平喘方干預哮喘模型觀察“IL-33-ST2”肺腸免疫變化的研究①

樸 香 吳 杰 虞堅爾 薛 征 徐萬超 （上海中醫(yī)藥大學附屬市中醫(yī)醫(yī)院，上海 200071）

過敏性哮喘以嗜酸性粒細胞介導的呼吸道炎癥和氣道高反應性為主要特征，是以Th2 占優(yōu)勢的免疫紊亂性疾病［1］。目前全球約有3 億哮喘患者，中國約有3 000 萬，其中約1/3 為兒童。在哮喘患兒中，有70%首次發(fā)作在3 歲以前，1 歲以前發(fā)病率占28.42%，其發(fā)病率逐年增高，嚴重威脅兒童的生長健康，給家庭及社會帶來多方面負擔。哮喘的固有免疫可由腸道微生物介導腸道組織IL-33 免疫反應，通過IL-33/ST2 通路進行遠端調控。因此，哮喘發(fā)作可能與腸道免疫紊亂有關。海派徐氏兒科傳承人虞堅爾教授認為哮喘患兒急性期病機多因宿痰內伏為發(fā)病根本，治療大法以平喘化痰，祛瘀通腑為主，一方面選用宣肺平喘經方“三拗湯”聯合溫肺化痰方“三子養(yǎng)親湯”共奏平喘化痰之功，另一方面靈活運用有通腑之效的萊菔子、桃仁，不僅能祛瘀，又能通腑。前期臨床試驗發(fā)現，平喘方控制兒童哮喘發(fā)作療效顯著，其治愈率高于氨茶堿［2］。前期動物實驗發(fā)現平喘方能夠調節(jié)Th1/Th2 平衡，并能夠減輕哮喘急性發(fā)作氣道炎癥［3-4］，但其控制哮喘發(fā)作的具體機制仍不明確。因此，本部分通過IL-33/ST2 通路觀察平喘方干預哮喘模型，觀察其在肺腸組織免疫調節(jié)的機制研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 40 只5~6 周BALB/c 雌性小鼠，購于上海斯萊克實驗動物有限公司［許可證號：SCXK（滬）2017-0005］，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學附屬市中醫(yī)醫(yī)院SPF 環(huán)境中，溫度22~24 ℃，濕度為50%~70%，模擬12 h 日光燈晝夜更替。使用滅菌水和標準鼠糧飼養(yǎng)。開始研究前，各組小鼠適應性喂養(yǎng)7 d。

1.1.2 主要試劑 卵清白蛋白（ovalbumin，OVA，純度≥98%，Sigma，型號：A5503）；鋁佐劑（Thermo-Fisher，型號：77161）；蘇木素溶液（BASO，型號：714094）；伊紅（BASO，型號：BA4099）；IL-5、IL-13、IL-33 ELISA 試劑盒（X-Y Biotechnology，型號：XYE20193、GS-E11384、XY-B980Mu）；兔多克隆 IL-33抗體、兔多克隆ST2 抗體；兔多克隆HNF1A 抗體、兔多克隆 GATA3 抗體、兔多克隆 IκBα、兔多克隆NFKB1 抗體、鼠多克隆NFKBp65 抗體（Proteintech，型號：12372-1-AP、11920-1-AP、22426-1-AP、10417-1-AP、10268-1-AP、14220-1-AP、10745-1-AP）；羊抗鼠HRP 標記二抗（碧云天，型號：A0216）；逆轉錄試劑盒（Fermentas，型號：K1622）；Trizo（lInvitrogen，型號：1596-026）；BCA 蛋白定量試劑盒（ThermoFisher，型號：K0223、PICPI23223）。

1.1.3 實驗藥物配制 地塞米松：醋酸地塞米松片（0.75 mg/片，上海通用藥業(yè)股份有限公司，批號為061002），加生理鹽水配制成濃度為0.075 mg/ml的溶液，等量灌胃；1次/d，連續(xù)給藥7 d。

