血清IL-17A通過抑制DEL-1參與慢性乙型肝炎發(fā)病的機制研究

陳 誠 楊青青 陳邦濤 陳偉慶

（重慶大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院消化內(nèi)科，教育部生物流變科學(xué)與技術(shù)重點實驗室，重慶 400044）

全球約有2.4 億人因感染乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）成為慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者，而未經(jīng)抗病毒治療進展至肝硬化者占比達15%~40%，極大增加了肝癌與肝衰竭的發(fā)生率［1］；此外，因HBV 特殊的復(fù)制中間體共價閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）難以從肝細胞中被清除，CHB 目前僅能以血清乙肝表面抗原（HBsAg）持續(xù)陰轉(zhuǎn)（即功能性治愈）為理想治療終點，但即使經(jīng)過1~5年的一線抗病毒治療，仍僅有5%~13%的CHB 患者可獲得 HBsAg 陰轉(zhuǎn)［2-3］。故 HBV 慢性感染仍嚴重威脅著全球公共衛(wèi)生。疫苗和阻斷藥在預(yù)防HBV 新發(fā)感染中已取得顯著成績，故抗HBV 治療才是對WHO提出的2030年全面消滅CHB這一目標的最大挑戰(zhàn)。為通過多元治療以使更多CHB 患者達到功能性治愈，其關(guān)鍵是深層次理解HBV與宿主的互作關(guān)系。

有研究表明，T 細胞介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫應(yīng)答通過分泌大量促炎或抑炎因子在HBV 逃逸宿主免疫監(jiān)視中發(fā)揮重要作用［4-6］。其中，分泌重要促炎因子IL-17A 的 Th17 和 Tc17 細胞在 CHB 血循環(huán)和肝組織中均顯著升高，且與肝組織損傷程度呈正相關(guān)［7-9］，但HBV 感染誘生的IL-17A 通過何種機制在復(fù)雜的微環(huán)境中促進HBV 引起肝損傷仍不明確。闡明CHB 患者IL-17A 上調(diào)的原因可為通過靶向抑制IL-17A 產(chǎn)生，減輕HBV 相關(guān)肝損傷提供證據(jù)支撐。IL-17A 表達與分泌受多因素調(diào)控，近年的部分研究提示，內(nèi)皮細胞發(fā)育調(diào)節(jié)基因-1（developmental endothelial locus-1，DEL-1）可通過調(diào)節(jié) IL-17A 穩(wěn)態(tài)參與多種器官特異或系統(tǒng)性炎癥性疾?。?0］。分子量約52 kD 的DEL-1 又稱為表皮生長因子樣重復(fù)序列和盤狀蛋白I 樣結(jié)構(gòu)域-3（EGF-like repeats and discoidin I-like domains 3，EDIL3），在肺、腦及骨組織等組成性地表達［10］，但其在肝臟中的表達及功能發(fā)揮尚不明確，尤其是無從考證DEL-1是否會通過與IL-17A的相互作用參與CHB 發(fā)病。本研究擬基于臨床相關(guān)性分析和體外細胞實驗初步探究IL-17A/DEL-1 通路在CHB 中的作用，以期能進一步加深對HBV致病機制的理解。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對象 選取2015 年至2016 年長治醫(yī)學(xué)院附屬和平醫(yī)院CHB初治患者80例，同時從該院體檢部選取年齡、性別及身體質(zhì)量指數(shù)（BMI）與CHB 患者相匹配的健康志愿者40例為對照。CHB的診斷參照中國《慢性乙型肝炎防治指南》（2015 年版），同時排除：①正在或既往接受核苷酸類似物和/或干擾素治療；②合并其他病毒性肝炎或人類免疫缺陷病毒感染或細菌感染性疾??；③合并酒精性或非酒精性脂肪肝病、藥物性肝病或自身免疫性肝病等；④合并失代償期肝硬化、肝癌或其他系統(tǒng)性疾病等；⑤近半年內(nèi)系統(tǒng)地使用過糖皮質(zhì)激素等免疫抑制劑或抗生素。所有入組對象在抽血前均簽署書面知情同意書，本研究經(jīng)過長治醫(yī)學(xué)院附屬和平醫(yī)院倫理委員會審核批準。

