白術多糖通過調控線粒體凋亡途徑誘導人子宮內膜癌RL95-2細胞凋亡

楊寶芹 劉高仁 邵艷社 王自闖 （河南省中醫(yī)院婦產科，鄭州 450003）

子宮內膜癌（endometrial carcinoma，EC）是當今社會最常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一［1］。據(jù)不完全統(tǒng)計，全球范圍內每年超過20 萬女性患有EC，其病死率僅次于女性同類型惡性腫瘤中的宮頸癌和卵巢癌［2］。目前為止，EC 的主要治療方法是手術，然后是輔助放射治療和化療；然而，這些療法并未有效減少EC 病死的風險，EC 術后2~3 年的復發(fā)率仍超過60%［3］。近些年，中國傳統(tǒng)醫(yī)學在一些疾病的治療上發(fā)揮了很好的療效［4］。白術是中國傳統(tǒng)醫(yī)學的重要組成部分，用于治療各種類型的疾病，白術多糖（polysaccharide ofAtractylodes macrocephala，PAM）是中藥白術的有效成分，已被證明具備包括抗腫瘤、抗氧化、抗微生物、抗炎等在內的多種生物學功能［5］。研究顯示，PAM 對食管癌 Eca-109 細胞、人白血病U937 及Jurkat 細胞均具有很好的凋亡促進作用［6-7］。而目前尚未有關于PAM對EC細胞增殖或凋亡影響的相關研究報道。本研究旨在從體外基礎實驗出發(fā)，探究PAM 對人EC RL95-2 細胞凋亡的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人EC RL95-2細胞株（中科院細胞庫）；胎牛血清、青霉素鏈霉素混合液、RPMI1640 培養(yǎng)基（美國Gibco）；PAM（HPLC≥90%，wkq-08928，四川維克奇生物）；四唑鹽（MTT）細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒（北京索萊寶）；Annexin V-FITC/PI 雙染細胞凋亡檢測試劑盒（上海貝博生物）；線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1染色法）、Caspase9活性檢測試劑盒、細胞線粒體分離試劑盒（上海碧云天生物）；BCA 蛋白定量測定試劑盒、全蛋白提取試劑盒（南京建成生物）；兔抗細胞色素C（cytochrome C，Cyt C）（貨號：10993-1-AP）、兔抗細胞色素C氧化酶Ⅳ（cytochrome C oxidase Ⅳ，COX Ⅳ，貨號：11242-1-AP）、兔抗肌動蛋白（β-actin，貨號：20536-1-AP）、兔抗B 淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2，貨號：12789-1-AP）、兔抗Bcl-2 相關X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax，貨號：50599-2-Ig）（武漢三鷹生物）；兔抗裂解型半胱天冬酶3（cleaved-Caspase3，貨號：ab2302）、山羊抗兔IgG二抗（貨號：ab97051）購自英國Abcam。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 采用含有100 U/ml 青霉素、0.1 mg/ml 鏈霉素和10%胎牛血清的RPMI1640 完全培養(yǎng)基，在溫度為37 ℃、5%CO2體積分數(shù)、飽和濕度的條件下培養(yǎng)RL95-2 細胞。根據(jù)細胞生長狀態(tài)定期換液，待細胞接近長滿培養(yǎng)瓶底部時，用0.25%的胰酶消化傳代。在正式實驗開始之前，需對細胞進行同步化培養(yǎng)處理后再進行分組及藥物處理。

1.2.2 MTT法檢測PAM對RL95-2細胞增殖變化的影響 取生長旺盛的RL95-2 細胞，以1.0×105個/ml濃度接種于96 孔培養(yǎng)板。將細胞分為7 組：空白對照組（僅加DMSO）、不同濃度藥物組（分別加入溶解于DMSO中的7.5、15、30、60、120、240 mg/ml PAM），每組設置3 個平行復孔。分別在24 h、48 h 和72 h時測量各孔細胞的吸光度（OD）并記錄，計算藥物組細胞在不同生長時間點的增殖率，細胞增殖率（%）=藥物組平均OD 值/對照組平均OD 值×100%。所得數(shù)據(jù)以時間點為橫坐標，以增殖率為縱坐標，繪制藥物組細胞增殖率隨時間的變化圖，并采用Bliss 法計算PAM 在3 個不同時間點對RL95-2 細胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）。