平喘方：炙麻黃 6 g、大桃仁 9 g、苦杏仁 9 g、炙甘草6 g、紫蘇子9 g、萊菔子9 g、地龍干6 g、花椒目9 g。生藥飲片均購自上海市藥材公司，參考文獻［5］的方法煎煮提取藥物，濃縮干燥為顆粒劑。其鑒定及質控均委托上海中醫(yī)藥大學藥物研究所完成。加生理鹽水配制成濃度為含生藥量劑量為5.33 g/ml，根據《中藥藥理學》中公式：dB=dA×KB/KA 計算，以20 ml（/kg·d）灌胃。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 根據前期實驗基礎，BALB/c 小鼠分為4 組（n=10）：空白對照組、模型組、地塞米松組（DEX）和平喘方組（PCF）。

1.2.2 模型建立 ①致敏階段：除空白對照組外其余各組分別在實驗的第0、13 天腹腔注射0.5 ml OVA-A（lOH）3致敏液，空白對照組腹腔注射等劑量的生理鹽水。第二次腹腔注射1 周后，開始激發(fā)階段；②激發(fā)階段：第20~27天霧化激發(fā)。將小鼠置于密閉容器中，將5%OVA 致敏液用超聲霧化激發(fā)，連續(xù)7 d，1 次/d，每次30 min。對照組用生理鹽水做相對應處理，以小鼠出現煩躁、搔鼻、呼吸加快、腹肌痙攣、點頭呼吸及四肢癱軟等表現為激發(fā)成功。

1.2.3 HE 染色 處死小鼠后取肺臟組織固定在4%多聚甲醛中，切成0.2~0.3 cm，大小為1.5 cm×1.5 cm×0.3 cm 的切片。沖洗后，用梯度乙醇（50%、70%、85%、95%直至無水乙醇）逐級脫水，每級2 h。重復沖洗，脫水后，浸蠟包埋。按照HE 步驟染色，在顯微鏡下觀察肺支氣管旁和血管炎癥病理變化以及結腸組織變化。

1.2.4 ELISA檢測炎癥因子 凍存的BALF上清用于細胞因子的測定，利用ELISA 法檢測支氣管肺泡灌洗液中IL-5、IL-13 和IL-33 的表達水平。參照試劑說明書操作。

1.2.5 RT-PCR 用TRIzol試劑按照標準從肺臟和結腸組織中提取總RNA。cDNA 第一條鏈的合成，將制備好的cDNA 進行RT-PCR 擴增，擴增引物如表 1。用循環(huán)閾值 Ct 測量表達水平，然后用 2-ΔΔCt方法將其歸一化為GAPDH表達。

1.2.6 Western blot 分別提取肺臟和結腸組織的總蛋白，取50 μg 蛋白加入適量上樣緩沖液，沸水浴10 min 后離心取上清，上樣到PAGE 凝膠電泳槽中分離蛋白，轉至半干轉膜中，用麗春紅染色檢測轉膜是否成功。用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，根據說明書分別稀釋一抗（anti-IL-33、anti-ST2、anti-GATA、anti-p50、anti-p60），與膜室溫孵育2 h。孵育一抗的膜用TBST 洗滌3 次，每次5 min。隨后根據用量，按照1∶1 000稀釋HRP標記的二抗，與膜37 ℃孵育1 h。用 TBST 洗滌 3 次，每次 5 min。用 ECL 化學發(fā)光顯色，在成像系統(tǒng)中進行掃描拍照。用Image J軟件統(tǒng)計灰度值計算相對表達量。GAPDH內參，至少進行3個獨立重復實驗。

2 結果

2.1 肺組織病理切片HE 染色 鏡下觀察：肺組織切片HE 染色觀察支氣管及血管周圍炎癥細胞浸潤。與空白對照組相比，模型組支氣管及血管周圍出現大量的嗜酸性粒細胞浸潤，氣道管腔狹窄，基底膜增厚。與模型組相比，地塞米松組和平喘方組有效抑制氣道炎癥細胞浸潤和炎癥物質滲出，見圖1。

圖1 各組小鼠肺組織病理切片HE染色（×200）Fig.1 Pathological observation of lung tissue of mice in each group by HE-staining（×200）

