副溶血弧菌耐熱直接溶血素DAS-ELISA檢測方法的建立

白雪欣，胡宸藝，金志穎，萬 偉，李 月，王 菁，李巖偉，高 姍，王景林

副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus，Vp)是一種革蘭陰性嗜鹽細(xì)菌，主要分布在河口沿岸和海水環(huán)境中[1]。1950年在日本大阪，Vp作為致病菌被首次分離，此后世界多地都有病例報道。我國第一次分離出該菌株略晚于日本，是于1958年在上海的一起因Vp感染而引發(fā)的食物中毒事件中分離得到的[2]。Vp是一種常見的人獸共患病致病菌，可導(dǎo)致貝類、魚類、蝦類等水生動物發(fā)病，多流行于夏季[3]。其中，Vp引起的紅體病普遍流行于我國蝦類養(yǎng)殖地區(qū)，如遼寧、海南等地[4]。該病致病性強(qiáng)，遼寧省盤錦市有報道水生動物死亡率高達(dá)80%以上，給當(dāng)?shù)貪O民帶來極大損失[5]。此外，也有報道Vp感染網(wǎng)箱養(yǎng)殖的大黃魚以及養(yǎng)殖的蟹、貝類，對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)危害極大[6-7]。更為嚴(yán)重的是，被Vp感染的水生動物會作為主要傳播載體感染人類，臨床有腹痛腹瀉、嘔吐發(fā)熱等典型腸胃炎癥狀，感染嚴(yán)重者可能引起敗血癥，甚至死亡，嚴(yán)重危害人類身體健康[8]。

目前，我國針對Vp檢測的主要方法仍然是國標(biāo)方法，包括分離培養(yǎng)、生化鑒定等，該法操作復(fù)雜，整個檢測周期長達(dá)6～7 d，且靈敏度有限[9]。而常用于Vp檢測的PCR、LAMP等分子生物學(xué)方法[10]通過選取Vp的特異性靶標(biāo)對其完成鑒定，此類方法靈敏度高、特異性強(qiáng)，但是只能檢測相應(yīng)的基因序列。Vp作為一種條件致病菌，并非所有菌株均可致病，所以即便檢測靶標(biāo)選取的是毒力基因序列，也無法判斷其確有產(chǎn)毒引發(fā)疾病，因此只進(jìn)行分子生物學(xué)檢測易出現(xiàn)假陽性，在致病性副溶血弧菌的檢測方面具有局限性。除此之外，該方法對實驗操作環(huán)境要求較高，需要專業(yè)的檢測人員和較為昂貴的檢測儀器，不利于在鄉(xiāng)鎮(zhèn)診所、基層醫(yī)院等收治患者的一線中推廣應(yīng)用。

Vp產(chǎn)生的多種溶血毒素是主要的致病因子，包括耐熱直接溶血素(thermostable direct hemolysin，TDH)、耐熱相關(guān)溶血素(TDH related hemolysin，TRH)以及不耐熱直接溶血素(thermolabile hemolysin，TLH)[11]。現(xiàn)有研究證明，TDH在Vp致病性方面的作用強(qiáng)于TRH，而TLH的致病機(jī)制尚不清楚[12]。TDH被189個氨基酸編碼，蛋白分子量大小在21 kDa左右，其中前24個氨基酸為信號肽，后165個氨基酸為功能區(qū)[13]，等電點(PI)在4～5之間[14]。研究發(fā)現(xiàn)TDH具有強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性、肝臟毒性、腸毒性以及溶血活性等[15]，被認(rèn)為是Vp最主要的毒力因子。產(chǎn)生TDH毒素的菌株可在Wagatsuma瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)生一種β溶血現(xiàn)象，被稱為神奈川現(xiàn)象(Kanagawa phenomenon，KP)[16]。流行病學(xué)研究表明，臨床分離株95%以上為KP陽性株，99%的環(huán)境分離株為KP陰性株，因此，KP現(xiàn)象被認(rèn)為是判定Vp是否具有致病力的依據(jù)。然而常規(guī)的KP實驗容易出現(xiàn)假陽性的結(jié)果，所以目前TDH檢測替代了KP實驗，成為判定副溶血弧菌致病力新的依據(jù)[13]。

