miR-147a靶向ATF2抑制非小細胞肺癌細胞侵襲和遷移①

王艾青 鄭秀花 劉瑾春 陳玉芳 鮑啟德 田振濤 （河南護理職業(yè)學院臨床醫(yī)學系，安陽 455000）

肺癌是世界范圍內癌癥相關死亡的主要原因，每年有近220萬例新發(fā)病例和150萬例死亡病例［1］。其中非小細胞肺癌占80%，可細分為鱗狀細胞癌、腺癌和大細胞癌［2］。盡管外科手術和化學療法方面取得了長足進步，但非小細胞肺癌的頻繁復發(fā)和轉移仍是急需解決的問題。微小RNA（miRNA）是一類小的非編碼RNA，具有轉錄后調節(jié)靶基因表達的能力，研究表明大量miRNA 在腫瘤轉移中起重要作用。miR-147a 位于染色體9q33.2 區(qū)域，在膀胱癌、宮頸癌等腫瘤細胞中低表達，具有抑癌作用［3-4］。已有研究表明血清miR-147低表達與非小細胞肺癌預后不良顯著相關［5］。LI 等［6］研究表明 miR-147 通過抑制BDNF 表達抑制非小細胞肺癌細胞增殖、遷移和侵襲。激活轉錄因子2（activate transcription factor 2，ATF2）屬于環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）響應元件結合家族，與非小細胞肺癌侵襲和遷移密切相關［7］。本文主要探究miR-147a靶向ATF2 對非小細胞肺癌遷移、侵襲和上皮-間質轉化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織 收集 2018 年 4 月至 2020 年 4 月濮陽市安陽地區(qū)醫(yī)院收治的40例非小細胞肺癌患者，手術切除非小細胞肺癌組織及癌旁組織，-80 ℃保存。本研究經(jīng)濮陽市安陽地區(qū)醫(yī)院倫理委員會批準，并根據(jù)《赫爾辛基宣言》道德準則進行，所有患者知情同意。

1.1.2 實驗動物 20 只4 周齡SPF 級雌性裸鼠（BALB/c）購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，體質量13~15 g，許可證號：SCXK（京）2016-0011。飼養(yǎng)于SPF 級25 ℃、50%~60%相對濕度環(huán)境，12 h/d光照，自由飲食飲水，適應性喂養(yǎng)1周后進行實驗。

1.1.3 細胞與主要試劑 正常肺上皮細胞BEAS-2B和非小細胞肺癌細胞系H1703、A549、H1299、L78、PGCL3 均購自上海素冉生物科技有限公司；miRNC、pc-NC、miR-147a mimic、pc-ATF2 質粒和實驗所用引物由北京奧科生物科技有限公司設計合成；胎牛血清（QS071，北京百奧萊博科技有限公司）；Lipofectamine2000 轉染試劑（11668030，美國 Thermo fisher）；DMEM 培養(yǎng)基（D5546，上海輔澤商貿有限公司）；青霉素和鏈霉素雙抗溶液（C0160-611，北京沃比森科技有限公司）；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（T002，北京威格斯生物技術有限公司）；RIPA裂解緩沖液（PC101，上海雅酶生物科技有限公司）；SYBR-Green PCR試劑盒（RT0411-03，嘉興藍諾盛生物科技有限公司）；BCA 試劑盒（WB027，西安浩特生物科技有限公司）；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、ATF2兔源 單 克 隆 抗 體（ab36151、ab231303、ab76011、ab92547、ab239361，上海艾博抗生物科技有限公司）；Transwell 小室（254480，北京明陽科華生物科技有限公司）。

1.1.4 儀器 FluorChem HD2 凝膠成像系統(tǒng)（美國Proteinsimple 公司）；BS-1101 全自動多功能酶標儀（北京華泰和合商貿有限公司）；FACS Calibur 流式細胞儀（美國BD 公司）；Seahorse XF24 分析儀（美國Seahorse 公司）；Thermo Fisherbrand 數(shù)碼生物顯微鏡（上海睿安生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 所有細胞于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和鏈霉素雙抗溶液的DMEM培養(yǎng)基中37 ℃、5%CO2培養(yǎng)。