2.2 結腸組織病理切片HE 染色 鏡下觀察結腸組織切片HE 染色：空白對照組結腸組織可見腸壁緊密，腺體豐富，腺窩深，黏膜上皮完整、連續(xù)，腺體排列規(guī)則，結構清晰。而模型組腸壁變薄，腺體稀疏，腺體排列存在部分破壞，黏膜上皮欠缺，有部分細胞可見水腫破裂。與模型組相比，地塞米松組和平喘方組對腸道黏膜屏障具有保護作用（圖2）。

圖2 各組小鼠腸道組織病理切片HE染色（×200）Fig1 Pathological observation of gut tissue of mice in each group by HE-staining（×200）

2.3 肺泡灌洗液中IL-5和IL-13的表達水平 應用ELISA 檢測支氣管肺泡灌洗液中IL-5 和IL-13，結果見圖3：與空白對照組相比，模型組表達明顯上調（P＜0.05）；與模型組相比，地塞米松組和平喘方組的表達有顯著下調（P＜0.05）；地塞米松組和平喘方組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。提示平喘方能有效抑制哮喘模型中IL-5和IL-13的表達，對氣道炎癥有抑制作用。

圖3 支氣管肺泡灌洗液中IL-5和IL-13的表達水平Fig.3 Expressions of IL-5 and IL-13 in BALF

2.4 肺腸組織中IL-33-ST2信號通路中相關因子的表達 機體受到外界環(huán)境各種刺激的作用下，引發(fā)氣道上皮細胞釋放IL-33，與Ⅱ型固有淋巴細胞上的ST2 受體（IL-1R1）結合，觸發(fā)信號級聯反應，最終激活NF-κB，驅動Th2 炎癥反應。因此，為了證明平喘方能夠干預哮喘模型中IL-33-ST2信號通路，本課題通過OVA 誘導的哮喘小鼠灌服平喘方，進一步探討IL-33-ST2通路及其下游相關因子的表達。

2.4.1 IL-33-ST2 信號通路在各組小鼠的表達 上皮細胞釋放的IL-33與Ⅱ型固有淋巴細胞上的IL-1R1結合，Ⅱ型固有淋巴細胞內的TCF-1 和GATA3 的釋放，進一步促進Ⅱ型固有淋巴細胞成熟。用ELISA檢測平喘方能夠下調哮喘小鼠支氣管肺泡灌洗液IL-33 的表達（圖4A）：與空白對照組相比，模型組IL-33 表達上調（P＜0.01）；與模型組相比，地塞米松組和平喘方組IL-33 表達下調（P＜0.05）；地塞米松組和平喘方組IL-33 表達差異無統(tǒng)計學意義（P=0.99）。同時在肺組織中也表達IL-33的mRNA和蛋白的下調（圖4B~D，P＜0.05，P＜0.01），與其結合的ST2 受體在肺組織中表達也 下 調（P＜0.01，P＜0.05）。在Ⅱ型固有淋巴細胞內促進細胞成熟的TCF-1 和 GATA3 的 mRNA 表達下調（P＜0.05，P＜0.01，圖 4B），GATA3 的蛋白表達下調（P＜0.01，圖4D），但TCF-1 蛋白表達與模型組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖4D）。提示地塞米松和平喘方可能通過抑制IL-33-ST2信號通路抑制哮喘氣道炎癥。

圖4 IL-33-ST2通路相關因子的表達（n=3）Fig.4 Expressions of related factors on IL-33-ST2 pathway（n=3）