1.2.3 Annexin V-FITC/PI 雙染檢測 RL95-2 細胞凋亡水平 按1.2.2方法接種細胞后將細胞分為4組：空白對照組（僅加DMSO）、不同濃度藥物組（溶解于DMSO 中的15、30、60 mg/ml PAM），每組設置3 個平行復孔，加藥后常規(guī)培養(yǎng)48 h，參照Annexin V-FITC/PI 雙染細胞凋亡檢測試劑盒相關操作，依次經過離心收集細胞、重懸離心棄上清、染色避光孵育等步驟處理各組細胞，并及時進行流式細胞儀檢測。根據(jù)象限圖統(tǒng)計細胞總凋亡率，一般將第二象限和第四象限的細胞占比之和定義為細胞的總凋亡率。

1.2.4 JC-1 染色法檢測RL95-2 細胞線粒體膜電位變化 按1.2.3方法進行細胞培養(yǎng)和分組。常規(guī)培養(yǎng)48 h 后參考線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1 染色法）相關操作，依次經過離心收集細胞、染色避光孵育、離心收集細胞、緩沖液重懸細胞等步驟處理各組細胞，并及時進行流式細胞儀檢測。一般將第二象限B2細胞占比與第四象限B4細胞占比的比值看作線粒體膜電位的高低變化程度。

1.2.5 Western blot 檢測RL95-2 細胞線粒體Cyt C釋放及凋亡相關蛋白表達 按1.2.3方法進行細胞培養(yǎng)和分組。48 h后分離各組細胞的線粒體蛋白和細胞質蛋白，并對所提蛋白進行濃度檢測，然后依次經過蛋白變性、蛋白上樣、SDS-PAGE 凝膠電泳、轉膜、封閉和洗膜后，分別加入一抗Cyt C（1∶1 000）、COX Ⅳ（線粒體蛋白內參，1∶1 500）、β-actin（細胞質蛋白內參，1∶1 000）；而對于凋亡蛋白的檢測實驗，則按照全蛋白提取試劑盒分別提取各組RL95-2 細胞蛋白；僅抗體信息變化如下：一抗Bcl-2（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）；cleaved-Caspase3（1∶1 200）；β-actin（1∶1 000），在4 ℃下孵育過夜；PBS洗膜后加入羊抗兔IgG 二抗（1∶5 000）室溫孵育0.5 h；PBS 再次洗膜后用ECL 化學放光進行顯色觀察；凝膠成像系統(tǒng)分析各指標灰度值。

1.2.6 分光光度法檢測RL95-2 細胞Caspase9 酶的活性 按1.2.3方法進行細胞培養(yǎng)和分組。常規(guī)培養(yǎng)48 h 后，參考Caspase9 活性檢測試劑盒相關操作，依次經過離心收集細胞、裂解細胞收集上清、加工作液孵育、酶標儀吸光度測定和標準曲線制作等步驟計算各組細胞Caspase9酶的活性。

1.3 統(tǒng)計學分析 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行分析處理，計量資料均以表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用One-Way ANOVA 分析，組間兩兩比較采用Tukey檢驗，P＜0.05代表差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PAM呈濃度和時間依賴性地抑制RL95-2細胞增殖 如圖1A 所示，同時間點細胞增殖率隨PAM濃度的增加而降低，且同濃度下細胞增殖率隨時間的增加而降低，提示PAM 呈明顯的時間和濃度依賴性地抑制RL95-2 細胞增殖。如圖1B 所示，根據(jù)Bliss法計算得出PAM在24 h、48 h和72 h時，RL95-2細胞的 IC50值分別為 142.12±5.72、69.67±4.99 和34.68±3.74，三者比較差異有統(tǒng)計學意義（F=253.904，P=0.000）；與 24 h 相比，48 h 和 72 h 的 IC50差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）；72 h 的IC50與48 h相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

