基于Caspase-1 細胞焦亡信號通路探討梔子苷對脂多糖誘導RAW264.7細胞炎癥的抑制作用①

游麗嬌 楊小芳 耿 歡 孟佳磊 馬宇慧 雷 鳴 王韞瑾

（上海中醫(yī)藥大學附屬第七人民醫(yī)院重癥醫(yī)學科，上海 200137）

梔子始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，性寒，味苦，歸心、肺、三焦經(jīng)，具有瀉火除煩、清熱利尿、涼血解毒等功效，臨床應用廣泛，主要有效成分包括梔子苷、藏紅花素、綠原酸等［1］。其中最主要活性成分梔子苷具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗內(nèi)毒素、保肝利膽、抗氧化、腦缺血保護、降血壓、抗糖尿病等多種藥理作用［2］。細菌感染導致的全身炎癥反應綜合征（sys?temic inflammatory response syndrome，SIRS）、膿毒癥、感染性休克等是臨床危急重癥，抗感染、減輕炎癥反應是救治的基礎，中藥抗菌、抗炎作用因抗生素的毒副作用及耐藥性受到重視，常用中藥制劑，如清開靈、熱毒寧注射液和安宮牛黃丸等，均含有梔子，其在感染性疾病方面的應用受到廣泛重視。研究對梔子及梔子苷的抗炎作用與機制進行了廣泛研究，包括通過調節(jié)炎癥細胞因子水平發(fā)揮抗感染及免疫調節(jié)作用，證實其可通過TLR4/NF-κB 信號途徑和MAPK/ERK 信號通路發(fā)揮炎癥調節(jié)作用［3-4］。

胱天蛋白酶1（Caspase-1）除參與炎癥調控外，其通過炎癥介導的細胞焦亡途徑是經(jīng)典細胞焦亡途徑，細菌、病毒侵襲機體時，被天然免疫受體Caspase-1識別，Caspase-1剪切Gasdermin D（GSDMD）蛋白，釋放打孔膜活性，執(zhí)行細胞焦亡，引發(fā)炎癥反應，誘導炎癥因子釋放，產(chǎn)生炎癥性損傷［5-6］。脂多糖（LPS）是一種常見的內(nèi)毒素，是革蘭氏陰性菌細胞壁外膜結構的重要組成部分，革蘭氏陰性桿菌是引起SIRS、膿毒癥、感染性休克的常見病因［7］。機體受細菌病毒侵襲時往往最先驅動免疫保護，即作為先天免疫細胞的巨噬細胞［8］。在調控炎癥反應方面，其中心細胞是激活的巨噬細胞，由巨噬細胞產(chǎn)生并釋放多種炎癥因子。以LPS 介導的巨噬細胞RAW264.7 作為研究靶點，通過中藥單體的抗炎機制可進一步了解炎癥反應的作用機制并找到有效防治策略［9］。本研究以 LPS 誘導的 RAW264.7 細胞為主要炎癥模型，觀察梔子苷對LPS 誘導的RAW264.7 細胞的影響，同時檢測Caspase-1 細胞焦亡信號通路中關鍵蛋白及其下游炎癥因子表達和分泌情況，進一步闡明梔子苷抗炎作用的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料 RAW264.7 細胞株（上海中科院細胞庫）；梔子苷（成都普菲德，批號：19101705）；地塞米松（羅恩，批號：R010148）；LPS 粉末（Sigma 公司，O111：B4）；DMEM 培養(yǎng)基（批號：MA0212）、胎牛血清（FBS，批號：PWL001）、CCK-8 試劑盒（批號：MAO218）、DAPI（批號：MB3204）和蛋白酶抑制劑PMSF（批號：MA0001）均購自大連美侖生物；LDH試劑盒（上海翊圣，批號：40209）；PI 試劑盒（BD 公司，批 號 ：556547）；小 鼠 IL-1β、IL-18、TNF-α、IL-6 ELISA 試劑盒（達科為，批號：1210122、E04609m、217202、1210602）；BCA 蛋白定量試劑盒（Thermo，批號：23227）；兔抗NLRP3 單克隆抗體、鼠抗IL-1β單克隆抗體、兔抗IL-18 單克隆抗體、兔抗β-actin（CST，批號：15101S、12703S、57058S、8457S）；兔抗GSDMD 單克隆抗體、兔抗Caspase-1 單克隆抗體（Abcam，批號：ab219800、ab179515）；ECL 化學發(fā)光試劑盒（上海雅酶，批號：014711000）；儀器顯微鏡（德國徠卡）；CO2培養(yǎng)箱（美國賽默飛）；超凈工作臺（美國Thermo Scientific 公司）；純水儀（美國Milli?pore 公司）；多功能酶標儀（美國Molecular devices公司，MQ05267）；電泳儀和轉膜儀（美國Bio-Rad公司）；Amersham Imager 600 蛋白成像儀（美國GE公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 采用含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)RAW264.7細胞。