1.2.2 RT-qPCR 檢測miR-147a 表達 將正常肺組織和非小細胞肺癌組織剪碎并研磨，裂解提取總RNA。將正常肺上皮細胞BEAS-2B 和非小細胞肺癌細胞系 H1703、A549、H1299、L78、PGCL3 接種于12 孔板，85%融合時采用RIPA 裂解提取總RNA，逆轉錄為cDNA 逆轉錄，以cDNA 為模板按SYBRGreen PCR 試劑盒說明書進行RT-qPCR。miR-147a循環(huán)條件：98 ℃ 10 s、55 ℃ 10 s、72 ℃ 90 s，40 個循環(huán)，以 U6 為內參。ATF2 循環(huán)條件：95 ℃ 5 s、60 ℃10 s、72 ℃ 30 s，45 個循環(huán)，以 GAPDH 為內參，2-ΔΔCt法計算，實驗重復3次，引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.3 細胞轉染 取對數(shù)期非小細胞肺癌細胞H1703，1×106個/孔接種于 12 孔板，85% 融合時，根據(jù) Lipofectamine2000 說明書將 miR-NC、pc-NC、miR-147a mimic、pc-ATF2 質粒分別或聯(lián)合轉染至H1703細胞。

1.2.4 雙熒光素酶報告檢測靶向關系 收集對數(shù)生長期 H1703 細胞接種于 24 孔板，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)24 h。將1 μg PGL3-ATF2-WT（ATF2 野生型）或PGL3-ATF2-MUT（ATF2 突變型）及miR-NC 或 miR-147a mimic 和 PRL-CMV 質粒共轉染至 H1703 細胞，轉染48 h 后裂解15 min，雙熒光素酶檢測系統(tǒng)測量熒光素酶相對活性，熒光素酶相對活性（R/F）=螢火蟲熒光素酶活性/腎熒光素酶活性。

1.2.5 Transwell 檢測細胞侵襲 在基底膠包埋的Transwell 小室上室接種按1.2.3 轉染的非小細胞肺癌細胞H1703 懸浮液和不含血清的培養(yǎng)基，終濃度為 2.5×105個/ml，Transwell 小室下室加入含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，取出Transwell小室，5%結晶紫染色，顯微鏡下觀察。

1.2.6 劃痕實驗檢測細胞遷移 將1.2.3 轉染的非小細胞肺癌細胞 H1703 以 1×106個/孔接種于12 孔板，鋪滿單層后用小號槍頭在孔中間垂直劃痕，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)24 h，在劃痕0 h和24 h拍攝圖像，Image J 評估細胞遷移能力，計算劃痕閉合率（%）=（初始寬度-測量寬度）/初始寬度×100%。

1.2.7 Western blot 檢 測 E-cadherin、N-cadherin、Vimentin 和ATF2蛋白表達 采用RIPA 裂解液提取正常肺組織和非小細胞肺癌組織、正常肺上皮細胞BEAS-2B 和不同非小細胞肺癌細胞系及1.2.3 轉染的非小細胞肺癌細胞H1703 總蛋白，BCA 試劑盒定量，SDS-PAGE 分離等量（40 μg）總蛋白，轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉/TBST 封閉2 h。加入一抗（E-cadherin 1∶1 000、N-cadherin 1∶1 000、Vimentin 1∶800、ATF2 1∶1 500）4 ℃孵育過夜，TBST 清洗 3 次，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗（1∶2 000）室溫孵育 1 h，TBST 清洗 3 次，ECL 發(fā)光液顯影，Image-Pro plus 6.0分析蛋白條帶灰度，按下式計算蛋白相對表達，蛋白表達量=目標蛋白積分吸光度/內參蛋白GAPDH積分吸光度。

1.2.8 裸鼠移植瘤實驗 所有裸鼠分為4 組：control 組、miR-147a mimic 組、pc-ATF2、miR-147a+pc-ATF2 組，每組5 只，每只裸鼠左腋下皮下注射100 ml轉染后的非小細胞肺癌細胞H1703（5×106個，PBS 溶解），SPF 級環(huán)境飼養(yǎng)，正常飲食。第 30 天頸椎脫位法處死裸鼠，完整取出皮下腫瘤，免疫組化檢測 N-cadherin 陽性表達，Western blot 檢測 E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達。

1.2.9 免疫組化檢測N-cadherin 陽性表達 石蠟切片經(jīng)脫蠟水化，過氧化物酶阻斷內源性過氧化物酶活性，加入兔源 N-cadherin 單克隆抗體（1∶500）4 ℃孵育過夜，滴加生物素標記二抗，DAB 顯色，蒸餾水沖洗，蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片觀察統(tǒng)計，棕黃色為細胞陽性，隨機選取5 個視野，Image J 計數(shù)陽性細胞，計算陽性細胞百分比（%）。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用GraphPad Prism 5.0 軟件進行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)以表示。兩組間比較采用Student'st檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miR-147a 在非小細胞肺癌中表達下調，而ATF2表達上調 與正常肺組織相比，非小細胞肺癌組織 miR-147a 表達顯著下調（P＜0.01，圖 1A），ATF2 mRNA和蛋白表達顯著上調（P＜0.01，圖1B、C）；與正常肺上皮細胞BEAS-2B 相比，非小細胞肺癌細胞系 H1703、A549、H1299、L78、PGCL3 中 miR-147a表達顯著下調，ATF2 蛋白表達顯著上調（P＜0.01，圖1D、E），H1703 變化最為顯著，因此選取H1703 細胞進行后續(xù)實驗。

