利多卡因通過(guò)LncRNA H19/miR-671-5p 分子軸調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲

謝玉海 朵海珍 王學(xué)軍 （青海紅十字醫(yī)院麻醉科，西寧 810000）

胃癌是臨床常見(jiàn)的一種惡性腫瘤，其高度的侵襲性及轉(zhuǎn)移能力可提高患者病死率。目前臨床主要采用手術(shù)等方式進(jìn)行治療，但大部分患者確診時(shí)已處于腫瘤晚期，若采用手術(shù)、化療等姑息治療，患者會(huì)出現(xiàn)胃癌轉(zhuǎn)移、耐藥性等現(xiàn)象，導(dǎo)致治療失敗，研究表明麻醉藥物可用于治療胃癌并可能改善患者臨床癥狀［1-2］。但麻醉藥物在胃癌治療中的作用機(jī)制尚未完全闡明。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，LncRNA）可充當(dāng)微小RNA（miRNA）的競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)源RNA 從而參與胃癌的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程［3］。因而需要探究麻醉藥物是否通過(guò)調(diào)控LncRNA表達(dá)從而影響胃癌的發(fā)生及發(fā)展。利多卡因可抑制乳腺癌細(xì)胞遷移［4］。LncRNA H19 在卵巢癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，并可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的遷移及順鉑耐藥性的發(fā)生［5］。生物信息學(xué)分析顯示miR-671-5p可能是H19 的靶基因，研究表明miR-671-5p 在胃癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，并可通過(guò)靶向URGCP抑制胃癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡［6］。因此，本研究主要探討利多卡因?qū)ξ赴┘?xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響，探究其對(duì)H19/miR-671-5p 分子軸的靶向調(diào)控作用，旨在為進(jìn)一步闡釋利多卡因治療胃癌的分子機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 利多卡因購(gòu)自山東華魯制藥有限公司（國(guó)藥準(zhǔn)字：H80110255）；胃癌細(xì)胞AGS 購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)；Lipofectamine2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；miR-671-5p mimics、miR-NC、si-H19、si-NC 購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；pcDNA3.1 購(gòu)自上海柯雷生物科技有限公司；Trizol試劑購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄與實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；MTT、DMSO 購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning 公司；Matrigel 基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó) BD 公司；兔抗人Ki-67、PCNA 抗體購(gòu)自美國(guó)CST 公司；兔抗人E-cadherin、N-cadherin 抗體購(gòu)自美國(guó) Santa Cruz 公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 AGS 細(xì)胞接種于96 孔板（3×104個(gè)/孔），分別使用不同濃度（10、50、100 μmol/L）的利多卡因處理 24 h［7］，分別記作利多卡因-L 組、利多卡因-M組、利多卡因-H組。同時(shí)將正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為Con 組。參照Lipofectamine2000 說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分別將 pcDNA、pcDNA-H19 轉(zhuǎn)染至 AGS 細(xì)胞，隨后使用含100 μmol/L 的利多卡因處理24 h，分別記作利多卡因-H+pcDNA 組、利多卡因-H+pcDNAH19組。

1.2.2 MTT 檢測(cè)細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期AGS 細(xì)胞（3×105個(gè)/ml）按照每孔100 μl的密度接種于96孔板后加入20 μl MTT 溶液，室溫孵育4 h 后棄上清，加入150 μl DMSO，室溫振蕩孵育10 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)490 nm處各孔吸光度值（OD）。

1.2.3 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移與侵襲 AGS細(xì)胞（5×104個(gè)/ml）以200 μl/孔接種于Transwell 小室的上室，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后加入多聚甲醛固定20 min，PBS 洗滌，0.1%結(jié)晶紫染液染色10 min，棉簽擦拭未遷移的細(xì)胞，顯微鏡下觀察遷移細(xì)胞數(shù)。預(yù)冷培養(yǎng)液稀釋Matrigel 基質(zhì)膠后加入上室（40 μl/孔），將其放入培養(yǎng)箱內(nèi)孵育5 h 后加入AGS 細(xì)胞，后續(xù)實(shí)驗(yàn)步驟同細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)，觀察侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.2.4 qRT-PCR 檢測(cè)細(xì)胞中 H19、miR-671-5p 的表達(dá)水平 收集各組處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的AGS 細(xì)胞，Trizol 法提取細(xì)胞中的總RNA，應(yīng)用Nanodrop2000c超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 濃度。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA 為模板進(jìn)行qRT-PCR 反應(yīng)，參照實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒配置反應(yīng)體系及設(shè)置反應(yīng)程序，應(yīng)用羅氏LightCycler480 熒光定量 PCR 儀檢測(cè) H19、miR-671-5p 的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)H19 的靶基因starBase 預(yù)測(cè)顯示 H19 與 miR-671-5p 存在結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)建野生型載體WT-H19、突變型載體MUT-H19后，分別與 miR-NC、miR-671-5p mimics 共轉(zhuǎn)染至AGS細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后檢測(cè)相對(duì)熒光素酶活性。