1.2.2 CCK-8 檢測梔子苷對RAW264.7 細胞存活率的影響 細胞以2.5×104個/ml 鋪于96 孔板，每組設3 個復孔，加入0、2.5、5、10、20、40、80、160 μmol/L梔子苷處理24 h，采用CCK-8 試劑盒檢測細胞存活率（%）=（檢測孔OD 值?本底OD 值）/（對照組OD 值?空白孔OD值）×100%。選擇不影響細胞存活率的濃度為最大濃度，并以此濃度按倍數(shù)稀釋中、低濃度。

1.2.3 乳酸脫氫酶（LDH）釋放檢測 將細胞按5×103個/孔鋪于 96 孔板，200 μl/孔加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，倒掉完全培養(yǎng)基，加入新鮮的無血清培養(yǎng)基，過夜后分為對照組、模型組、梔子苷組和地塞米松組。對照組加入基礎培養(yǎng)基（無血清），模型組給予含10 μg/ml LPS 的基礎培養(yǎng)基，梔子苷低、中、高濃度組和地塞米松組（5 μmol/L）于造模后1 h 給藥（200 μl/孔），處理24 h 后按試劑盒說明檢測，每組設3個復孔。

1.2.4 細胞上清中炎癥因子分泌水平檢測 按1.2.3 進行細胞分組處理，加藥24 h 后取細胞上清，ELISA 試劑盒分別檢測細胞上清中IL-1β、IL-18、TNF-α和IL-6分泌，每組設3個復孔。

1.2.5 PI 染色觀察細胞焦亡 參照文獻［10］，細胞按1.0×105個/孔鋪于24 孔板（1 ml/孔），分組及處理方式同1.2.3，細胞加藥處理24 h 后（避光操作），PBS 洗 2 遍，1 ml/孔加入 PBS（含 1∶1 000 DAPI 和1∶20 PI）室溫避光孵育30 min，倒置熒光顯微鏡下觀察，拍照記錄。

1.2.6 Western blot 檢測Caspase-1 細胞焦亡通路蛋白表達 細胞以 4.0×105個/孔接種于 6 孔板（2 ml/孔），按1.2.3 分組，加藥處理24 h 后，4 ℃下PBS洗2遍，加入RIPA（100μl/孔）和PMSF（1μl/孔）冰上裂解30 min 后收集，4 ℃離心15 min 后取上清，BCA 蛋白定量，95 ℃ 5 min 蛋白變性、SDS-PAGE 電泳、轉膜、封閉1 h 后分別加入一抗稀釋液稀釋后的抗體4 ℃孵育過夜，洗膜后加二抗室溫孵育，顯影，Image J軟件處理蛋白灰度值，得出相對蛋白表達。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用GraphPad Prism 8.0 軟件分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以表示，單因素方差分析比較組間差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 細胞存活率 CCK-8 顯示，梔子苷160μmol/L組細胞存活率低于對照組（P<0.05），故選擇80 μmol/L 作為梔子苷高濃度組，按倍數(shù)稀釋計算中濃度為40μmol/L，低濃度為20μmol/L（圖1）。

圖1 梔子苷對RAW264.7細胞存活率的影響Fig.1 Effect of Geniposide on survival rate of RAW264.7 cells

2.2 梔子苷對LPS 誘導的RAW264.7 細胞LDH 釋放的影響 與正常對照組相比，LPS 組細胞LDH 釋放量顯著增加（P<0.01）；梔子苷各濃度組和地塞米松組可有效降低細胞上清中LDH釋放（P<0.01，圖2）。

圖2 梔子苷對LPS 誘導的RAW264.7 細胞LDH 釋放的影響Fig.2 Effect of Geniposide on LDH release in LPS induced RAW264.7 cells

2.3 梔子苷對LPS 誘導的RAW264.7 細胞上清中IL-1β、IL-18、TNF-α 和 IL-6 分泌的影響 與對照組相比，LPS 組細胞上清中 IL-1β、IL-18、TNF-α 和IL-6水平上調（P<0.01），梔子苷各濃度組和地塞米松組IL-1β、IL-18、TNF-α 和IL-6 水平均低于模型組（P<0.05，P<0.01，表1）。

表1 梔子苷對LPS誘導的RAW264.7細胞上清中炎癥因子的影響（，n=3，pg/ml）Tab.1 Effects of Geniposide on inflammatory factors in supernatant of RAW264.7 cells induced by LPS（，n=3，pg/ml）

表1 梔子苷對LPS誘導的RAW264.7細胞上清中炎癥因子的影響（，n=3，pg/ml）Tab.1 Effects of Geniposide on inflammatory factors in supernatant of RAW264.7 cells induced by LPS（，n=3，pg/ml）

Note：Compared with control group，1）P<0.01；compared with LPS group，2）P<0.05，3）P<0.01.