圖1 非小細胞肺癌中miR-147a和ATF2表達Fig.1 Expressions of miR-147a and ATF2 in non-smallcell lung cancer cells

2.2 miR-147a 靶向下調 ATF2 表達 Targetscan 軟件預測發(fā)現(xiàn)，miR-147a 與ATF2 存在靶向關系，3'UTR 區(qū)存在結合位點（圖2A）；雙熒光素酶實驗結果顯示，miR-147a與ATF2-WT共轉染顯著降低熒光素酶活性（P＜0.01，圖2B）。與對照組相比，mimic-NC 組miR-147a 表達差異無統(tǒng)計學意義，miR-147a mimic組miR-147a 表達顯著上調（P＜0.01，圖2C），表明轉染成功。與對照組相比，miR-NC 和pc-NC 組H1703細胞ATF2 表達差異無統(tǒng)計學意義，miR-147a mimic組 H1703 細 胞 ATF2 表 達 顯 著 下 調 ，pc-ATF2 組H1703細胞ATF2表達顯著上調（P＜0.01，圖2D）；與miR-147a mimic 組相比，miR-147a mimic+pc-ATF2組 H1703 細 胞 ATF2 表 達 顯 著 上 調（P＜0.01，圖2D）。

圖2 miR-147a與ATF2的靶向關系Fig.2 Targeting relationship between miR-147a and ATF2

2.3 miR-147a 靶向 ATF2 抑制 H1703 細胞侵 襲與對照組相比，miR-NC 和 pc-NC 組 H1703 細胞侵襲數(shù)無明顯變化，miR-147a mimic 組H1703 細胞侵襲數(shù)顯著減少，pc-ATF2 組H1703 細胞侵襲數(shù)顯著增多（P＜0.01，圖3）；與miR-147a mimic 組相比，miR-147a mimic+pc-ATF2組H1703細胞侵襲數(shù)顯著增多（P＜0.01，圖3）。

圖3 Transwell 檢測miR-147a 對H1703 細胞侵襲能力的影響（×200）Fig.3 Effect of miR-147a on invasion ability of H1703 cells detected by Transwell（×200）

2.4 miR-147a 靶向 ATF2 抑制 H1703 細胞遷 移與對照組相比，miR-NC 和pc-NC 組劃痕閉合率無明顯變化，miR-147a mimic 組劃痕閉合率顯著降低，pc-ATF2 組劃痕閉合率顯著升高（P＜0.01，圖4）；與miR-147a mimic 組相比，miR-147a mimic+pc-ATF2組劃痕閉合率顯著升高（P＜0.01，圖4）。

圖4 劃痕實驗檢測miR-147a 對H1703 細胞遷移能力的影響（×100）Fig.4 Effect of miR-147a on migration ability of H1703 cells tested by scratch experiment（×100）

2.5 miR-147a 靶向 ATF2 抑制 H1703 細胞上皮-間質轉化 與對照組相比，miR-NC 和pc-NC 組H1703細胞 E-cadherin、N-cadherin 和 Vimentin 表達差異無統(tǒng)計學意義，miR-147a mimic 組H1703 細胞E-cadherin 表達顯著上調，N-cadherin 和 Vimentin 表達顯著下調，pc-ATF2 組 H1703 細胞 E-cadherin 表達顯著下調，N-cadherin 和 Vimentin 表達顯著上調（P＜0.01，圖 5）；與 miR-147a mimic 組相比，miR-147a mimic+pc-ATF2 組 H1703 細胞 E-cadherin 表達顯著下調，N-cadherin 和 Vimentin 表達顯著上調（P＜0.01，圖5）。

圖5 Western blot 檢測 miR-147a 對 H1703 細胞上皮-間質轉化相關蛋白表達的影響Fig.5 Effect of miR-147a on expressions of epithelialmesenchymal transition-related proteins in H1703 cells detected by Western blot

2.6 miR-147a 靶向 ATF2 抑制 H1703 移植瘤 與對照組相比，miR-147a mimic 組移植瘤中N-cadherin陽性細胞百分比降低，E-cadherin 表達顯著上調，N-cadherin 和 Vimentin 表達顯著下調，pc-ATF2 組移植瘤中N-cadherin 陽性細胞百分比升高，E-cadherin表達顯著下調，N-cadherin 和Vimentin 表達顯著上調（P＜0.01，圖6）；與miR-147a mimic 組相比，miR-147a mimic+pc-ATF2 組移植瘤中N-cadherin 陽性細胞百分比升高，E-cadherin 表達顯著下調，N-cadherin和Vimentin表達顯著上調（P＜0.01，圖6）。