1.2.6 Western blot 檢測(cè) Ki-67、PCNA、E-cadherin、N-cadherin 蛋白表達(dá) AGS 細(xì)胞加入 RIPA 裂解液提取細(xì)胞總蛋白，SDS-PAGE 分離蛋白后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉，分別加入一抗稀釋液（1∶1 000），4 ℃孵育24 h 后使用TBST 洗滌，分別加入二抗稀釋液（1∶5 000），室溫孵育 1 h 后使用 TBST 洗滌，滴加ECL，暗室內(nèi)曝光顯影，應(yīng)用Image J 軟件分析各條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以表示，數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)及組間方差齊性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布及方差齊性，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 利多卡因?qū)ξ赴┘?xì)胞AGS 增殖的影響 與Con 組相比，利多卡因-L 組、利多卡因-M 組、利多卡因-H 組細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.05），Ki-67、PCNA蛋白水平顯著降低（P＜0.05），且利多卡因-L 組、利多卡因-M 組、利多卡因-H 組細(xì)胞活力、Ki-67、PCNA蛋白水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖1、表1。

表1 利多卡因?qū)ξ赴┘?xì)胞AGS增殖的影響（，n=9）Tab.1 Effect of lidocaine on proliferation of gastric cancer cell AGS（，n=9）

表1 利多卡因?qū)ξ赴┘?xì)胞AGS增殖的影響（，n=9）Tab.1 Effect of lidocaine on proliferation of gastric cancer cell AGS（，n=9）

Note：Compared with Con group，1）P＜0.05；compared with Lidocaine-L group，2）P＜0.05；compared with Lidocaine-M group，3）P＜0.05.

PCNA 0.98±0.15 0.71±0.131）0.50±0.151）2）0.25±0.061）2）3）52.873 0.000 Groups Con Lidocaine-L Lidocaine-M Lidocaine-H F P Cell viability/%100.23±13.25 76.35±20.301）50.21±16.581）2）30.16±11.151）2）3）34.050 0.000 Ki-67 1.01±0.25 0.75±0.161）0.53±0.111）2）0.30±0.081）2）3）31.123 0.000

圖1 利多卡因?qū)GS細(xì)胞Ki-67、PCNA蛋白表達(dá)的影響Fig.1 Effects of lidocaine on protein expressions of Ki-67 and PCNA in AGS cells

2.2 利多卡因?qū)ξ赴┘?xì)胞AGS 遷移及侵襲的影響 與Con 組相比，利多卡因-L 組、利多卡因-M 組、利多卡因-H 組遷移細(xì)胞數(shù)及侵襲細(xì)胞數(shù)顯著減少（P＜0.05），E-cadherin 蛋白水平顯著升高（P＜0.05），N-cadherin 蛋白水平顯著降低（P＜0.05），且利多卡因-L組、利多卡因-M組、利多卡因-H組遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)及E-cadherin、N-cadherin 蛋白水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖2、表2。

表2 利多卡因?qū)ξ赴┘?xì)胞AGS遷移及侵襲的影響（，n=9）Tab.2 Effect of lidocaine on migration and invasion of gastric cancer cell AGS（，n=9）

表2 利多卡因?qū)ξ赴┘?xì)胞AGS遷移及侵襲的影響（，n=9）Tab.2 Effect of lidocaine on migration and invasion of gastric cancer cell AGS（，n=9）

Note：Compared with Con group，1）P＜0.05；compared with Lidocaine-L group，2）P＜0.05；compared with Lidocaine-M group，3）P＜0.05.

N-cadherin 1.01±0.16 0.72±0.111）0.53±0.121）2）0.28±0.041）2）3）63.665 0.000 Groups Con Lidocaine-L Lidocaine-M Lidocaine-H F P Number of migration cells 125.24±16.32 92.31±12.241）63.22±11.251）2）36.32±10.021）2）3）81.830 0.000 Number of invasion cells 97.65±11.26 70.32±13.241）51.26±15.231）2）31.24±10.051）2）3）45.354 0.000 E-cadherin 0.52±0.13 0.78±0.111）0.92±0.131）2）1.05±0.081）2）3）35.444 0.000

圖2 利多卡因?qū)?AGS 細(xì)胞 E-cadherin、N-cadherin 蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effects of lidocaine on expressions of E-cadherin and N-cadherin protein in AGS cells

