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    肝癌細(xì)胞外泌體誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2極化后促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移及侵襲①

    2022-08-30 02:47:54孫文兵邢艷瓏吳嗣澤海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像學(xué)教研室海口570102
    中國(guó)免疫學(xué)雜志 2022年12期
    關(guān)鍵詞:肝癌

    孫文兵 邢艷瓏 涂 蓉 吳嗣澤 (海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像學(xué)教研室,海口 570102)

    手術(shù)切除、消融、內(nèi)放射治療和分子靶向治療等方法的廣泛應(yīng)用提高了肝癌的治療效果,但預(yù)后仍較差,肝癌仍是全球第四大癌癥死亡原因,每年死亡人數(shù)近80 萬(wàn)[1-3]。肝癌患者五年生存率僅為5%~30%,肝外轉(zhuǎn)移是肝癌死亡的主要原因[1,4]。明確肝癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制是制定有效干預(yù)措施、提高療效的前提。腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment,TME)由多種物質(zhì)組成,如巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和細(xì)胞外間質(zhì),與腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[5-6]。當(dāng)巨噬細(xì)胞接受不同刺激時(shí),可具有不同表型并分化為不同亞群,主要包括M1 型(經(jīng)典活化型)和M2 型(替代活化型)巨噬細(xì)胞。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophage,TAM)通常被認(rèn)為更接近M2型[7-8]。TME 中出現(xiàn)大量巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)時(shí)往往提示癌癥患者預(yù)后不良[9-11];臨床和實(shí)驗(yàn)研究表明TAMs 可促進(jìn)腫瘤發(fā)生和發(fā)展[12-13]。外泌體是正常細(xì)胞和腫瘤等異常細(xì)胞分泌的脂質(zhì)雙層小囊泡(直徑為30~100 nm),內(nèi)含蛋白質(zhì)、miRNA、DNA、脂質(zhì)、細(xì)胞因子等活性物質(zhì),且Tsg101、CD63 等典型標(biāo)志物呈高表達(dá)[14-16]。外泌體的功能一般是通過(guò)其表面分子與其他細(xì)胞受體靶向結(jié)合實(shí)現(xiàn)的,通過(guò)受體-配體作用、內(nèi)吞或內(nèi)化及與靶細(xì)胞膜融合將miRNA 等成分傳遞至受體細(xì)胞胞漿內(nèi),再與受體細(xì)胞活性成分相互作用,從而引起相應(yīng)功能改變[14,17]。相比于正常肝細(xì)胞,分離自肝癌細(xì)胞的外泌體中有3 種miRNA(miR-21、miR-151 和 miR-221)呈異常高表達(dá)[18]。課題組假設(shè)外泌體在肝癌細(xì)胞與巨噬細(xì)胞間起交通作用,通過(guò)傳遞活性生物分子(如miRNA)將巨噬細(xì)胞激活為T(mén)AMs,進(jìn)而對(duì)肝癌轉(zhuǎn)移起促進(jìn)作用。本研究主要觀察肝癌細(xì)胞與其周?chē)奘杉?xì)胞的相互作用,探討肝癌轉(zhuǎn)移的可能機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 細(xì)胞 正常肝細(xì)胞(7702)、肝癌細(xì)胞(Huh-7)、小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞(RAW264.7)均購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

    1.1.2 主要儀器 CS150GX2 超速離心機(jī)、HT-7700 透射電鏡(HITACHI);T100 基因擴(kuò)增儀(Bio-Rad);SYNERGY/H1 多功能酶標(biāo)儀(BioTek);Nano-Drop One 分光光度儀(Thermo);MX3005P 熒光定量分析儀(Agilent);DM4B 正置熒光顯微鏡(Leica);Champchemi Top610 凝膠成像化學(xué)發(fā)光一體機(jī)(北京賽備);FV1000 共聚焦激光掃描生物顯微鏡(Olympus)。