IL-6 39.53±14.34 577.01±24.691）413.06±48.522）258.33±45.392）99.54±32.943）162.70±31.103）Groups Control LPS Gen 20μmol/L Gen 40μmol/L Gen 80μmol/L Dex 5μmol/L IL-1β 26.00±3.92 80.89±0.951）35.43±2.983）34.16±0.383）32.97±3.283）44.93±3.083）IL-18 32.55±2.06 145.19±5.891）77.51±7.013）75.83±9.783）61.96±5.903）72.27±4.023）TNF-α 55.84±0.51 361.05±13.441）171.68±2.442）102.22±0.363）74.87±0.963）122.15±3.183）

2.4 PI 染色檢測梔子苷對LPS 誘導的RAW264.7細胞的影響 與對照組相比，LPS 組被PI 染色的細胞核明顯增多，梔子苷各濃度組和地塞米松組中PI染色數(shù)顯著減少（圖3）。

圖3 PI 染色檢測梔子苷對LPS 誘導的RAW264.7 細胞的影響Fig.3 PI staining to detect effect of Geniposide on RAW264.7 cells induced by LPS

2.5 梔子苷對LPS 誘導的RAW264.7 細胞經(jīng)典細胞焦亡通路中蛋白表達的影響 與對照組相比，LPS組NLRP3、Caspase-1、GSDMD、GSDMD-NT、IL-1β和IL-18 表達顯著增加（P<0.01）；與LPS 組相比，梔子苷組和地塞米松組NLRP3、Caspase-1、GSDMD、GSDMD-NT、IL-1β 和IL-18 表達顯著降低（P<0.01，圖4、表2）。

表2 梔子苷對LPS誘導的RAW264.7細胞NLRP3、Caspase-1、GSDMD、GSDMD-NT、IL-1β和IL-18表達的影響（，n=3）Tab.2 Effect of Geniposide on expressions of NLRP3，Caspase-1，GSDMD，GSDMD-NT，IL-1β and IL-18 in RAW264.7 cells induced by LPS（，n=3）

表2 梔子苷對LPS誘導的RAW264.7細胞NLRP3、Caspase-1、GSDMD、GSDMD-NT、IL-1β和IL-18表達的影響（，n=3）Tab.2 Effect of Geniposide on expressions of NLRP3，Caspase-1，GSDMD，GSDMD-NT，IL-1β and IL-18 in RAW264.7 cells induced by LPS（，n=3）

Note：Compared with control group，1）P<0.01；compared with LPS group，2）P<0.01.

IL-18 0.420±0.105 0.984±0.0541）0.882±0.110 0.749±0.0282）0.335±0.0732）0.325±0.0862）Groups Control LPS Gen 20μmol/L Gen 40μmol/L Gen 80μmol/L Dex 5μmol/L NLRP3 0.091±0.035 1.250±0.0641）0.364±0.0732）0.145±0.0332）0.106±0.0172）0.101±0.0312）Caspase-1 0.293±0.002 1.334±0.0651）1.067±0.041 0.450±0.0102）0.298±0.0312）0.302±0.0212）Caspase-1 P10 0.593±0.096 1.301±0.0621）1.192±0.032 1.051±0.030 0.845±0.0182）0.302±0.0212）GSDMD 0.228±0.038 1.230±0.0901）0.678±0.1152）0.603±0.0172）0.334±0.0512）0.264±0.0452）GSDMD-NT 0.127±0.011 1.142±0.0911）0.461±0.2332）0.387±0.0702）0.198±0.0582）0.146±0.0872）IL-1β 0.726±0.060 1.080±0.0201）0.826±0.0362）0.776±0.0432）0.746±0.0162）0.738±0.0982）

圖4 梔子苷對 LPS 誘導的 RAW264.7 細胞 NLRP3、Caspase-1、GSDMD、GSDMD-NT、IL-1β 和 IL-18表達的影響Fig.4 Effect of Geniposide on expressions of NLRP3，Caspase-1，GSDMD，GSDMD-NT，IL-1β and IL-18 in RAW264.7 cells induced by LPS

