楊寶芹 劉高仁 邵艷社 王自闖 (河南省中醫(yī)院婦產(chǎn)科,鄭州 450003)
子宮內(nèi)膜癌(endometrial carcinoma,EC)是當(dāng)今社會(huì)最常見(jiàn)的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一[1]。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì),全球范圍內(nèi)每年超過(guò)20 萬(wàn)女性患有EC,其病死率僅次于女性同類型惡性腫瘤中的宮頸癌和卵巢癌[2]。目前為止,EC 的主要治療方法是手術(shù),然后是輔助放射治療和化療;然而,這些療法并未有效減少EC 病死的風(fēng)險(xiǎn),EC 術(shù)后2~3 年的復(fù)發(fā)率仍超過(guò)60%[3]。近些年,中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)在一些疾病的治療上發(fā)揮了很好的療效[4]。白術(shù)是中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的重要組成部分,用于治療各種類型的疾病,白術(shù)多糖(polysaccharide ofAtractylodes macrocephala,PAM)是中藥白術(shù)的有效成分,已被證明具備包括抗腫瘤、抗氧化、抗微生物、抗炎等在內(nèi)的多種生物學(xué)功能[5]。研究顯示,PAM 對(duì)食管癌 Eca-109 細(xì)胞、人白血病U937 及Jurkat 細(xì)胞均具有很好的凋亡促進(jìn)作用[6-7]。而目前尚未有關(guān)于PAM對(duì)EC細(xì)胞增殖或凋亡影響的相關(guān)研究報(bào)道。本研究旨在從體外基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)出發(fā),探究PAM 對(duì)人EC RL95-2 細(xì)胞凋亡的影響及其作用機(jī)制。
1.1 材料 人EC RL95-2細(xì)胞株(中科院細(xì)胞庫(kù));胎牛血清、青霉素鏈霉素混合液、RPMI1640 培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco);PAM(HPLC≥90%,wkq-08928,四川維克奇生物);四唑鹽(MTT)細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(北京索萊寶);Annexin V-FITC/PI 雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(上海貝博生物);線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-1染色法)、Caspase9活性檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞線粒體分離試劑盒(上海碧云天生物);BCA 蛋白定量測(cè)定試劑盒、全蛋白提取試劑盒(南京建成生物);兔抗細(xì)胞色素C(cytochrome C,Cyt C)(貨號(hào):10993-1-AP)、兔抗細(xì)胞色素C氧化酶Ⅳ(cytochrome C oxidase Ⅳ,COX Ⅳ,貨號(hào):11242-1-AP)、兔抗肌動(dòng)蛋白(β-actin,貨號(hào):20536-1-AP)、兔抗B 淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2,貨號(hào):12789-1-AP)、兔抗Bcl-2 相關(guān)X 蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax,貨號(hào):50599-2-Ig)(武漢三鷹生物);兔抗裂解型半胱天冬酶3(cleaved-Caspase3,貨號(hào):ab2302)、山羊抗兔IgG二抗(貨號(hào):ab97051)購(gòu)自英國(guó)Abcam。
1.2 方法
1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 采用含有100 U/ml 青霉素、0.1 mg/ml 鏈霉素和10%胎牛血清的RPMI1640 完全培養(yǎng)基,在溫度為37 ℃、5%CO2體積分?jǐn)?shù)、飽和濕度的條件下培養(yǎng)RL95-2 細(xì)胞。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)定期換液,待細(xì)胞接近長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底部時(shí),用0.25%的胰酶消化傳代。在正式實(shí)驗(yàn)開(kāi)始之前,需對(duì)細(xì)胞進(jìn)行同步化培養(yǎng)處理后再進(jìn)行分組及藥物處理。
1.2.2 MTT法檢測(cè)PAM對(duì)RL95-2細(xì)胞增殖變化的影響 取生長(zhǎng)旺盛的RL95-2 細(xì)胞,以1.0×105個(gè)/ml濃度接種于96 孔培養(yǎng)板。將細(xì)胞分為7 組:空白對(duì)照組(僅加DMSO)、不同濃度藥物組(分別加入溶解于DMSO中的7.5、15、30、60、120、240 mg/ml PAM),每組設(shè)置3 個(gè)平行復(fù)孔。分別在24 h、48 h 和72 h時(shí)測(cè)量各孔細(xì)胞的吸光度(OD)并記錄,計(jì)算藥物組細(xì)胞在不同生長(zhǎng)時(shí)間點(diǎn)的增殖率,細(xì)胞增殖率(%)=藥物組平均OD 值/對(duì)照組平均OD 值×100%。所得數(shù)據(jù)以時(shí)間點(diǎn)為橫坐標(biāo),以增殖率為縱坐標(biāo),繪制藥物組細(xì)胞增殖率隨時(shí)間的變化圖,并采用Bliss 法計(jì)算PAM 在3 個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)RL95-2 細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)。