    1.1.3 主要試劑 胎牛血清(四季青);劃痕實(shí)驗(yàn)插件、基質(zhì)膠、0.4 μm 及 8 μm 聚碳酸酯膜Transwell(Corning);UR52301 外泌體蛋白檢測(cè)試劑盒、UR52303 外泌體熒光標(biāo)記染料 PKH67(Umibio);人TGF-β 及IL-10 ELISA 試劑盒(翼飛雪);轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000(Thermo);miRNA 模擬物(廣州銳博);RNA 提取試劑盒(Foregene);MonScriptTMRTⅢ一體化混合dsDNase 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR 試劑盒(Monad Biotech);GeneAmp RNA PCR Kit 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Applied Biosystems)。

    1.2 方法

    1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 7702、Huh-7、RAW264.7細(xì)胞復(fù)蘇后采用含10%胎牛血清及1%三抗的高糖DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2中培養(yǎng)。當(dāng)生長(zhǎng)至80%~90%密度時(shí),采用0.25%EDTA 胰蛋白酶消化或直接用移液器將細(xì)胞沖下,1 000 r/min 離心5 min 傳代,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    1.2.2 肝癌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的共培養(yǎng) 采用0.4 μm聚碳酸酯膜細(xì)胞培養(yǎng)小室共培養(yǎng)7702、Huh-7和 RAW264.7 細(xì)胞,將約 1 ml 重懸的 Huh-7 或 7702細(xì)胞置于上室(5×104個(gè)),2 ml重懸的RAW264.7 細(xì)胞置于下室(5×103個(gè)),共同培養(yǎng)24 h后顯微鏡下觀察并分別收集離心,-80 ℃凍存用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    1.2.3 外泌體提取 依次采用T25、T75 至T175 培養(yǎng)瓶培養(yǎng)Huh-7 及RAW264.7 細(xì)胞,80%~90%密度時(shí)1×PBS 清洗3 次,加入無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h,超速離心法進(jìn)行外泌體提取[15]。100 μl/份重懸,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.4 透射電子顯微鏡(TEM) 新鮮制備的外泌體(2 μl)用20 ml PBS稀釋?zhuān)?0 μl滴加于200目方華膜銅網(wǎng),靜置2 min 后用濾紙從側(cè)面吸取多余浮液,加入10 μl 0.5%磷鎢酸溶液(pH=6.8),室溫下復(fù)染5 min,濾紙吸取浮液后常溫晾干,透射電鏡觀測(cè),獲取不同放大比例圖像。

    1.2.5 Western blot 按照超速離心法從細(xì)胞條件培養(yǎng)基中提取外泌體,細(xì)胞刮刮下貼壁細(xì)胞,裂解,-80 ℃保存?zhèn)溆?。采用外泌體蛋白檢測(cè)試劑盒按照說(shuō)明書(shū)對(duì)細(xì)胞及其分泌的外泌體進(jìn)行CD63 和TSG101蛋白檢測(cè)。

    1.2.6 共聚焦顯微鏡觀察 采用綠色熒光標(biāo)記的染料PKH67 按照說(shuō)明書(shū)標(biāo)記Huh-7 細(xì)胞來(lái)源外泌體:采用 Diluent C 稀釋配制濃度為 100 μmol/L 的染料工作液;加入外泌體及 PBS 重懸,100 000 g、4 ℃超速離心70 min。去除上清,重懸染色后的外泌體加至巨噬細(xì)胞培養(yǎng)皿,37 ℃孵育12 h,多聚甲醛固定,DAPI染色細(xì)胞核,激光共聚焦顯微鏡觀察。

    1.2.7 ELISA 離心移除細(xì)胞碎片后收集上清,按梯度濃度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品至300、200、100、50、25 ng/L,加入待測(cè)樣品及樣品稀釋液10、40 μl 混勻,溫育40 min,已稀釋至1×洗滌液洗滌約30 s,重復(fù)5遍,滴加酶標(biāo)試劑50 μl,空白孔不加,再次重復(fù)溫育及洗滌步驟,依次加入顯色劑 A、B 各 50 μl 孵育 15 min,50 μl/孔滴加終止液,約 10 min 后檢測(cè) 450 nm 處OD值。

