應(yīng)用于結(jié)核性胸膜炎分子生物學(xué)檢測的胸腔積液核酸提取方法初步比較分析

杜博平，李自慧，潘麗萍，孫 琦，呂翎娜，朱傳智，邢愛英，賈紅彥，張宗德

結(jié)核病(Tuberculosis，TB)在新型冠狀病毒大流行之前是單一傳染源導(dǎo)致死亡的首要原因[1]。結(jié)核性胸膜炎(tuberculous pleurisy)是一種常見的結(jié)核病類型，其發(fā)病率在TB非流行地區(qū)為3%～5%，在艾滋病病毒感染比例高的TB流行地區(qū)可達(dá)30%[2]。結(jié)核性胸膜炎可引起胸膜增厚、結(jié)核性膿胸、乳糜胸、氣胸等并發(fā)癥，導(dǎo)致肺功能損害、慢性胸痛或呼吸困難，對患者造成極大傷害[3-4]。

早期診斷和及時治療對于減輕結(jié)核性胸膜炎并發(fā)癥和改善預(yù)后至關(guān)重要，但其診斷目前仍十分困難。結(jié)核性胸膜炎的確診方法包括：胸腔積液結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，M.tb)病原學(xué)陽性(包括涂片、培養(yǎng)或分子生物學(xué)陽性)，或胸膜病理符合TB組織病理改變[5]。但胸膜穿刺活檢創(chuàng)傷性較大，不適宜作為常規(guī)診斷方法，涂片和培養(yǎng)也因胸腔積液中M.tb數(shù)量少而檢出率非常低(分別<10%和<30%)[6-8]。胸腔積液M.tb分子生物學(xué)檢測可適當(dāng)提高結(jié)核性胸膜炎的確診率。例如，世界衛(wèi)生組織推薦的Xpert MTB/RIF(Xpert)和Xpert Ultra用于結(jié)核性胸膜炎診斷的敏感性分別為19%和44%[7]；胸腔積液游離核酸檢測診斷結(jié)核性胸膜炎的敏感性可達(dá)75%[9]。但不同的胸腔積液核酸提取方法對于M.tb核酸檢測的影響，如何富集胸腔積液中M.tb核酸以提高檢出率等，目前尚報道較少。

本研究采用6種方法提取胸腔積液樣本中的核酸，用高靈敏的微滴數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)檢測樣本中M.tb特異性核酸的數(shù)量，旨在找到有助于分子生物學(xué)檢測的胸腔積液核酸提取方法，為提高結(jié)核性胸膜炎的病原學(xué)診斷效率提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集18例就診于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院的結(jié)核性胸膜炎患者胸腔積液樣本。結(jié)核性胸膜炎診斷依據(jù)《肺結(jié)核診斷WS288-2017》，包括臨床診斷病例和確診病例。患者平均年齡55歲，年齡分布17～89歲，其中男性13例，女性5例。本課題已通過首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 胸腔積液核酸提取方法 取出凍存于-80 ℃的胸腔積液樣本，室溫解凍，每份胸腔積液按照圖1所示，分別采用6種方法提取核酸。

1.2.1 游離核酸提取(柱法) 將樣本室溫16 000 g離心10 min，吸取4 mL上清，采用循環(huán)核酸提取試劑盒(Qiagen，55114)提取核酸，采用QIAvac 24 Plus真空裝置(Qiagen，19413)輔助，按照說明書步驟進(jìn)行，最后用50 μL AVE液體洗脫。

1.2.2 離心沉渣核酸提取(物理破碎) 將上面離心后的沉渣用350 μL 1×TE緩沖液重懸，全部轉(zhuǎn)移至含0.1 mm硅珠的裂解管(MP，116911100)中，放于振蕩儀(MP，F(xiàn)astPrep-24)中振蕩破碎2次，每次參數(shù)設(shè)置為6.5 m/s×35 s。之后13 000 g離心10 min，吸取上清，采用細(xì)菌DNA提取試劑盒(Omega，D3350)繼續(xù)進(jìn)行核酸提取，略過溶菌酶裂解步驟，直接加入試劑盒中BTL液和蛋白酶K，后續(xù)按照說明書進(jìn)行，最后用50 μL洗脫液洗脫。