綜上，TDH作為Vp最主要的毒力因子，針對其建立快速有效的檢測手段可以對Vp的致病株和非致病株進(jìn)行準(zhǔn)確區(qū)分。雙抗體夾心ELISA(DAS-ELISA)方法具有操作簡單、儀器設(shè)備要求低、靈敏度高、抗干擾能力強(qiáng)等優(yōu)點[17]。本研究通過對副溶血弧菌tdh基因進(jìn)行原核表達(dá)，對表達(dá)得到的重組蛋白進(jìn)行純化后進(jìn)行新西蘭白兔的免疫，制備多克隆抗體并用于DAS-ELISA方法的建立，為研制快速檢測副溶血性弧菌TDH的DAS-ELISA試劑盒打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 副溶血弧菌由本實驗室分離保存；產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素(CPA)、產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素(ETX)、創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞毒素(VVH)均由本實驗室制備和保存；載體pET-28a、DNA Marker(merck公司)；E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞(Takara公司)；E.coliRosetta感受態(tài)細(xì)胞，蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量Marker(全式金公司)；BamH I和EcoR I限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶(自賽默飛世爾科技(中國)有限公司)；蛋白胨、酵母提取物、哥倫比亞血平板(北京東方賽睿生物技術(shù)有限公司)；通用DNA純化回收試劑盒(DP214，天根生化科技有限公司)，普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(DP209，天根生化科技有限公司)和質(zhì)粒小提試劑盒(DP103, 天根生化科技有限公司)，Biotin Labeling Kit(E-LK-B002，Elabscience)。

1.2 方 法1.2.1 重組蛋白的制備

1.2.1.1 引物的設(shè)計與合成 從GenBank上獲得副溶血弧菌tdh基因的DNA序列(GenBank accession no.M10069)，應(yīng)用Premier5.0軟件設(shè)計了一對引物如下：R1：5′-GCGGATCCATGAAACACCAATATTTTGC-3′(含BamH I酶切位點)R2：5′-CGGAATTCTTATTTTTATTGTTGATGT-3′(含EcoR I酶切位點)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.1.2 目的基因的擴(kuò)增及重組表達(dá)載體的構(gòu)建 增菌培養(yǎng)副溶血弧菌，對其DNA進(jìn)行提取，以提取的細(xì)菌DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增tdh基因片段。反應(yīng)體系如下：2×KOD PCR Mix 2 μL，上下游引物各1 μL，細(xì)菌基因組DNA 1 μL，ddH2O 22 μL，95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共20個循環(huán)后；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共13個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，并用DNA回收試劑盒(DP214，天根生化科技有限公司)回收目的基因。將載體pET-28a與目的片段分別用限制性內(nèi)切酶(BamH I和EcoR I)進(jìn)行酶切，瓊脂糖凝膠電泳后回收酶切產(chǎn)物。用T4-DNA連接酶將載體pET-28a與目的片段連接，構(gòu)建表達(dá)載體pET-28a-TDH，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，用LB瓊脂平板(含kanamycin 1 μg/mL)培養(yǎng)篩選目的菌落。挑取單菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)，菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司測序鑒定。

1.2.1.3 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá) 對測序成功的重組菌用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，將構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-TDH轉(zhuǎn)化表達(dá)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Rosetta(DE3)中，吸取100 μL菌液接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基(含 kanamycin 100 μg/mL)中，37 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)8 h，將上述菌液轉(zhuǎn)移至500 mL LB液體培養(yǎng)基(含 kanamycin 100 μg/mL)中，37 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)至A600為0.4～0.6后，加入IPTG(終濃度為 2 mmol/L)誘導(dǎo)6 h。4 ℃、8 000 r/min離心20 min，棄上清，收集菌體。取少量菌體加入5 mL PBS重懸菌體，超聲破碎，分別收集上清液和沉淀，用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進(jìn)行分析。

1.2.1.4 包涵體蛋白的純化 將收集到的菌體凍存至-40 ℃，24 h后用50 mL 8 mol/L尿素重懸菌體，置于4 ℃過夜。將菌體置于冰上進(jìn)行超聲破碎，防止細(xì)胞裂解過程中產(chǎn)熱。超聲破碎后的產(chǎn)物于4 ℃、8 000 r/min、離心20 min，取上清并利用0.45 μm的微孔濾膜過濾，使用HISTRAP HP親和柱進(jìn)行蛋白純化，收集A280紫外有明顯吸收的峰樣品后進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，對純度較高的蛋白進(jìn)行透析復(fù)性。

1.2.2 抗體的制備 選取2.0 kg左右的新西蘭白兔，免疫之前耳靜脈取陰性血清。首次免疫取純化后的副溶血弧菌耐熱直接溶血素400 μg，補(bǔ)充生理鹽水到500 μL，再加入等體積弗氏佐劑充分混勻，背部皮下多點注射免疫新西蘭白兔。每隔14 d進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，共進(jìn)行3次。加強(qiáng)免疫的劑量為200 μg的副溶血弧菌耐熱直接溶血素，方法同上。免疫結(jié)束后進(jìn)行頸動脈取血，血液進(jìn)行兩次離心后取血清。采用Protein A親和層析進(jìn)行抗體純化，用ELISA方法檢測抗體效價，用Octet分子互作儀檢測抗體親和力。