1.2.3 Annexin V-FITC/PI 雙染檢測(cè) RL95-2 細(xì)胞凋亡水平 按1.2.2方法接種細(xì)胞后將細(xì)胞分為4組:空白對(duì)照組(僅加DMSO)、不同濃度藥物組(溶解于DMSO 中的15、30、60 mg/ml PAM),每組設(shè)置3 個(gè)平行復(fù)孔,加藥后常規(guī)培養(yǎng)48 h,參照Annexin V-FITC/PI 雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒相關(guān)操作,依次經(jīng)過(guò)離心收集細(xì)胞、重懸離心棄上清、染色避光孵育等步驟處理各組細(xì)胞,并及時(shí)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。根據(jù)象限圖統(tǒng)計(jì)細(xì)胞總凋亡率,一般將第二象限和第四象限的細(xì)胞占比之和定義為細(xì)胞的總凋亡率。
1.2.4 JC-1 染色法檢測(cè)RL95-2 細(xì)胞線粒體膜電位變化 按1.2.3方法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和分組。常規(guī)培養(yǎng)48 h 后參考線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-1 染色法)相關(guān)操作,依次經(jīng)過(guò)離心收集細(xì)胞、染色避光孵育、離心收集細(xì)胞、緩沖液重懸細(xì)胞等步驟處理各組細(xì)胞,并及時(shí)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。一般將第二象限B2細(xì)胞占比與第四象限B4細(xì)胞占比的比值看作線粒體膜電位的高低變化程度。
1.2.5 Western blot 檢測(cè)RL95-2 細(xì)胞線粒體Cyt C釋放及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 按1.2.3方法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和分組。48 h后分離各組細(xì)胞的線粒體蛋白和細(xì)胞質(zhì)蛋白,并對(duì)所提蛋白進(jìn)行濃度檢測(cè),然后依次經(jīng)過(guò)蛋白變性、蛋白上樣、SDS-PAGE 凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉和洗膜后,分別加入一抗Cyt C(1∶1 000)、COX Ⅳ(線粒體蛋白內(nèi)參,1∶1 500)、β-actin(細(xì)胞質(zhì)蛋白內(nèi)參,1∶1 000);而對(duì)于凋亡蛋白的檢測(cè)實(shí)驗(yàn),則按照全蛋白提取試劑盒分別提取各組RL95-2 細(xì)胞蛋白;僅抗體信息變化如下:一抗Bcl-2(1∶1 000)、Bax(1∶1 000);cleaved-Caspase3(1∶1 200);β-actin(1∶1 000),在4 ℃下孵育過(guò)夜;PBS洗膜后加入羊抗兔IgG 二抗(1∶5 000)室溫孵育0.5 h;PBS 再次洗膜后用ECL 化學(xué)放光進(jìn)行顯色觀察;凝膠成像系統(tǒng)分析各指標(biāo)灰度值。
1.2.6 分光光度法檢測(cè)RL95-2 細(xì)胞Caspase9 酶的活性 按1.2.3方法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和分組。常規(guī)培養(yǎng)48 h 后,參考Caspase9 活性檢測(cè)試劑盒相關(guān)操作,依次經(jīng)過(guò)離心收集細(xì)胞、裂解細(xì)胞收集上清、加工作液孵育、酶標(biāo)儀吸光度測(cè)定和標(biāo)準(zhǔn)曲線制作等步驟計(jì)算各組細(xì)胞Caspase9酶的活性。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理,計(jì)量資料均以表示,多組間數(shù)據(jù)比較采用One-Way ANOVA 分析,組間兩兩比較采用Tukey檢驗(yàn),P<0.05代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 PAM呈濃度和時(shí)間依賴性地抑制RL95-2細(xì)胞增殖 如圖1A 所示,同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖率隨PAM濃度的增加而降低,且同濃度下細(xì)胞增殖率隨時(shí)間的增加而降低,提示PAM 呈明顯的時(shí)間和濃度依賴性地抑制RL95-2 細(xì)胞增殖。如圖1B 所示,根據(jù)Bliss法計(jì)算得出PAM在24 h、48 h和72 h時(shí),RL95-2細(xì)胞的 IC50值分別為 142.12±5.72、69.67±4.99 和34.68±3.74,三者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=253.904,P=0.000);與 24 h 相比,48 h 和 72 h 的 IC50差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01);72 h 的IC50與48 h相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