1.2.3 游離核酸提取(磁珠法) 將樣本室溫16 000 g離心10 min，吸取4 mL上清，采用磁珠法大體積游離核酸提取試劑盒(天根，DP710)提取核酸，按照4 mL上清、6 mL 裂解液、0.4 mL蛋白酶K、60 μL磁珠E和1 μL carrier RNA(1 μg/μL)比例渦旋混勻，其余按說明書進(jìn)行，最后用50 μL TBC洗脫液洗脫。

1.2.4 離心沉渣核酸提取(化學(xué)破碎) 將上面離心后的沉渣用1×TE緩沖液洗滌1次，然后用100 μL 1×TE緩沖液重懸，采用細(xì)菌DNA提取試劑盒(Omega，D3350)進(jìn)行核酸提取。樣本中加入20 μL溶菌酶，37 ℃金屬浴振蕩1 h，期間徹底混勻5次，后續(xù)按照說明書進(jìn)行，最后用50 μL洗脫液洗脫。

1.2.5 胸腔積液核酸直接提取(柱法) 直接吸取700 μL胸腔積液，按照DNA提取試劑盒(Qiagen，51106)說明書步驟提取DNA，按比例加大蛋白酶K、AL裂解液和無水乙醇體積，每個樣本上樣1個柱子，最后用50 μL AE液洗脫。

1.2.6 胸腔積液核酸直接提取(磁珠法) 直接吸取700 μL胸腔積液，按照磁珠法血液基因組DNA提取試劑盒(天根，DP329)說明書進(jìn)行提取，最后用50 μL TB液進(jìn)行洗脫。

1.3 微滴數(shù)字PCR分析M.tb特異的插入序列(insertion sequence，IS)IS6110及IS1081的引物序列、探針序列及探針修飾參照前期工作[10-11]，均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成和修飾。每20 μL反應(yīng)體系包括ddPCR supermix for probes(Bio-rad，1863010)10 μL，IS6110和IS1081正、反義引物各0.9 μmol/L，IS6110和IS1081探針各0.2 μmol/L，DNA樣本5.6 μL。每個樣本設(shè)置2個復(fù)孔。每次實驗均設(shè)置無模板對照和陽性對照。將配制好的反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至微滴發(fā)生卡(Bio-rad，1864008)樣本孔，油孔加入70 μL微滴發(fā)生油(Bio-rad，1863005)，蓋上膠墊，轉(zhuǎn)移至微滴發(fā)生器(Bio-rad，QX200)生成微滴。之后將生成的微滴轉(zhuǎn)移至96孔板，熱封后PCR擴增，擴增程序為95 ℃ 10 min，40個循環(huán)(94 ℃ 30 s，54 ℃ 40 s)，98 ℃ 10 min。之后將96孔板放于微滴讀取儀(Bio-rad，QX200)，使用FAM/HEX雙通道讀取熒光。用QuantaSoft軟件(1.7.4.0917版)分析每20 μL反應(yīng)體系中的靶標(biāo)基因拷貝數(shù)，拷貝數(shù)取復(fù)孔平均值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。非正態(tài)分布計量資料兩組間比較采用Wilcoxon 配對檢驗，一致性分析采用Spearman相關(guān)性檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。繪圖采用Graphpad Prism 5軟件。

2 結(jié) 果

2.1 胸腔積液離心上清游離核酸提取——柱法和磁珠法比較 采用柱法(1法)和磁珠法(3法)分別提取相同體積胸腔積液離心上清中的游離核酸。檢測結(jié)果顯示，兩種方法提取的核酸樣本中M.tbIS6110和IS1081數(shù)量無統(tǒng)計學(xué)差異[中位數(shù)(最小值，最大值)，IS6110，16.9(0.0，698.0)比49.5(0.0，1 216.0)拷貝/20 μL反應(yīng)體系，Z=-1.501，P=0.133；IS1081，7.1(0.0，224.0)比9.3(0.0，257.0)拷貝/20 μL反應(yīng)體系，Z=-1.476，P=0.140](圖2)。