3 討論

膿毒癥是感染引起宿主反應失調、危及生命的癥候群，其本質是感染引起的SIRS，炎癥反應具有“細胞因子風暴”式級聯(lián)反應特征，可導致循環(huán)、細胞和代謝異常，病死率顯著提高，即感染性休克；早期治療除抗感染外，發(fā)現(xiàn)及阻斷炎癥反應也是重要的救治措施，使體內(nèi)炎癥反應恢復平穩(wěn)，其治療方式包括激素、抗生素及中藥制劑，中藥不影響抗菌藥物對細菌的消除作用，且副作用少，是目前臨床關注熱點［11-13］。

中醫(yī)將膿毒癥等歸為“外感熱病”“脫證”“神昏”等范疇，由于邪之所湊，其氣必虛，外邪入侵，入里化熱，毒邪內(nèi)蘊，絡脈氣血運行不暢，導致毒熱、瘀血、痰濁內(nèi)阻，瘀阻脈絡，進而令各臟器損傷，因此臨床多以清熱解毒、通腑泄熱、活血涼血及扶正固本為主［11，14］。指南推薦用于膿毒癥毒熱證的中成藥，如熱毒寧注射液、清開靈注射液、醒腦靜注射液和安宮牛黃丸等，均為含梔子成分產(chǎn)品，梔子作為清熱解毒、涼血瀉火中藥受到臨床廣泛認可［9］。

梔子苷是梔子主要活性成分環(huán)烯醚萜類化合物的代表，其含量最高，可達3%~5%［1］。藥理研究證實梔子苷可能通過與Lipid A 結合中和LPS 活性，抑制LPS介導的細胞活化，減少細胞因子釋放，進而保護膿毒癥模型小鼠［15］。梔子苷通過糖皮質激素受體對LPS 誘導的膿毒癥小鼠具有保護作用，能夠改善膿毒癥小鼠皮質醇異常增高現(xiàn)象，調節(jié)糖皮質激素下游基因表達［16］。梔子苷可降低促炎因子，IL-1β、IL-4、IL-5、TNF-α、IL-8、細胞黏附分子（VCAM-1）等表達，提高IL-10等抗炎因子水平，并能激活T細胞，促進T細胞增殖，降低細胞前炎癥因子釋放，發(fā)揮免疫-炎癥調節(jié)效應［3-4］。

當內(nèi)毒素侵入人體，識別病原相關分子受體和危險相關分子受體并通過銜接蛋白方式與胞質蛋白復合體-NLRP3 炎癥小體結合，NLRP3 炎癥小體是激活 Caspase-1 的胞質傳感器［17］。Caspase-1 一旦被激活，會將Pro-IL-1β和Pro-IL-18分解為具有生物活性的成熟形態(tài)（IL-1β 和 IL-18），同時被激活的Caspase-1 切割為 GSDMD，剪切出 GSDMD 的氮端（GSDMD-NT）聚集至細胞膜，形成細胞膜孔隙，導致炎癥因子由此空隙釋放和最終死亡，是焦亡的經(jīng)典途徑［18-19］。焦亡的過度激活可能是導致膿毒癥、感染性休克重要機制之一，LPS 是激活Caspase-1 的重要模式分子，LPS 可激活細胞質Lipid A，從而激活Caspase-1，使其表達增加，從而引發(fā)焦亡［20］。因而阻斷Caspase-1 細胞焦亡信號通路可阻斷炎癥反應及焦亡，從而減輕炎癥反應導致的損傷，有利于膿毒癥等控制。

LPS 刺激 RAW264.7 細胞后，通過 LDH 釋放和PI 染色觀察細胞死亡情況，結果顯示模型組細胞LDH 釋放量和PI攝取明顯高于正常對照組，而梔子苷各組均顯著減少了LDH 釋放和PI 攝取，且在LPS誘導下，NLRP3炎癥小體和Caspase-1細胞焦亡信號通路上的關鍵蛋白及其下游蛋白表達明顯升高，細胞上清中炎癥因子IL-1β、IL-18、TNF-α、IL-6 明顯上調，表明LPS 激活了Caspase-1 細胞焦亡的信號通路。梔子苷各組抑制了NLRP3炎癥小體和Caspase-1細胞焦亡信號通路上的關鍵蛋白及其下游蛋白表達，且減少了炎癥因子 IL-1β、IL-18、TNF-α、IL-6分泌，說明梔子苷對Caspase-1細胞焦亡信號通路具有抑制作用。

綜上所述，梔子苷可能通過下調NLRP3 炎癥小體表達，從而抑制Caspase-1 細胞焦亡信號通路激活，進一步減少炎癥因子釋放和細胞死亡，故梔子苷為臨床炎癥性疾病治療提供了新思路，值得進一步研究。