圖1 PAM呈濃度和時(shí)間依賴性地抑制RL95-2細(xì)胞增殖Fig.1 PAM inhibited proliferation of RL95-2 cells in a concentration and time-dependent manner
2.2 PAM 促進(jìn) RL95-2 細(xì)胞凋亡 如圖 2 所示,與空白對(duì)照組相比,藥物組(15、30、60 mg/ml PAM)RL95-2 細(xì)胞凋亡率均顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。
圖2 PAM促進(jìn)RL95-2細(xì)胞凋亡Fig.2 PAM promoted apoptosis of RL95-2 cells
2.3 PAM 促進(jìn)RL95-2 細(xì)胞線粒體膜電位的降低如圖3 所示,與空白對(duì)照組相比,藥物組(15、30、60 mg/ml PAM)RL95-2 細(xì)胞線粒體膜電位均顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。
圖3 PAM促進(jìn)RL95-2細(xì)胞線粒體膜電位的降低Fig.3 PAM promoted decreased of mitochondrial membrane potential in RL95-2 cells
2.4 PAM 促進(jìn)RL95-2 細(xì)胞線粒體中 Cyt C 的釋放 如圖4 所示,所提取的線粒體蛋白中無(wú)細(xì)胞質(zhì)特異性蛋白β-actin 表達(dá),而所提取的細(xì)胞質(zhì)蛋白中無(wú)線粒體特異性蛋白COXⅣ表達(dá),表明所提取蛋白純度均較高,無(wú)相互交叉污染。與空白對(duì)照組相比,3 個(gè)藥物組(15、30、60 mg/ml PAM)RL95-2 細(xì)胞線粒體中Cyt C蛋白表達(dá)量均顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01),細(xì)胞質(zhì)中Cyt C 蛋白表達(dá)量顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。
圖4 PAM促進(jìn)RL95-2細(xì)胞線粒體中Cyt C的釋放Fig.4 PAM promoted release of Cyt C in RL95-2 cells in mitochondria
2.5 PAM 促進(jìn) RL95-2 細(xì)胞中 Caspase9 酶的活性如圖5 所示,與空白對(duì)照組相比,3 個(gè)藥物組(15、30、60 mg/ml PAM)RL95-2 細(xì)胞中 Caspase9 酶的活性均顯著升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。
圖5 PAM促進(jìn)RL95-2細(xì)胞中Caspase9酶的活性Fig.5 PAM promoted activity of Caspase9 enzyme in RL95-2 cells
2.6 PAM 促進(jìn)線粒體凋亡信號(hào)通路的激活 如圖 6 所示,與空白對(duì)照組相比,3 個(gè)藥物組(15、30、60 mg/ml PAM)RL95-2 細(xì)胞中抑凋亡蛋白 Bcl-2 的相對(duì)表達(dá)量顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01);而促凋亡蛋白 Bax 和 cleaved-Caspase3 的相對(duì)表達(dá)量顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。
圖6 PAM促進(jìn)線粒體凋亡信號(hào)通路的激活Fig.6 PAM promoted activation of mitochondrial apoptosis signaling pathway
EC是臨床上較為常見(jiàn)的女性惡性腫瘤之一,當(dāng)前的治療方法主要以手術(shù)輔助放化療為主,預(yù)后較差是其臨床治愈率較低的主要原因。近些年,關(guān)于PAM 對(duì)于癌癥的藥理作用研究已有相關(guān)報(bào)道,這為PAM 臨床治療癌癥提供了很好的基礎(chǔ)理論。例如,體外研究顯示PAM 能通過(guò)線粒體凋亡信號(hào)通路促進(jìn)人食管癌細(xì)胞Eca109 凋亡,促進(jìn)細(xì)胞阻滯在S期[6]。體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)表明,PAM 能通過(guò)阻滯 S 期肝癌細(xì)胞H22,進(jìn)而抑制受體小鼠腫瘤的生長(zhǎng),發(fā)揮其抗腫瘤活性[8]。對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6 細(xì)胞進(jìn)行藥理學(xué)相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),PAM 可顯著抑制上述細(xì)胞的增殖,促進(jìn)其凋亡,其機(jī)制可能與線粒體凋亡信號(hào)通路密切相關(guān)[9]。本研究發(fā)現(xiàn),PAM 作用 EC 細(xì)胞RL95-2的 48 h IC50為69.67 mg/ml,且PAM 隨時(shí)間和劑量依賴性地抑制RL95-2 細(xì)胞增殖。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)顯示,60 mg/ml的PAM 可顯著促進(jìn)RL95-2細(xì)胞的凋亡、線粒體膜電位的降低及Cyt C的釋放;同時(shí),細(xì)胞內(nèi)Caspase9 酶的活性顯著增加,線粒體凋亡信號(hào)通路被激活。以上結(jié)果表明,PAM 可有效作用于EC細(xì)胞RL95-2,其發(fā)揮的凋亡促進(jìn)作用可能與線粒體凋亡通路有關(guān)。