2.4.2 IL-33-ST2 信號下游的 NF-κB 通路在各組小鼠的表達變化 NF-κB 蛋白通常會由 p65 和 p50 形成同源/異源二聚體，在胞質中因與抑制蛋白IκBα結合形成了三聚體復合物而處于失活狀態(tài)。在哮喘發(fā)作時，可因IL-33-ST2 信號通路被激活，經過級聯反應最終導致NF-κB 蛋白被激活。前面已經觀察到IL-33-ST2 信號通路可因平喘方干預哮喘而受到抑制，現進一步觀察平喘方能否抑制NF-κB 信號蛋白。通過RT-PCR 觀察（圖5B）：與空白對照組相比，模型組IκBα表達下調（P＜0.01），p50和p65合成增多（P＜0.01）；與模型組相比，地塞米松組和平喘方組IκBα 表達上調（P＜0.05），p50 和p65 合成減少（P＜0.01）；地塞米松組和平喘方組兩組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。通過Western blot 觀察（圖5A、C）：與空白對照組相比，模型組IκBα 蛋白下調（P＜0.01），p50 和p65 蛋白增多（P＜0.01，P＜0.05）；與模型組相比，地塞米松組和平喘方組IκBα蛋白表達上調（P＜0.01），但p50 和p65 蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖5 NF-κB通路相關因子的表達（n=3）Fig.5 Expressions of related factors on NF-κB pathway（n=3）

2.4.3 結腸組織 IL-33、ST2 和 GATA3 mRNA 和蛋白的表達 通過RT-PCR和Western blot初步觀察結腸IL-33、ST2 和GATA3 mRNA和蛋白的表達。結果顯示（圖6）：與空白對照組相比，模型組IL-33、ST2和 GATA3 表達均上調（mRNA：P＜0.01；蛋白：P＜0.01）；與模型組相比，地塞米松組（mRNA：P＜0.05；蛋白：P＜0.05），平喘方組（mRNA：P＜0.01；蛋白：P＜0.01）表達下調；地塞米松組和平喘方組兩組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖6）。

圖6 IL-33-ST2 通路在結腸組織中mRNA 和蛋白的表達（n=3）Fig.6 Expressions of mRNA and protein on IL-33-ST2 pathway in colon tissue（n=3）

3 討論

哮喘是一種常見的慢性疾病，目前影響全球超過3 億人，預計到2025 年患病人數將增加到4 億。每年約有25萬人病死于哮喘相關疾病，其中許多是可以避免的［6］。哮喘的發(fā)病機制尚不清楚，但該疾病與遺傳、環(huán)境、傳染性和營養(yǎng)等因素有關。在20世紀初，哮喘被描述為一種單一疾病，但目前對其復雜性的理解已經發(fā)展到精確醫(yī)學方法，包括微生物組分析，開始出現其診斷和治療方法［7-8］。哮喘中腸道內的微生物失調可能是由許多與生活方式和環(huán)境暴露有關的因素引起的。腸道中共生和病理細菌株之間的不平衡可能導致免疫發(fā)育的改變和不適當的炎癥反應，但仍不清楚不平衡是疾病的致病因素還是其他因素影響。有文獻報道IL-33-ST2通路在哮喘發(fā)作過程和肺腸黏膜免疫中均有顯著變化［9］。

IL-33是IL-1細胞因子家族的成員，主要來源于上皮細胞［10-15］，是過敏性炎癥反應的中介，能夠促進多種白細胞成熟、活化或趨化，包括Th2 細胞、肥大細胞、Ⅱ型固有細胞、嗜堿性粒細胞、自然殺傷細胞和嗜酸性粒細胞等［16-19］。IL-33 通過與ST2 受體（也稱為IL-1R1）結合發(fā)揮生物學效應［20］。當機體受到外界環(huán)境各種刺激的作用下（包括細菌，病毒，真菌，過敏原和污染物），可以引發(fā)氣道上皮細胞釋放IL-33，與ST2L 的結合，募集信號銜接蛋白，如信號分子髓樣分化因子 88（MyD88）和 Mal［21］。MyD88 和Mal 與 IL-1RL1-b 和 IL-1RAcP 的細胞 內 TIR 結構 域結合，觸發(fā)信號級聯反應，激活NF-кB 和激活蛋白1（activin-1，AP-1），促進 Th2 細胞免疫應答［8］。在過敏性哮喘小鼠模型中，體外給予IL-33 可產生氣道嗜酸性粒細胞，上調Th2 細胞因子（如IL-4、IL-5、IL-13 等）表達，并提高血清 IgE 水平，AHR（airway hyperresponsiveness）黏液分泌過多［22］。若用抗體阻斷 IL-33/ST2 通路，能下調小鼠哮喘模型中Th2 型免疫應答，減輕氣道嗜酸性粒細胞浸潤及氣道阻力［8］；此外，與健康對照組相比，成人和兒童急性哮喘的血漿和痰液中發(fā)現了高水平的ST2 和IL-33。有研究表明，IL-33/ST2 可影響兒童喘息發(fā)生及早期哮喘的發(fā)展［23-26］。在過敏性氣道疾病的人體和小鼠模型中均發(fā)現，IL-33 驅動在Th2 炎癥反應中起核心作用。

