(wěn)定后，NH4+濃度基本維持在300 mmol/L左右，而在發(fā)酵后期，由于調(diào)節(jié)液中NH4+濃度降低，NH4+濃度最終維持在100 mmol/L。

在基礎(chǔ)發(fā)酵中，發(fā)酵初期，高濃度的NH4+會(huì)影響菌體的生長(zhǎng)，其最大菌體量為51，同時(shí)在發(fā)酵進(jìn)行到20 h時(shí)，菌體出現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)，最終菌體量為38，菌體量下降幅度為13，采用雙階段NH4+發(fā)酵控制策略后，由于降低了發(fā)酵液中的NH4+濃度，解除了高濃度NH4+對(duì)菌體生長(zhǎng)的抑制作用，因此最大菌體量達(dá)到了63，較基礎(chǔ)發(fā)酵提高了23.5%。在發(fā)酵后期同樣緩解了NH4+的高濃度抑制，使得菌體活力得到穩(wěn)定，菌體衰老自溶現(xiàn)象緩解，最終的菌體量為58，較基礎(chǔ)發(fā)酵提高了52.6%，下降幅度為5，降低了61.5%。

同時(shí)在采用雙階段NH4+發(fā)酵控制策略時(shí)，通過(guò)實(shí)驗(yàn)探究發(fā)現(xiàn)在L-谷氨酸發(fā)酵的前、中期，即L-谷氨酸生產(chǎn)的高峰期，NH4+濃度維持在300 mmol/L，發(fā)酵后期NH4+濃度維持在100 mmol/L時(shí)，發(fā)酵效果最好，此時(shí)的NH4+濃度既保證了菌體活力，又提高了L-谷氨酸生產(chǎn)速率和產(chǎn)量。由圖5中L-谷氨酸生產(chǎn)曲線和表1可知，采用雙階段NH4+發(fā)酵控制策略后，L-谷氨酸的生產(chǎn)速率、最終產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率都得到了提高，其最終產(chǎn)量為171 g/L，相較于基礎(chǔ)發(fā)酵的153 g/L提高了11.8%；糖酸轉(zhuǎn)化率也由60.2%提高到了61.6%。

2.6 雙階段NH4+發(fā)酵控制策略對(duì)谷氨酸代謝流向及副產(chǎn)物的影響

為了探究雙階段NH4+發(fā)酵控制工藝對(duì)谷氨酸發(fā)酵中乳酸、丙氨酸等副產(chǎn)物的影響，本研究對(duì)兩種不同發(fā)酵控制工藝在發(fā)酵過(guò)程中前、中期的葡萄糖、L-谷氨酸、L-丙氨酸、L-賴(lài)氨酸和乳酸質(zhì)量積累或消耗速率進(jìn)行測(cè)定，見(jiàn)表2。

表2 兩種發(fā)酵方式代謝產(chǎn)物變化速率

將葡萄糖的摩爾消耗速率以100 mmol/L計(jì)算，運(yùn)用MATLAB軟件線性規(guī)劃法分析得到兩種發(fā)酵方式的代謝分布情況，結(jié)果見(jiàn)圖6(A為基礎(chǔ)發(fā)酵，B為NH4+雙階段發(fā)酵控制工藝)[18-19]。

圖6 兩種發(fā)酵方式代謝流分布圖

由圖6可知，在基礎(chǔ)發(fā)酵中,L-谷氨酸、L-丙氨酸、L-賴(lài)氨酸和乳酸的代謝流分別為73.52，0.83，0.93，3.97，而在NH4+雙階段發(fā)酵控制策略中L-谷氨酸、L-丙氨酸、L-賴(lài)氨酸和乳酸的代謝流分別為76.37，0.65，0.73，2.93。與基礎(chǔ)發(fā)酵相比，L-谷氨酸代謝流提高了3.9%，其余副產(chǎn)物分別降低了21.7%、21.5%和24.7%。

在基礎(chǔ)發(fā)酵中高濃度的NH4+對(duì)菌體具有一定的毒害作用，影響菌體內(nèi)部各種酶的活力，由圖6代謝流分布圖可知，采用NH4+雙階段發(fā)酵控制工藝后，由于調(diào)整了發(fā)酵液中的NH4+濃度使其最適宜于菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酸，菌體內(nèi)異檸檬酸脫氫酶、α-酮戊二酸脫氫酶等酶活力得到增強(qiáng)，代謝流更多地流向谷氨酸，另一方面，由于菌體活力增強(qiáng)，菌體衰老現(xiàn)象延緩，菌體自溶、裂解、死亡等減少使得發(fā)酵液中的蛋白、菌體碎片等大分子物質(zhì)隨之減少，發(fā)酵液黏度下降，泡沫減少，氧的供給與傳遞效率提高，因而乳酸脫氫酶等酶活下降，降低了副產(chǎn)物的生成[20-21]。

3 結(jié)論

本研究對(duì)NH4+雙階段發(fā)酵控制工藝進(jìn)行了研究，發(fā)酵開(kāi)始時(shí)采用NaOH和氨水摩爾混合比例為1∶7的調(diào)節(jié)液代替純氨水進(jìn)行pH的調(diào)節(jié)，在發(fā)酵19 h時(shí)采用NaOH和氨水摩爾混合比例為1∶3的調(diào)節(jié)液代替1∶7的調(diào)節(jié)液進(jìn)行pH的調(diào)節(jié)，對(duì)菌體生長(zhǎng)及生產(chǎn)性能的提高最大，在此條件下最大OD600達(dá)到了63，較基礎(chǔ)發(fā)酵提高了23.5%，最終的菌體量為58，較基礎(chǔ)發(fā)酵提高了52.6%，下降幅度為5，降低了61.5%。L-谷氨酸產(chǎn)量最終產(chǎn)量為171 g/L，提高了11.8%，糖酸轉(zhuǎn)化率也由60.2%提高到了61.6%。同時(shí)對(duì)其代謝流進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，L-谷氨酸、L-丙氨酸、L-賴(lài)氨酸和乳酸的代謝流分別為76.37，0.65，0.73，2.93，與基礎(chǔ)發(fā)酵相比，L-谷氨酸代謝流提高了3.9%，其余副產(chǎn)物分別降低了21.7%、21.5%和24.7%。因此，NH4+雙階段發(fā)酵控制工藝在穩(wěn)定發(fā)酵液中NH4+濃度、提高菌體活力和產(chǎn)酸能力、降低副產(chǎn)物、使代謝流盡可能地流向谷氨酸等方面起到了積極作用，對(duì)谷氨酸的精細(xì)化控制和高效產(chǎn)酸具有借鑒意義。