圖6 miR-147a 對裸鼠移植瘤中上皮-間質轉化相關蛋白的影響（×200）Fig.6 Effect of miR-147a on epithelial-mesenchymal transition related proteins in transplanted tumors in nude mice（×200）

3 討論

非小細胞肺癌是癌癥相關死亡的最重要原因，而癌癥轉移導致90%以上癌癥相關死亡［8］。腫瘤細胞侵襲和遷移能力反映腫瘤的轉移能力，因此，尋找能夠抑制非小細胞肺癌侵襲和遷移的新型分子或治療靶標至關重要。

近年研究已證明miRNA 在包括非小細胞肺癌在內的各種腫瘤發(fā)生和轉移中起關鍵作用。miR-147在多種腫瘤中發(fā)揮抑癌作用，如過表達miR-147通過抑制結腸癌上皮-間質轉化而抑制干細胞樣特征［9］；miR-147通過AKT/mTOR 信號通路抑制乳腺癌細胞增殖、侵襲和遷移［10］；miR-147通過抑制HOXC6抑制人肝癌細胞增殖、遷移和化療敏感性［11］。且已有研究表明，miR-147靶向BDNF抑制非小細胞肺癌細胞增殖、遷移和侵襲［6］。本研究表明，與miR-147高度同源的miR-147a 在非小細胞肺癌組織和細胞中低表達，且發(fā)現(xiàn)miR-147a 抑制H1703 細胞遷移、侵襲和上皮-間質轉化。

miRNA 可通過與靶mRNA 3'UTR 結合而誘導mRNA 降解或抑制基因表達。越來越多證據(jù)表明，ATF2是多種miRNA的靶標，如miR-26b、miR-204和miR-622等［12-13］。本研究結果證實ATF2是miR-147a的靶標，且在H1703細胞中受miR-147a調節(jié)。ATF2參與多種調控生物學進展，包括基因轉錄、DNA 損傷、代謝和腫瘤發(fā)生。如ATF2 在腎細胞癌中可預測不良預后和促進惡性表型［14］；ATF2常組蛋白去甲基化酶JMJD1C 下調通過靶向ATF2 抑制結直腸癌轉移［15］；miR-181a和miR-203通過與ATF2相互作用抑制喉癌細胞遷移和侵襲［16］；miR-622 通過直接靶向 ATF2 抑制膠質瘤細胞增殖、侵襲和遷移［12］。本研究表明，miR-147a 過表達減少H1703 細胞侵襲數(shù)，降低劃痕閉合率，共轉染pc-ATF2 可逆轉該作用，與既往研究結論一致，說明miR-147a 靶向pc-ATF2 可抑制H1703 細胞侵襲和遷移，從而抑制H1703細胞轉移。

轉移發(fā)展過程中，調節(jié)細胞與細胞間黏附及細胞與細胞外基質黏附對癌細胞遷移和侵襲至關重要［17］。遷移和進展的初始步驟基本取決于上皮-間質轉化，其特征為特定形態(tài)發(fā)生變化。上皮-間質轉化由一系列復雜事件組成，其標志為上皮細胞與細胞和細胞基底膜附著喪失及間充質樣形態(tài)獲得，伴隨基因表達改變，包括上皮標志物表達（如E-cadherin）減少和間充質標志物（如N-cadherin 和Vimentin）表達增加［18］。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-147a 過表達上調 H1703 細胞 E-cadherin 表達 ，下調 N-cadherin 和Vimentin 表達，共轉染pc-ATF2 可逆轉該作用，說明miR-147a 靶向 pc-ATF2 抑制 H1703 細胞上皮-間質轉化，從而抑制H1703 細胞轉移。E-cadherin 是鈣依賴性跨膜黏附蛋白家族成員之一，主要介導同型細胞間黏附作用。如E-cadherin 表達下降，腫瘤細胞連接松散，也可使腫瘤細胞分裂增殖失控，導致腫瘤細胞從原發(fā)灶脫落而發(fā)生局部或遠處轉移［19］。腫瘤形成過程，N-cadherin 表達有利于腫瘤血管形成，使腫瘤易于生長和轉移［20］。Vimentin 是一種在間質表達的Ⅲ型中間絲狀體蛋白，在上皮細胞遷移及腫瘤侵襲中具有重要作用，與腫瘤浸潤轉移密切相關［21］。

綜上所述，miR-147a 靶向 ATF2 抑制 H1703 細胞遷移、侵襲和上皮-間質轉化。說明miR-147a 和ATF2可成為治療和預防非小細胞肺癌的潛在靶點。本文僅對非小細胞肺癌侵襲、遷移和上皮-間質轉化進行了初步探討，分子機制有待進一步研究。