圖1 PAM呈濃度和時間依賴性地抑制RL95-2細胞增殖Fig.1 PAM inhibited proliferation of RL95-2 cells in a concentration and time-dependent manner

2.2 PAM 促進 RL95-2 細胞凋亡 如圖 2 所示，與空白對照組相比，藥物組（15、30、60 mg/ml PAM）RL95-2 細胞凋亡率均顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）。

圖2 PAM促進RL95-2細胞凋亡Fig.2 PAM promoted apoptosis of RL95-2 cells

2.3 PAM 促進RL95-2 細胞線粒體膜電位的降低如圖3 所示，與空白對照組相比，藥物組（15、30、60 mg/ml PAM）RL95-2 細胞線粒體膜電位均顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。

圖3 PAM促進RL95-2細胞線粒體膜電位的降低Fig.3 PAM promoted decreased of mitochondrial membrane potential in RL95-2 cells

2.4 PAM 促進RL95-2 細胞線粒體中 Cyt C 的釋放 如圖4 所示，所提取的線粒體蛋白中無細胞質特異性蛋白β-actin 表達，而所提取的細胞質蛋白中無線粒體特異性蛋白COXⅣ表達，表明所提取蛋白純度均較高，無相互交叉污染。與空白對照組相比，3 個藥物組（15、30、60 mg/ml PAM）RL95-2 細胞線粒體中Cyt C蛋白表達量均顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01），細胞質中Cyt C 蛋白表達量顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）。

圖4 PAM促進RL95-2細胞線粒體中Cyt C的釋放Fig.4 PAM promoted release of Cyt C in RL95-2 cells in mitochondria

2.5 PAM 促進 RL95-2 細胞中 Caspase9 酶的活性如圖5 所示，與空白對照組相比，3 個藥物組（15、30、60 mg/ml PAM）RL95-2 細胞中 Caspase9 酶的活性均顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。

圖5 PAM促進RL95-2細胞中Caspase9酶的活性Fig.5 PAM promoted activity of Caspase9 enzyme in RL95-2 cells

2.6 PAM 促進線粒體凋亡信號通路的激活 如圖 6 所示，與空白對照組相比，3 個藥物組（15、30、60 mg/ml PAM）RL95-2 細胞中抑凋亡蛋白 Bcl-2 的相對表達量顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）；而促凋亡蛋白 Bax 和 cleaved-Caspase3 的相對表達量顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）。

圖6 PAM促進線粒體凋亡信號通路的激活Fig.6 PAM promoted activation of mitochondrial apoptosis signaling pathway

3 討論

EC是臨床上較為常見的女性惡性腫瘤之一，當前的治療方法主要以手術輔助放化療為主，預后較差是其臨床治愈率較低的主要原因。近些年，關于PAM 對于癌癥的藥理作用研究已有相關報道，這為PAM 臨床治療癌癥提供了很好的基礎理論。例如，體外研究顯示PAM 能通過線粒體凋亡信號通路促進人食管癌細胞Eca109 凋亡，促進細胞阻滯在S期［6］。體內抗腫瘤實驗表明，PAM 能通過阻滯 S 期肝癌細胞H22，進而抑制受體小鼠腫瘤的生長，發(fā)揮其抗腫瘤活性［8］。對神經膠質瘤C6 細胞進行藥理學相關研究發(fā)現(xiàn)，PAM 可顯著抑制上述細胞的增殖，促進其凋亡，其機制可能與線粒體凋亡信號通路密切相關［9］。本研究發(fā)現(xiàn)，PAM 作用 EC 細胞RL95-2的 48 h IC50為69.67 mg/ml，且PAM 隨時間和劑量依賴性地抑制RL95-2 細胞增殖。進一步實驗顯示，60 mg/ml的PAM 可顯著促進RL95-2細胞的凋亡、線粒體膜電位的降低及Cyt C的釋放；同時，細胞內Caspase9 酶的活性顯著增加，線粒體凋亡信號通路被激活。以上結果表明，PAM 可有效作用于EC細胞RL95-2，其發(fā)揮的凋亡促進作用可能與線粒體凋亡通路有關。