2.2 胸腔積液離心沉渣核酸提取——物理破碎和化學(xué)破碎比較 物理法和化學(xué)法是破碎裂解M.tb以釋放DNA的兩種主要方法，本研究在提取胸腔積液離心沉渣核酸時，主要比較這兩種方法。結(jié)果表明，提取相同體積胸腔積液離心后的沉渣，采用物理破碎提取的核酸樣本中M.tbIS6110和IS1081數(shù)量顯著高于化學(xué)破碎[IS6110，9.7(0.0，639.0)比0.0(0.0，1.0)拷貝/20 μL反應(yīng)體系，Z=-3.408，P=0.001；IS1081，4.8(0.0，155.0)比0.0(0.0，1.0)拷貝/20 μL反應(yīng)體系，Z=-3.297，P=0.001]，后者提取的樣本中幾乎檢測不到靶標(biāo)核酸(圖3)。

2.3 胸腔積液原液直接核酸提取——柱法和磁珠法比較 分別采用柱法和磁珠法直接提取相同體積胸腔積液的核酸，結(jié)果顯示，兩種方法提取的樣本中檢測到的M.tbIS6110和IS1081數(shù)量無統(tǒng)計學(xué)差異[IS6110，2.5(0.0，25.0)比0.5(0.0，250.0)拷貝/20 μL反應(yīng)體系，Z=-0.408，P=0.683；IS1081，0.4(0.0，13.0)比0.0(0.0，59.0)拷貝/20 μL反應(yīng)體系，Z=-0.612，P=0.541](圖4)。

2.4 胸腔積液原液核酸直接提取、胸腔積液離心上清游離核酸提取和離心沉渣核酸提取3種方法的比較 根據(jù)以上結(jié)果，將分別代表胸腔積液離心上清游離核酸提取、胸腔積液離心沉渣核酸提取和胸腔積液原液直接核酸提取的1法、2法和5法比較。結(jié)果顯示，1法和2法提取核酸樣本中的靶標(biāo)數(shù)量無明顯差別[IS6110，16.9(0.0，698.0)比9.7(0.0，639.0)拷貝/20 μL反應(yīng)體系，Z=-1.633，P=0.102；IS1081，7.1(0.0，224.0)比4.8(0.0，155.0)拷貝/20 μL反應(yīng)體系，Z=-1.371，P=0.171]，1法提取核酸樣本中的靶標(biāo)數(shù)量顯著高于5法[IS6110，16.9(0.0，698.0)比2.5(0.0，25.0)拷貝/20 μL反應(yīng)體系，Z=-3.237，P=0.001；IS1081，7.1(0.0，224.0)比0.4(0.0，13.0)拷貝/20 μL反應(yīng)體系，Z=-2.667，P=0.008]，2法提取核酸樣本中的靶標(biāo)數(shù)量也顯著高于5法[IS6110，9.7(0.0，639.0)比2.5(0.0，25.0)拷貝/20 μL反應(yīng)體系，Z=-3.157，P=0.002；IS1081，4.8(0.0，155.0)比0.4(0.0，13.0)拷貝/20 μL反應(yīng)體系，Z=-2.250，P=0.024](圖5)。

3 討 論

結(jié)核性胸膜炎是一種少菌性結(jié)核病類型，病原學(xué)確診率非常低。近年來，隨著分子生物學(xué)檢測技術(shù)的進(jìn)步和推廣，胸腔積液M.tb特異性核酸檢測被用來提升結(jié)核性胸膜炎的病原學(xué)診斷效率。然而不同方法的檢測效率差別非常大[8,12-13]，原因除了檢測技術(shù)本身的差異，前期胸腔積液的處理方式和核酸提取方法也是影響檢測效率的重要因素之一。理論上胸腔積液中M.tb核酸包括菌體核酸和菌體外的游離核酸，尚不清楚哪種比例更高。本研究設(shè)計采用了胸腔積液離心后上清(游離核酸)、胸腔積液離心后沉渣(菌體核酸)和胸腔積液原液3種思路，每種又嘗試兩種提取方法，以便綜合比較了解不同核酸提取方法獲得的核酸樣本中M.tb特異性核酸數(shù)量差異。