2.3 利多卡因?qū)ξ赴┘?xì)胞AGS 中H19、miR-671-5p表達(dá)量的影響 與Con組相比，利多卡因-L組、利多卡因-M組、利多卡因-H組細(xì)胞中H19表達(dá)顯著降低（P＜0.05），miR-671-5p 表達(dá)顯著升高（P＜0.05），且利多卡因-L 組、利多卡因-M 組、利多卡因-H 組細(xì)胞中H19、miR-671-5p 的表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 利多卡因?qū)ξ赴┘?xì)胞AGS中H19、miR-671-5p表達(dá)的影響（，n=9）Tab.3 Effect of lidocaine on expressions of H19 and miR-671-5p in gastric cancer cell AGS（，n=9）

表3 利多卡因?qū)ξ赴┘?xì)胞AGS中H19、miR-671-5p表達(dá)的影響（，n=9）Tab.3 Effect of lidocaine on expressions of H19 and miR-671-5p in gastric cancer cell AGS（，n=9）

Note：Compared with Con group，1）P＜0.05；compared with Lidocaine-L group，2）P＜0.05；compared with Lidocaine-M group，3）P＜0.05.

miR-671-5p 1.00±0.12 1.65±0.131）2.52±0.201）2）3.02±0.241）2）3）225.689 0.000 Groups Con Lidocaine-L Lidocaine-M Lidocaine-H F P H19 1.01±0.13 0.71±0.111）0.52±0.121）2）0.30±0.091）2）3）63.309 0.000

2.4 H19 靶向調(diào)控miR-671-5p starBase 預(yù)測(cè)顯示H19 的序列中含有與miR-671-5p 互補(bǔ)的核苷酸序列，見(jiàn)圖3。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染野生型載體WT-H19 的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，與miR-NC 組相比，miR-671-5p 組熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05）；共突變型載體MUT-H19的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，miR-671-5p 組熒光素酶活性與miR-NC 組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表4。與si-NC組相比，si-H19組細(xì)胞中miR-671-5p 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；與 pcDNA 組相比，pcDNA-H19 組細(xì)胞中 miR-671-5p表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)表5。

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)（，n=9）Tab.4 Double luciferase report experiment（，n=9）

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)（，n=9）Tab.4 Double luciferase report experiment（，n=9）

Note：Compared with miR-NC group，1）P＜0.05.

MUT-H19 1.01±0.21 1.03±0.11 0.253 0.803 Groups miR-NC miR-671-5p t p WT-H19 1.03±0.15 0.63±0.111）6.451 0.000

表5 H19靶向調(diào)控miR-671-5p的表達(dá)（，n=9）Tab.5 H19 target regulate expression of miR-671-5p（，n=9）

表5 H19靶向調(diào)控miR-671-5p的表達(dá)（，n=9）Tab.5 H19 target regulate expression of miR-671-5p（，n=9）

Note：Compared with si-NC group，1）P＜0.05；compared with pcDNA group，2）P＜0.05.

miR-671-5p 1.00±0.21 2.35±0.321）1.02±0.16 0.32±0.082）145.632 0.000 si-NC si-H19 pcDNA pcDNA-H19 F P Groups

圖3 H19的序列中含有與miR-671-5p互補(bǔ)的核苷酸序列Fig.3 Sequence of H19 contains a nucleotide sequence complementary to miR-671-5p

2.5 H19 過(guò)表達(dá)減弱利多卡因?qū)ξ赴┘?xì)胞AGS 增殖的抑制作用 與利多卡因-H+pcDNA 組相比，利多卡因-H+pcDNA-H19 組細(xì)胞活力顯著升高（P＜0.05），Ki-67、PCNA 蛋白水平顯著升高（P＜0.05），見(jiàn)圖4、表6。

表6 H19過(guò)表達(dá)減弱利多卡因?qū)ξ赴┘?xì)胞AGS增殖的抑制作用（，n=9）Tab.6 H19 overexpression attenuated inhibitory effect of lidocaine on proliferation of gastric cancer cell AGS（，n=9）

表6 H19過(guò)表達(dá)減弱利多卡因?qū)ξ赴┘?xì)胞AGS增殖的抑制作用（，n=9）Tab.6 H19 overexpression attenuated inhibitory effect of lidocaine on proliferation of gastric cancer cell AGS（，n=9）

Note：Compared with Lidocaine-H+pcDNA group，1）P＜0.05。

PCNA 0.27±0.07 0.92±0.181）10.097 0.000 Groups Lidocaine-H+pcDNA Lidocaine-H+pcDNA-H19 t P H19 0.31±0.08 1.32±0.121）21.009 0.000 miR-671-5p 3.01±0.18 1.15±0.161）23.170 0.000 Cell viability/%31.21±10.03 96.32±11.241）12.966 0.000 Ki-67 0.26±0.03 0.85±0.111）15.524 0.000