本研究證明了PAM 誘導EC 細胞凋亡可能與線粒體凋亡信號通路的激活有關。線粒體通路和死亡受體通路是當前公認的兩種細胞內凋亡信號通路，Bcl-2 蛋白家族成員參與線粒體通路的調控。Bcl-2 蛋白家族分為兩大類：以 Bcl-2、Bcl-xl 為代表的抗凋亡蛋白和以Bax、Bad 為代表的促凋亡蛋白［10］。Bcl-2家族是最早發(fā)現(xiàn)的一組重要蛋白，其可改變線粒體外膜的通透性，從而調節(jié)線粒體凋亡蛋白的釋放量。Bcl-2 是第一個被發(fā)現(xiàn)的細胞凋亡抑制蛋白，其不依賴細胞分裂來阻止程序性細胞凋亡；Bax 從細胞質轉位至線粒體誘導Cyt C 的釋放，進而引起下游Caspase 家族的凋亡執(zhí)行；而抗凋亡蛋白Bcl-2 過表達可抑制促凋亡蛋白Bax 轉位至線粒體，導致細胞異常增殖和異常存活［11］。由此可見，細胞內Bcl-2 與Bax 的動態(tài)平衡是控制細胞生存或凋亡的關鍵。本研究結果顯示，藥物組較對照組細胞Bcl-2 蛋白相對表達量顯著減少，而Bax 及下游凋亡執(zhí)行者cleaved-Caspase3 的蛋白相對表達量顯著增多，Bcl-2 與Bax 的動態(tài)平衡被打破，癌細胞凋亡進程加速，提示PAM 的作用機制與激活線粒體凋亡信號通路有關。

此外，Cyt C 從線粒體釋放到細胞質中激活Caspase常常導致線粒體通路的激活。在眾多誘導細胞凋亡的蛋白中，Caspase 是執(zhí)行凋亡刺激、誘導細胞死亡所必需的蛋白。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，PAM 處理組的細胞線粒體與細胞質中的Cyt C 蛋白表達呈相反趨勢，且細胞中Caspase9 的活性及cleaved-Caspase3的表達量顯著增加。提示線粒體凋亡途徑的發(fā)生效應通常導致Cyt C由線粒體釋放至細胞質中，伴隨下游Caspase 家族部分成員的活化，PAM 確實激活了線粒體凋亡信號通路。

此外，PAM 還可通過其他途徑發(fā)揮其免疫調節(jié)及抗腫瘤作用。例如，在以小鼠淋巴細胞為研究對象時發(fā)現(xiàn)，PAM 可活化T 淋巴細胞并同時增強Th1和Th2 型免疫反應，其機制可能與其對NF-κB 信號通路的抑制作用有關［12］。在進行小鼠結腸癌HT-29細胞原位移植瘤生長相關研究時發(fā)現(xiàn)，PAM 主要通過增加MHCⅡ和IL-12 在樹突狀細胞和巨噬細胞中的表達水平以及增加CD4+及CD8+細胞分泌IFN-γ的能力來抑制腫瘤生長［13］。在研究肺癌模型大鼠的免疫功能時發(fā)現(xiàn)，PAM 可有效降低模型組大鼠肺指數(shù)，提升其脾臟和胸腺指數(shù)以及外周血中白細胞和溶菌酶含量，其作用機制可能與其能夠增強肺癌模型大鼠機體免疫功能，抑制癌細胞增殖并誘導凋亡有關［14］。在體外研究肝癌細胞的惡性生物學習性時發(fā)現(xiàn)，PAM 對肝癌細胞的體外增殖和侵襲能力具有抑制作用，其可能通過影響Wnt/β-catenin 信號通路發(fā)揮作用［15］。

本研究發(fā)現(xiàn)，白術多糖可通過激活線粒體凋亡信號通路導致癌細胞Bcl-2 與Bax 的失衡，線粒體中Cyt C 向細胞質釋放，下游Caspase 家族中Caspase9酶活性及cleaved-Caspase3 活性增加，進而促進EC細胞RL95-2 的凋亡發(fā)生。本研究初步探究了白術多糖促EC 細胞RL95-2 的凋亡機制，為白術多糖臨床治療人EC奠定了理論基礎。