MJ?SBERG 等［27］研究表明，GATA3 對 IL-13 及ST2 的表達有調控作用，同時，GATA3 還是 Th2 效應細胞分化的關鍵調節(jié)器，編碼染色體重排Th2 細胞因子基因座，從而誘導IL-5、IL-9、IL-13高水平表達，因此依賴IL-33-ST2-IL-13 軸，促進Th2 細胞免疫應答，分泌炎癥因子。有研究發(fā)現，蛋白酶的活性損害過敏性哮喘的氣道上皮細胞，釋放IL-33，釋放嗜酸性粒細胞，黏液分泌增加［26-27］。BARLOW 等［28］研究發(fā)現，相同小鼠通過上呼吸道接觸花粉或卵清蛋白，IL-33是具有比IL-25更快、更有效地促進氣道高反應性。KEARLEY 等［29］研究表明，OVA 誘導的過敏性哮喘中，持續(xù)性氣道高反應與Th2 細胞持續(xù)分泌炎癥因子有關，而不是肺嗜酸性粒細胞，其作用通路是ST2（IL-33R）-IL-33，用抗體阻斷IL-33 的ST2受體可減少IL-13、IL-4 的分泌，減輕氣道高反應性和氣道黏膜炎癥。

肺與大腸的黏膜上皮共同組成抵御外來抗原的第一道屏障，屏障完整性的維持和修復對于黏膜上皮炎癥至關重要［14］。中醫(yī)理論認為“肺與大腸相表里”，而肺-腸軸是其現代科學體現。HUANG 等［8］研究發(fā)現，ILC2s 不是專屬駐留在肺組織細胞中，可以從腸道募集到肺等，以響應炎癥信號的激活。而ILC2s 的激活是通過 IL-33 與 ILC2s 表面的 ST2 受體結合，同肺部IL-33-ST2相似，出現一系列級聯反應，有研究報道，腸道黏膜被IL-33 誘導Ⅱ型免疫后，通過血液循環(huán)才在肺中出現，并在肺中快速、短暫地發(fā)生Ⅱ型免疫反應［8］。因此，本項目通過地塞米松和平喘方干預研究IL-33-ST2 途徑所調節(jié)的肺腸黏膜炎癥反應對調節(jié)“肺-腸”軸有重要意義。

研究結果顯示，本項目平喘方和地塞米松均能有效干預哮喘小鼠肺部IL-33-ST2通路，其中下調上皮細胞IL-33 高表達，減少其與ST2 受體的結合，可能與GATA3 和TCF-1 的異常高表達有關，同時顯示，腸道的IL-33-ST2通路也有相應的變化。提示平喘方和地塞米松均能調控肺腸的IL-33-ST2通路。

本實驗哮喘小鼠的肺腸IL-33-ST2 通路異常表達，通過用地塞米松和平喘方分別干預哮喘小鼠發(fā)現，平喘方同地塞米松均能有效地下調哮喘的肺腸黏膜的炎癥因子的表達。大量研究表明，哮喘患兒的腸道菌群失調，平喘方方組中萊菔子、桃仁，不僅能祛瘀，又能通腑［30］。本課題組前期預實驗也發(fā)現，哮喘小鼠灌胃平喘方后，出現腸道雙歧桿菌定植重新定植的效果，但其具體的作用機制仍需進一步研究發(fā)現。