    1.2.8 劃痕愈合試驗(yàn)觀察肝癌細(xì)胞Huh-7 遷移分別培養(yǎng)Huh-7 細(xì)胞、RAW264.7 細(xì)胞及與Huh-7細(xì)胞共培養(yǎng)的 RAW264.7 細(xì)胞(TAMs),劃痕實(shí)驗(yàn)插件消毒后置于6 孔板,Huh-7 細(xì)胞消化離心,1×106個(gè)/ml分別加入每個(gè)插件200 μl,分別加入PBS(NC)、RAW264.7 外泌體(RAW264.7-Ex)、TAM 外泌體(TAM-Ex)37 ℃孵育24 h,TAM 來(lái)源于前述與Huh-7 細(xì)胞共培養(yǎng)后的RAW264.7 細(xì)胞,外泌體濃度為 10 μg/ml,取掉插件,無(wú)血清DMEM 培養(yǎng),分別于 0 h、24 h 顯微鏡下取圖,Image J 計(jì)算劃痕面積減少百分比,Graphpad Prism 8.0制圖及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

    1.2.9 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 采用24 孔8 μm Transwell小室進(jìn)行細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn):基質(zhì)膠稀釋后室鋪于小室上室孵育過(guò)夜,分別在小室上室加入Huh-7 細(xì)胞及PBS(NC)、Huh-7 細(xì) 胞 及 RAW264.7 外 泌 體(RAW264.7-Ex)、Huh-7細(xì)胞及TAM外泌體(TAM-Ex)(2×104個(gè)/200 μl),TAM 來(lái)源于前述與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)的RAW264.7 細(xì)胞,外泌體濃度為10 μg/ml,下室加入800 μl 10%胎牛血清完全培養(yǎng)基孵育24 h,棉簽擦去上層細(xì)胞,4%多聚甲醛固定,0.01%結(jié)晶紫染色,顯微鏡下觀察,取圖,Image J 進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),Graphpad Prism 8.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

    1.2.10 qRT-PCR 細(xì)胞消化離心后采用RNA 提取試劑盒按照說(shuō)明提取收集RNA 溶液后采用分光光度計(jì)進(jìn)行濃度測(cè)定,按照50 μl標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行配平。采用MonScriptTMRT Ⅲ一體化混合試劑盒或GeneAmp RNA PCR 試劑盒按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,采用MonAmpTMChemoHS qPCR Mix 試劑盒按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行擴(kuò)增,以GAPDH 或U6 為內(nèi)參計(jì)算目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄水平,2-ΔΔCt法量化相對(duì)基因表達(dá),引物序列見(jiàn)表1。

    表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequences of qRT-PCR

    1.2.11 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 RAW264.7細(xì)胞采用不含三抗和血清的培養(yǎng)基清洗2 次,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/ml,500 μl/孔加入6 孔板孵育12 h。miRNA模擬物與脂質(zhì)體及培養(yǎng)基混勻靜置20 min。將上述混合物加入細(xì)胞中,搖勻,繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Graphpad Prism 8.0 軟件分析制圖,數(shù)據(jù)以或中位數(shù)(IQR范圍)表示。兩組比較采用t檢驗(yàn),P<0.05(雙尾)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 肝癌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后導(dǎo)致巨噬細(xì)胞M2 樣改變 為判斷肝癌細(xì)胞是否能作用于其微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞,分別采用7702 與RAW264.7 細(xì)胞共培養(yǎng)(NC 組)、Huh-7 與 RAW264.7 細(xì)胞共培養(yǎng)(HR 組)24 h,顯微鏡下可見(jiàn)與7702 細(xì)胞共培養(yǎng)的RAW264.7 細(xì)胞形態(tài)規(guī)則,大部分呈類(lèi)圓形,而與Huh-7 共培養(yǎng)的RAW264.7 細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,主要呈多角形(圖1A)。Huh-7 組巨噬細(xì)胞M2 型標(biāo)志物CD206 及 Arg-1 水平顯著高于 7702 組(圖 1B),IL-10、TGF-β蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組(圖1C)。表明肝癌細(xì)胞可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化為T(mén)AMs。

    圖1 與Huh-7細(xì)胞共培養(yǎng)后RAW264.7細(xì)胞呈M2樣改變Fig.1 M2-like macrophages were found after co-culture with Huh-7 cells of RAW264.7 cells