研究表明，結(jié)核性胸膜炎患者胸腔積液中的M.tb核酸含量非常低，經(jīng)常檢測結(jié)果陰性。因此本研究采用了高靈敏的微滴數(shù)字PCR技術(shù)對靶標(biāo)核酸進(jìn)行絕對定量[14]。檢測靶標(biāo)選用M.tb特異的、基因組中通常含有多個拷貝的IS6110及IS1081序列以提高檢出率。結(jié)果顯示樣本中檢測到的IS6110和IS1081拷貝數(shù)具有正相關(guān)關(guān)系(相關(guān)系數(shù)r=0.92,P<0.0001)，兩者均可以用來定量評估M.tb核酸提取的效果。

核酸提取方法比較結(jié)果提示，胸腔積液離心上清游離核酸提取以及原液直接核酸提取時，采用柱法和磁珠法的效果相當(dāng)，因此這兩種樣本核酸提取時采用柱法和磁珠法均可。而對于含有M.tb菌體的離心沉渣樣本，本研究在用化學(xué)破碎法提取M.tbDNA過程中盡管增加了溶菌酶的作用濃度和時間，但仍不能高效裂解M.tb(靶標(biāo)檢測數(shù)量極低)。因此，在胸腔積液沉渣核酸提取時強烈推薦使用物理破碎法來獲取M.tbDNA。

胸腔積液離心上清游離核酸提取(柱法)、離心沉渣核酸提取(物理法)和胸腔積液原液直接核酸提取(柱法)3種方法相比較，前兩種方法優(yōu)于后者，原因除了提取方法本身的差異(如游離核酸提取柱相比于普通核酸提取柱對于小片段核酸的吸附力可能更強)，前兩種方法按試劑盒要求提取的起始胸腔積液體積(4 mL)遠(yuǎn)大于后一種方法(0.7 mL)也是原因之一。(檢測效果的靈敏度換算應(yīng)該把體積差異因素考慮進(jìn)去)

進(jìn)一步比較胸腔積液離心上清游離核酸提取(柱法)和離心沉渣核酸提取(物理法)獲得的核酸樣本中M.tb核酸，發(fā)現(xiàn)上清樣本IS6110拷貝數(shù)高于沉渣樣本的有11例(樣本#1、#3、#7、#11和#12等)，沉渣樣本IS6110拷貝數(shù)高于上清樣本的有6例(樣本#6、#10和#16等)。該結(jié)果提示，結(jié)核性胸腔積液中M.tb菌體核酸和游離核酸哪種占比更多不能一概而論，不同患者會有所不同。這也提示，能同時考慮富集菌體核酸和游離核酸的方法有可能會提高檢測效率。

以上僅是從提取的核酸樣本中檢測到的M.tb核酸數(shù)量進(jìn)行方法比較，在實際工作中，選擇哪種方法還需結(jié)合其他因素綜合考慮。例如盡管胸腔積液原液直接核酸提取(柱法)檢測到的拷貝數(shù)略低，但也有很多樣本采用靈敏的數(shù)字PCR方法可以檢測到靶標(biāo)，同時該方法具有所需樣本體積小(0.7 mL)、操作簡單、價格便宜、除了離心機不需額外配備特殊儀器等優(yōu)點。另外，目前游離核酸提取試劑盒相對較為昂貴，沉渣核酸提取(物理法)振蕩破碎需專用儀器和破碎珠，磁珠法需磁力架，磁珠法易于實現(xiàn)機器自動化等，這些都是需要考慮的因素。

總之，本研究初步表明大體積胸腔積液離心上清游離核酸提取和離心沉渣核酸提取(物理破碎)是較好的適于結(jié)核性胸膜炎分子生物學(xué)檢測的核酸制備方法。由于分析樣本有限，下一步將進(jìn)一步擴大樣本評估這兩種方法，并深入分析其聯(lián)合數(shù)字PCR檢測對結(jié)核性胸膜炎的具體診斷價值。

利益沖突：無

引用本文格式：應(yīng)用于結(jié)核性胸膜炎分子生物學(xué)檢測的胸腔積液核酸提取方法初步比較分析[J]. 中國人獸共患病學(xué)報，2022，38(8)：678-684. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.108