本研究證明了PAM 誘導(dǎo)EC 細(xì)胞凋亡可能與線粒體凋亡信號(hào)通路的激活有關(guān)。線粒體通路和死亡受體通路是當(dāng)前公認(rèn)的兩種細(xì)胞內(nèi)凋亡信號(hào)通路,Bcl-2 蛋白家族成員參與線粒體通路的調(diào)控。Bcl-2 蛋白家族分為兩大類:以 Bcl-2、Bcl-xl 為代表的抗凋亡蛋白和以Bax、Bad 為代表的促凋亡蛋白[10]。Bcl-2家族是最早發(fā)現(xiàn)的一組重要蛋白,其可改變線粒體外膜的通透性,從而調(diào)節(jié)線粒體凋亡蛋白的釋放量。Bcl-2 是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞凋亡抑制蛋白,其不依賴細(xì)胞分裂來(lái)阻止程序性細(xì)胞凋亡;Bax 從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位至線粒體誘導(dǎo)Cyt C 的釋放,進(jìn)而引起下游Caspase 家族的凋亡執(zhí)行;而抗凋亡蛋白Bcl-2 過(guò)表達(dá)可抑制促凋亡蛋白Bax 轉(zhuǎn)位至線粒體,導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖和異常存活[11]。由此可見(jiàn),細(xì)胞內(nèi)Bcl-2 與Bax 的動(dòng)態(tài)平衡是控制細(xì)胞生存或凋亡的關(guān)鍵。本研究結(jié)果顯示,藥物組較對(duì)照組細(xì)胞Bcl-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著減少,而Bax 及下游凋亡執(zhí)行者cleaved-Caspase3 的蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著增多,Bcl-2 與Bax 的動(dòng)態(tài)平衡被打破,癌細(xì)胞凋亡進(jìn)程加速,提示PAM 的作用機(jī)制與激活線粒體凋亡信號(hào)通路有關(guān)。
此外,Cyt C 從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中激活Caspase常常導(dǎo)致線粒體通路的激活。在眾多誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的蛋白中,Caspase 是執(zhí)行凋亡刺激、誘導(dǎo)細(xì)胞死亡所必需的蛋白。本研究同樣發(fā)現(xiàn),PAM 處理組的細(xì)胞線粒體與細(xì)胞質(zhì)中的Cyt C 蛋白表達(dá)呈相反趨勢(shì),且細(xì)胞中Caspase9 的活性及cleaved-Caspase3的表達(dá)量顯著增加。提示線粒體凋亡途徑的發(fā)生效應(yīng)通常導(dǎo)致Cyt C由線粒體釋放至細(xì)胞質(zhì)中,伴隨下游Caspase 家族部分成員的活化,PAM 確實(shí)激活了線粒體凋亡信號(hào)通路。
此外,PAM 還可通過(guò)其他途徑發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤作用。例如,在以小鼠淋巴細(xì)胞為研究對(duì)象時(shí)發(fā)現(xiàn),PAM 可活化T 淋巴細(xì)胞并同時(shí)增強(qiáng)Th1和Th2 型免疫反應(yīng),其機(jī)制可能與其對(duì)NF-κB 信號(hào)通路的抑制作用有關(guān)[12]。在進(jìn)行小鼠結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞原位移植瘤生長(zhǎng)相關(guān)研究時(shí)發(fā)現(xiàn),PAM 主要通過(guò)增加MHCⅡ和IL-12 在樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中的表達(dá)水平以及增加CD4+及CD8+細(xì)胞分泌IFN-γ的能力來(lái)抑制腫瘤生長(zhǎng)[13]。在研究肺癌模型大鼠的免疫功能時(shí)發(fā)現(xiàn),PAM 可有效降低模型組大鼠肺指數(shù),提升其脾臟和胸腺指數(shù)以及外周血中白細(xì)胞和溶菌酶含量,其作用機(jī)制可能與其能夠增強(qiáng)肺癌模型大鼠機(jī)體免疫功能,抑制癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡有關(guān)[14]。在體外研究肝癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)習(xí)性時(shí)發(fā)現(xiàn),PAM 對(duì)肝癌細(xì)胞的體外增殖和侵襲能力具有抑制作用,其可能通過(guò)影響Wnt/β-catenin 信號(hào)通路發(fā)揮作用[15]。
本研究發(fā)現(xiàn),白術(shù)多糖可通過(guò)激活線粒體凋亡信號(hào)通路導(dǎo)致癌細(xì)胞Bcl-2 與Bax 的失衡,線粒體中Cyt C 向細(xì)胞質(zhì)釋放,下游Caspase 家族中Caspase9酶活性及cleaved-Caspase3 活性增加,進(jìn)而促進(jìn)EC細(xì)胞RL95-2 的凋亡發(fā)生。本研究初步探究了白術(shù)多糖促EC 細(xì)胞RL95-2 的凋亡機(jī)制,為白術(shù)多糖臨床治療人EC奠定了理論基礎(chǔ)。