圖4 Western blot檢測(cè)Ki-67、PCNA蛋白表達(dá)Fig.4 Western blot was used to detect expressions of Ki-67 and PCNA protein

2.6 H19 過(guò)表達(dá)減弱利多卡因?qū)ξ赴┘?xì)胞AGS 遷移及侵襲的抑制作用 與利多卡因-H+pcDNA 組相比，利多卡因-H+pcDNA-H19 組遷移細(xì)胞數(shù)及侵襲細(xì)胞數(shù)顯著增多（P＜0.05），E-cadherin 蛋白水平顯著降低（P＜0.05），N-cadherin 蛋白水平顯著升高（P＜0.05），見(jiàn)圖5、表7。

圖5 Western blot檢測(cè)E-cadherin、N-cadherin蛋白表達(dá)Fig.5 Western blot was used to detect expressions of E-cadherin and N-cadherin protein

表7 H19過(guò)表達(dá)減弱利多卡因?qū)ξ赴┘?xì)胞AGS遷移及侵襲的抑制作用（，n=9）Tab.7 H19 overexpression attenuated inhibitory effect of lidocaine on migration and invasion of gastric cancer cell AGS（，n=9）

表7 H19過(guò)表達(dá)減弱利多卡因?qū)ξ赴┘?xì)胞AGS遷移及侵襲的抑制作用（，n=9）Tab.7 H19 overexpression attenuated inhibitory effect of lidocaine on migration and invasion of gastric cancer cell AGS（，n=9）

Note：Compared with Lidocaine-H+pcDNA group，1）P＜0.05.

N-cadherin 0.29±0.06 0.78±0.131）10.267 0.000 Groups Lidocaine-H+pcDNA Lidocaine-H+pcDNA-H19 t p Number of migrating cells 39.32±10.12 98.65±13.241）10.681 0.000 Number of invasion cells 31.58±10.11 85.42±11.291）10.658 0.000 E-cadherin 1.03±0.05 0.56±0.111）11.669 0.000

3 討論

利多卡因可通過(guò)調(diào)節(jié)LncRNA-MEG3/miR-421/BTG1 分子軸抑制宮頸癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［8］；通過(guò)調(diào)節(jié)miR-539/EGFR 分子軸抑制肺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移［9］；通過(guò)上調(diào) miR-145 表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和侵襲［10］。本研究結(jié)果顯示，不同濃度的利多卡因處理后胃癌細(xì)胞活力顯著降低，提示利多卡因可抑制胃癌細(xì)胞增殖。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）與腫瘤細(xì)胞遷移及侵襲密切相關(guān)，其中上皮型標(biāo)志物為E-cadherin，E-cadherin 表達(dá)下調(diào)可促進(jìn)EMT 的發(fā)生從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin表達(dá)下調(diào)可抑制EMT的發(fā)生從而抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移［11］。本研究結(jié)果顯示，不同濃度的利多卡因處理后胃癌細(xì)胞遷移及侵襲能力顯著降低，E-cadherin 表達(dá)上調(diào)，N-cadherin 表達(dá)下調(diào)，且呈利多卡因劑量依賴(lài)性，提示利多卡因可抑制胃癌細(xì)胞的遷移及侵襲。

H19在胃癌細(xì)胞中表達(dá)水平升高并可促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)［12］；在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)并可通過(guò)激活BRD4 信號(hào)通路促進(jìn)多發(fā)性骨髓瘤發(fā)生［13］。miR-671-5p在胃癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，circPIP5K1A可充當(dāng)miR-671-5p 的海綿分子從而促進(jìn)胃癌的發(fā)展進(jìn)程［14］。本研究通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)H19可靶向結(jié)合miR-671-5p。本研究結(jié)果顯示，不同濃度的利多卡因處理后胃癌細(xì)胞中H19 表達(dá)下調(diào)，而miR-671-5p 表達(dá)上調(diào)，且呈利多卡因劑量依賴(lài)性，而H19 過(guò)表達(dá)可減弱利多卡因?qū)ξ赴┘?xì)胞增殖、遷移及侵襲的抑制作用。

綜上所述，利多卡因可抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲，其可能是通過(guò)下調(diào)H19 表達(dá)及上調(diào)miR-671-5p 表達(dá)發(fā)揮作用，可為進(jìn)一步揭示利多卡因抗胃癌的作用機(jī)制提高理論依據(jù)，并可為胃癌的治療提供新方向。