1.1.2 主要試劑與細胞來源 人IL-17A ELISA kit（Elabscience，#E-EL-H5812c）；人 DEL-1 ELISA kit（R&D SYSTEMS，DY6046-05）；逆 轉(zhuǎn) 錄 試 劑 盒Quantscript RT Kit（天根生化，#KR103）；熒光定量試劑盒FastFire qPCR PreMix（天根生化，#FP207）；重組人IL-17A（Abcam，#ab9567）；重組人DEL-1（R&D SYSTEMS，#6046-ED）；DEL-1（ABclonal，#A15772）；IL-17A（ABclonal，#A0688）；β-actin（EASYBIO，#BE0037）；人外周血淋巴細胞分離液（索萊寶，#P8610）；人正常肝細胞（LO2）和人髓系白血病單核細胞（THP-1）均購自中科院細胞庫；HepG2.2.15（穩(wěn)定表達并分泌HBV 病毒顆粒）和HepG2 為本實驗室保存；細胞培養(yǎng)用新生胎牛血清（FBS）及DMED培養(yǎng)基均購自Gibco。

1.2 方法

1.2.1 資料收集 收集所有入組受者的年齡、性別、身高、體質(zhì)量、肝功能指標、HBV 病毒學(xué)指標、HBV 感染病史、合并疾病、用藥史等人口學(xué)及臨床資料。

1.2.2 外周血標本處理 用抗凝管抽取患者空腹靜脈血15 ml，其中3 ml 用于離心取血清，并凍存于-80 ℃待測血清中的DEL-1 及IL-17A 蛋白（根據(jù)各ELISA 試劑盒說明書操作，每份樣品進行獨立3 次檢測后取均值）；采用Ficoll-Paque 梯度離心法從余下的12 ml全血中分離外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC），其中1/3 PBMC立即加入1 ml Trizol溶解，2/3 PBMC加入1 ml含20%DMSO的細胞凍存液，均凍存于液氮中。PBMC 的提取在細胞超凈臺中操作，嚴格無菌。

1.2.3 細胞培養(yǎng)及刺激 HepG2.2.15、HepG2、THP-1、PBMC（源于對照組人群）及LO2 細胞均采用含10%FBS 及1%青鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)于37 ℃、含 5%CO2的孵箱中。其中，THP-1、PBMC 及 LO2 細胞待培養(yǎng)至約80%融合度時，于培養(yǎng)基中加入等量HBV 病毒上清液（VS）聯(lián)合重組人IL-17A 或重組人DEL-1處理24 h，重組蛋白劑量參考其他文獻［11］。

1.2.4 熒光定量PCR（qPCR） 采用Trizol 法從全血分離的PBMC 或經(jīng)培養(yǎng)處理的PBMC 中提取細胞總 RNA，取其中 1 μg 總 RNA 經(jīng) Quantscript RT Kit逆轉(zhuǎn)為cDNA（總體積20 μl），稀釋5倍后取2 μl cDNA經(jīng) FastFire qPCR PreMix 在 ABI 7500PCR 儀中熒光定量檢測DEL-1、IL-17A和β-actin的mRNA水平，所用引物列于表1，程序為預(yù)變性95 ℃1 min 和40 個PCR 循環(huán)（95 ℃ 5 s+55 ℃ 10 s+72 ℃ 15 s），采用2-ΔΔCt法計算目的mRNA的相對表達量。

表1 qPCR引物序列Tab.1 Primer sequences for qPCR

1.2.5 蛋白免疫印跡（Western blot） 采用含蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液從THP-1 和LO2 細胞中提取細胞總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度，取30 μg 蛋白加入上樣緩沖液，于10%SDS-PAGE 凝膠中進行恒壓（80 V/120 V）電泳，而后于恒流（400 mA）條件下將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉，一抗4 ℃過夜孵育，二抗室溫孵育2 h，采用ECL 化學(xué)發(fā)光法檢測靶蛋白。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 所有原始數(shù)據(jù)編入Excel 表格，采用GraphPad Prism 8.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。連續(xù)性或二分類變量分別采用或率（%）表示，組間比較采用Studentt或卡方檢驗，相關(guān)性分析采用Pearson 線性相關(guān)分析，P＜0.05 認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對象臨床資料比較 如表2所示，與對照組相比，CHB 組在性別、年齡及BMI 等方面差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；但 CHB 組肝炎（ALT、AST）、肝功能（TBiL 及白蛋白）及病毒學(xué)指標（HBVDNA、HBsAg 及HBeAg）與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 納入研究對象基本資料Tab.2 Characteristics of subjects at baseline

2.2 血清DEL-1 與IL-17A 在CHB 患者中的相關(guān)性 如圖 1A、B 所示，CHB 組血清 DEL-1 蛋白水平顯 著 低 于 對 照 組［（33.82±12.80）vs（95.38±31.42）ng/ml，P＜0.001］，而 CHB 組血清 IL-17A 蛋白水平顯著高于對照組［（71.21±21.23）vs（24.75±10.36）pg/ml，P＜0.001］；進一步相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，CHB組血清DEL-1水平分別與血清IL-17A（r=-0.341，P=0.002，圖 1C）和血清 ALT（r=-0.398，P＜0.001，圖1D）呈顯著負相關(guān)，與AST、TBiL、白蛋白、HBVDNA、HBsAg均無相關(guān)性（P＞0.05）。