    2.2 外泌體鑒定及追蹤 為了解肝癌細(xì)胞是否通過(guò)外泌體極化巨噬細(xì)胞,本研究提取肝癌細(xì)胞外泌體并進(jìn)行表征,透射電鏡顯示Huh-7 細(xì)胞分泌的外泌體切面圖呈圓盤(pán)狀,直徑50~100 nm(圖2A);Western blot 顯示,外泌體典型生物標(biāo)志物TSG101、CD63 均呈陽(yáng)性(圖2B),證實(shí)提取的球體為外泌體。采用綠色熒光標(biāo)記的染料PKH67 標(biāo)記Huh-7 細(xì)胞外泌體與RAW264.7 細(xì)胞進(jìn)行共孵育顯示,外泌體進(jìn)入巨噬細(xì)胞胞漿(圖2C)。表明肝癌細(xì)胞可能通過(guò)外泌體通訊極化巨噬細(xì)胞。

    圖2 外泌體鑒定及追蹤Fig.2 Identification and tracking of exosomes

    2.3 肝癌細(xì)胞外泌體中miRNA 介導(dǎo)巨噬細(xì)胞激活 qRT-PCR 及 ELISA 結(jié)果顯示,Huh7-Ex 組巨噬細(xì)胞M2型標(biāo)志物CD206、Arg-1 mRNA表達(dá)及IL-10、TGF-β 蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組(圖3A、B)。證明肝癌細(xì)胞通過(guò)外泌體向巨噬細(xì)胞傳遞某種生物信息物質(zhì)導(dǎo)致其功能轉(zhuǎn)變。分別檢測(cè)Huh7-Ex 與7702-Ex 中 miR-21、miR-151 和 miR-221 表達(dá),結(jié)果顯示來(lái)源于Huh-7 外泌體的miRNA 水平均高于來(lái)源于 7702 的外泌體(圖 3C)。上述 3 種 miRNA 模擬物及陰性對(duì)照miRNA 轉(zhuǎn)染RAW264.7 細(xì)胞后檢測(cè)其 M2 型標(biāo)志物,僅有 miR-151 促進(jìn) CD206 及 Arg-1表達(dá)(圖3D)。因此推斷肝癌細(xì)胞高表達(dá)miR-151,通過(guò)外泌體內(nèi)化被轉(zhuǎn)運(yùn)至巨噬細(xì)胞,使后者得到不同表型,介導(dǎo)TAMs激活。

    圖3 肝癌細(xì)胞外泌體miRNA介導(dǎo)TAMs活化Fig.3 Exosomal miRNA derived from HCC cells mediates TAMs activation

    2.4 TAMs 促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移及侵襲 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)和Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,相對(duì)于NC 組,添加了RAW264.7 外泌體組細(xì)胞遷移及侵襲能力未見(jiàn)明顯變化,而添加了TAMs 外泌體組遷移及侵襲能力明顯提高(圖4)。表明TAMs 可促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移及侵襲。

    圖4 TAMs促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移及侵襲Fig.4 TAMs promote migration and invasion of HCC cells

    3 討論

    TME 是一種由細(xì)胞間通訊調(diào)控的動(dòng)態(tài)系統(tǒng),與腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[19-22]。作為T(mén)ME中的主要基質(zhì)細(xì)胞,巨噬細(xì)胞可塑性極強(qiáng),不同刺激作用下出現(xiàn)不同表型,包括M1 型(抑制腫瘤)和M2 型(促進(jìn)腫瘤)[23]。TAMs 通常被認(rèn)為是 CD206、Arg-1、IL-10、TGF-β 呈高表達(dá)的 M2 型巨噬細(xì)胞[7-8]。本研究采用肝癌細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)體系模擬了腫瘤及其微環(huán)境,結(jié)果顯示與肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞呈多角形,qRT-PCR 及ELISA 檢測(cè)上述M2 型標(biāo)志物表達(dá)均顯著提高,說(shuō)明肝癌細(xì)胞能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞成為T(mén)AMs。