圖1 血清DEL-1與IL-17A蛋白含量分析Fig.1 Analysis of serum DEL-1 and IL-17A protein

2.3 DEL-1、IL-17A mRNA 在 PBMC 中 的 表達情況 qPCR 結(jié)果顯示，CHB 組 IL-17A mRNA 相對表達水平是對照組的2.62±0.57 倍（P＜0.001，圖2A），但DEL-1 mRNA 在2 組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義；健康人PBMC經(jīng)HBV上清液體外刺激后，PBMC中DEL-1 mRNA 仍無明顯變化，而IL-17A mRNA 顯著上升（P=0.016，圖 2B）；外源性給予 DEL-1 處理后，IL-17A mRNA上升幅度隨DEL-1濃度增加呈劑量依賴性減少（圖2C）；為取得蛋白水平研究證據(jù)，進一步體外培養(yǎng)THP-1細胞（圖2D），結(jié)果表明，經(jīng)DEL-1處理或靜息狀態(tài)的THP-1 細胞均不表達IL-17A 蛋白，但VS 可刺激IL-17A 蛋白高表達，該上調(diào)作用可被外源活性DEL-1蛋白部分抑制，但各處理組THP-1細胞中DEL-1蛋白豐度均較低且無明顯變化。這一結(jié)果提示CHB 患者血清IL-17A 升高至少部分源于HBV病毒成分對PBMC的刺激作用，且受血清DEL-1蛋白的調(diào)控。

圖2 DEL-1和IL-17A在單核細胞中的表達分析Fig.2 Analysis of DEL-1 and IL-17A expressions in mononuclear cells

2.4 DEL-1 蛋白在肝細胞的表達情況 進一步體外培養(yǎng)LO2 細胞以探究CHB 患者血清DEL-1 下調(diào)與IL-17A 的關(guān)系（圖3），結(jié)果表明，靜息狀態(tài)下LO2細胞具有較高豐度的DEL-1 蛋白表達水平，VS 刺激對DEL-1蛋白水平無明顯影響；但無論是否有VS刺激，外源活性IL-17A 均可顯著下調(diào)LO2 細胞中的DEL-1 蛋白水平；上述各處理組均未檢測到IL-17A表達。提示CHB 患者血清DEL-1 下調(diào)可能與HBV病毒成分刺激PBMC分泌IL-17A有關(guān)。

圖3 DEL-1和IL-17A在人正常肝細胞中表達分析Fig.3 Analysis of DEL-1 and IL-17A expressions in human normal liver cells

3 討論

病毒與宿主相互作用的研究（尤其是對宿主抗病毒免疫應(yīng)答規(guī)律的探索）是揭示病毒致病機制及開發(fā)抗病毒藥物的永恒主題。無論是在發(fā)現(xiàn)HBV感染特異性受體（?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運多肽）的前后，宿主是否對HBV 感染具備固有免疫應(yīng)答仍備受爭議，其很大原因在于HBV 感染模型的異型性；而源于臨床的大量證據(jù)一致證實，以淋巴細胞異常活化釋放炎癥介質(zhì)為中心的適應(yīng)性免疫應(yīng)答是調(diào)控HBV 感染與致病的關(guān)鍵因素［6，12］。病毒復(fù)制和肝損傷是HBV 感染后的兩個經(jīng)典生物學(xué)事件，HBV 病毒成分誘發(fā)肝組織損傷與外周血或肝組織局部Th17 異常增多及活化密切相關(guān)［9，13］。LI 等［14］研究發(fā)現(xiàn)血清IL-17A水平在HBV 急性感染、CHB及免疫耐受期患者中均有顯著差異，與此類似，本研究亦證實CHB患者較正常人具有更高的血清IL-17A 表達。另有研究進一步提示，HBV 可通過誘導(dǎo)趨化因子CCL17和 CCL22 表達來促進分泌 IL-17 的 T 細胞（Th17 和Tc17）進入肝組織加重肝損傷，而IL-17 還可經(jīng)由IL-6/STAT3 通路促進HBV 所致的肝硬化進展為肝癌［8，15］。此外，臨床上用于實現(xiàn) CHB 功能性治愈的核苷酸類似物初始或序貫聯(lián)合聚乙二醇干擾素也被證實能夠抑制CHB 患者外周血PBMC 分泌IL-17蛋白［16-17］。這些證據(jù)不禁再度令人思考IL-17 在HBV感染致病中的貢獻量和可能機制。

IL-17A 是IL-17 家族中最重要的一員，主要在CD4+Th17 細胞中表達，受上游IL-23 蛋白（由巨噬細胞及樹突狀細胞分泌）活性調(diào)控。但近年的研究發(fā)現(xiàn)，血清DEL-1 蛋白與多種IL-17A 升高的疾?。ㄈ缪乐苎住⊙Y、過敏性哮喘及炎癥性骨質(zhì)疏松癥等）均有關(guān)［10，18］。本研究發(fā)現(xiàn) CHB 患者血清 DEL-1蛋白水平顯著降低，且其表達水平與IL-17A 和ALT均呈負相關(guān)，此證據(jù)進一步支持DEL-1 與IL-17A 之間的聯(lián)系。血清蛋白DEL-1主要由血管內(nèi)皮細胞表達及分泌，其結(jié)構(gòu)由N 端3 個表皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域（E1-E3）和C 端2 個盤狀結(jié)構(gòu)域（C1-C2）構(gòu)成；其中，E2 中 RGD 基序與炎癥細胞表面 CD11a/CD18 結(jié)合介導(dǎo)其黏附并浸入血管內(nèi)皮或其他組織細胞，從而誘發(fā)炎癥［19］。但越來越多研究表明，其他多種細胞（如巨噬細胞及腫瘤細胞等）均可高表達DEL-1蛋白，且其在炎癥發(fā)生至緩解的整個過程及惡性腫瘤進展中均有重要作用［20-23］。

本研究探索PBMC 是否為血清DEL-1 的重要來源，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DEL-1 mRNA 表達量在CHB 組與健康人組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，體外采用VS 刺激正常PBMC 或THP-1 細胞亦不能顯著改變其mRNA 或蛋白表達，且胞內(nèi)蛋白豐度較低，這在一定程度上說明血清DEL-1 蛋白并非來自PBMC；相反，課題組卻在LO2 細胞中檢測到較高豐度的DEL-1 蛋白，但并不受VS影響，提示健康人群中高血清DEL-1水平可能部分來源于正常肝細胞，而HBV 能特異性感染肝細胞引起組織損傷釋放ALT，進而可能破壞肝細胞穩(wěn)態(tài)導(dǎo)致CHB 患者血清DEL-1 減少，這或許能解釋血清中DEL-1與ALT呈負相關(guān)這一現(xiàn)象。但IL-17A是如何與抑炎蛋白DEL-1 相互關(guān)聯(lián)從而調(diào)控CHB肝臟炎癥反應(yīng)的呢？本研究發(fā)現(xiàn)，重組DEL-1 蛋白可劑量依賴性地抑制PBMC 和THP-1 細胞中IL-17A mRNA 或蛋白表達，而重組IL-17A 蛋白亦可抑制LO2細胞中DEL-1蛋白含量，這與臨床標本中DEL-1與IL-17A呈負相關(guān)的結(jié)論一致。DEL-1抑制IL-17A的具體機制目前仍不清楚，但比較明確的是，IL-17A可通過激活糖原合酶激酶3β（GSK3β）進而抑制DEL-1 上游轉(zhuǎn)錄因子CCAAT/增強子結(jié)合蛋白β（C/EBPβ）的轉(zhuǎn)錄活性來下調(diào) DEL-1 的蛋白表達［10，24］。綜上，推測DEL-1 是肝細胞維持穩(wěn)態(tài)的一種抑炎因子，但在 CHB 患者中，HBV 可刺激 PBMC 分泌大量的IL-17A，進而下調(diào)肝細胞DEL-1蛋白水平，從而產(chǎn)生肝炎癥狀。

本研究存在如下不足：首先，DEL-1與IL-17A的關(guān)系是否在HBV 感染后的不同臨床病程（如急性肝炎、免疫耐受期、有效抗病毒治療前后）中均存在尚不明確；其次，CHB 患者血清DEL-1 的改變是源于肝細胞損傷的證據(jù)并不充分，尚不能排除源于血管內(nèi)皮細胞功能改變的可能；第三，未評估血清IL-17A和DEL-1蛋白對HBV復(fù)制的影響，也未探究HBV各病毒成分對此2種血清蛋白的直接作用。欲進一步解決以上問題，可納入多類型HBV 感染的臨床病例，開展HBV 感染原代肝細胞和實驗動物等相關(guān)研究。

總之，本研究證實了血清IL-17A 與DEL-1 在CHB 患者中的關(guān)系，并初步表明血清IL-17A 可通過抑制肝細胞DEL-1 表達促進HBV 感染引發(fā)肝臟炎癥，這進一步豐富了對T 淋巴細胞介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫應(yīng)答在HBV 慢性感染引發(fā)肝組織損傷作用的理解。