    外泌體是一種富含多種生物信息成分的物質(zhì),是腫瘤導(dǎo)致系統(tǒng)性地改變的一種重要載體[14]。miRNA是由18~25個(gè)核苷酸組成的、進(jìn)化保守的、具有調(diào)控功能的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA 分子,通過(guò)對(duì)靶mRNA 剪切或抑制靶mRNA 翻譯調(diào)控基因表達(dá),從而對(duì)靶基因?qū)嵤┺D(zhuǎn)錄后水平調(diào)控[24]。外泌體中包裹大量miRNA,miRNA 可通過(guò)外泌體在細(xì)胞間轉(zhuǎn)運(yùn)并在功能上影響靶細(xì)胞[25-27]。研究表明肝癌細(xì)胞通過(guò)外泌體傳遞miRNA至TME中的細(xì)胞,改變其表型及功能,如肝癌細(xì)胞可通過(guò)外泌體let-7i-5p 與其周?chē)h(huán)境中未轉(zhuǎn)化的肝細(xì)胞交流誘導(dǎo)肝細(xì)胞為肝癌相關(guān)細(xì)胞[28];肝癌細(xì)胞分泌的miR-103 可通過(guò)外泌體傳遞到內(nèi)皮細(xì)胞,降低血管內(nèi)皮鈣黏蛋白(VE-Cad)等蛋白表達(dá)削弱內(nèi)皮連接完整性,促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[29];肝癌細(xì)胞外泌體進(jìn)入成纖維細(xì)胞后通過(guò)miR-1247-3p 將成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞[30]。本研究顯示,miR-151 在肝癌細(xì)胞外泌體中異常高表達(dá),并能將巨噬細(xì)胞極化為T(mén)AMs。miR-15l位于染色體8q24.3區(qū)域,在包括肝癌在內(nèi)的多種腫瘤中高表達(dá),包含2個(gè)成熟序列:miR-151-5p和miR-151-3p,但兩者具有不同功能。其中miR-151-5p可直接靶向作用于Rho GTPase 通路的負(fù)調(diào)節(jié)因子(RhoGDIA),抑制其mRNA及蛋白表達(dá),增強(qiáng)細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移能力,在肝癌轉(zhuǎn)移中起促進(jìn)作用[31-32]。miR-151-3p 有2 種作用形式:腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞衍生的外泌體miR-151-3p 靶向細(xì)胞黏附分子CHL1,通過(guò)調(diào)控TGF-β通路進(jìn)而增強(qiáng)骨肉瘤細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化及侵襲能力[33];LIU 等[34]研究則顯示 miR-151-3p 在巨噬細(xì)胞中可靶向STAT3,并抑制IL-6 生成。因此,miR-151 的作用機(jī)制較復(fù)雜,其是否還有其他功能有待進(jìn)一步研究。以上結(jié)果表明肝癌進(jìn)展與轉(zhuǎn)移是多方面因素的綜合作用,miR-151 既可直接增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞遷移及侵襲能力,也能通過(guò)極化巨噬細(xì)胞間接促進(jìn)腫瘤惡性表型。miR-151 如何作用于巨噬細(xì)胞靶點(diǎn)及相應(yīng)信號(hào)通路而導(dǎo)致其M2 極化將是課題組進(jìn)一步研究重點(diǎn)。

    TAMs 外泌體被證實(shí)積極參與癌癥轉(zhuǎn)移進(jìn)展過(guò)程。LAN 等[20]研究顯示,TAMs 通過(guò)將外泌體傳遞至結(jié)腸癌細(xì)胞增強(qiáng)其侵襲能力;TAMs 通過(guò)外泌體向肝癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)運(yùn)整合素(αMβ2),增強(qiáng)其轉(zhuǎn)移潛能[35]。本研究結(jié)果與上述研究一致,TAMs 來(lái)源外泌體顯著提升了肝癌細(xì)胞遷移及侵襲能力。

    綜上所述,肝癌細(xì)胞通過(guò)外泌體傳遞miR-151將巨噬細(xì)胞極化為具有M2 表型的TAMs,TAMs 反過(guò)來(lái)又促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移及侵襲,增加腫瘤轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。課題組從腫瘤細(xì)胞與巨噬細(xì)胞的相互作用角度進(jìn)一步分析了肝癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)機(jī)制,將為有效防控肝癌轉(zhuǎn)移和提出更優(yōu)治療策略提供參考。

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