1.2.3 DAS-ELISA方法的建立

1.2.3.1 生物素標(biāo)記多抗 使用Biotin Labeling Kit(E-LK-B002，Elabscience)對TDH兔多克隆抗體進(jìn)行標(biāo)記。

1.2.3.2 試驗最佳條件的篩選 采用棋盤法，檢測同一陽性樣本和陰性樣本，分別對包被抗體、捕獲抗體以及酶標(biāo)抗體進(jìn)行梯度稀釋，優(yōu)化捕獲抗體和檢測抗體的稀釋濃度；確定酶標(biāo)二抗的最優(yōu)稀釋倍數(shù)，確定封閉液的種類和最佳濃度；選擇P/N值最大且陽性樣本值接近1.0，陰性樣本值接近0.1為最佳條件。

1.2.3.3 靈敏度試驗 采用最佳反應(yīng)條件，按照DAS-ELISA常規(guī)操作，檢測梯度稀釋的TDH并進(jìn)行線性回歸分析，以P/N≥2.1作為陽性判定標(biāo)準(zhǔn)，確定DAS-ELISA對TDH的最低檢測限。

1.2.3.4 特異性試驗 選取同樣在臨床中常見的引起人畜共患疾病且致病機(jī)制與TDH相似的毒素作為特異性檢測的對照毒素進(jìn)行測定，包括創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞毒素(Vibriovulnificushemolysin，VVH)、產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素(Clostridiumperfringensα toxin，CPA)以及產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素(epsilon toxin，ETX)，以檢測本方法的特異性。

1.2.3.5 模擬樣本試驗 以無菌操作稱取25 g海鮮樣本(扇貝、花蛤、魁蚶)，分別加入225 mL的3%氯化鈉堿性蛋白胨水，使用均質(zhì)儀處理成勻漿，制成1∶10樣品稀釋液，10 000 r/min離心10 min取上清。在其中加入梯度稀釋的TDH并進(jìn)行線性回歸分析，驗證復(fù)雜基質(zhì)是否會對本方法產(chǎn)生影響。除此之外，將TDH+菌株置于堿性蛋白胨水中，37 ℃搖床培養(yǎng)24 h，菌液于10 000 r/min離心20 min，依次將產(chǎn)毒完成的菌液上清與3種模擬樣本進(jìn)行均勻混合，并進(jìn)行梯度稀釋，與菌液上清作對比，采用已確定的最佳反應(yīng)條件進(jìn)行檢測，驗證本方法是否具備檢測天然毒素的能力。

2 結(jié) 果

2.1 TDH基因的PCR擴(kuò)增與克隆 以實驗室保存的副溶血弧菌的基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到預(yù)期大小為576 bp的目的片段，陰性對照組無特異性擴(kuò)增條帶(圖1A)。將tdh基因定向克隆至表達(dá)載體pET-28a中，重組質(zhì)粒經(jīng)BamH I和EcoR I雙酶切得到約576 bp和5 000 bp左右的片段(圖1B)，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，將重組表達(dá)質(zhì)粒命名為pET-28a-TDH。

2.2 目的基因在大腸桿菌中的表達(dá)、純化和鑒定 誘導(dǎo)后的菌液沉淀在20 kDa與30 kDa之間出現(xiàn)一蛋白條帶，而誘導(dǎo)前未出現(xiàn)相應(yīng)條帶，該條帶位置與預(yù)期蛋白大小相符。由此初步推斷，目的蛋白誘導(dǎo)成功，且以包涵體形式表達(dá)。包涵體經(jīng)8 mol/L尿素變性后超聲破碎，上清經(jīng)HISTRAP HP親和柱得到純化后的蛋白，如圖2所示。

2.3 多克隆抗體純化以及評價 新西蘭白兔經(jīng)4次免疫后進(jìn)行頸動脈取血，2次離心后收集血清。采用Protein A親和層析進(jìn)行抗體純化，純化過程如圖3A所示，純化圖中標(biāo)有抗體峰的位置即為目的蛋白峰。SDS-PAGE變性和非變性電泳結(jié)果如圖3B所示，純化后的蛋白只有1條帶，大小約為150 kDa，變性后分為50 kDa、25 kDa，這與IgG抗體的結(jié)構(gòu)一致。將純化后的抗體使用Octet分子互作儀檢測抗體親和力，結(jié)果如圖3C所示，親和力常數(shù)為10-8，親和力良好。用ELISA方法檢測抗體效價，用酶標(biāo)儀測定A450值，結(jié)果見表1，效價可達(dá)1∶102 400。

表1 副溶血弧菌耐熱直接溶血素多克隆抗體效價的ELISA檢測結(jié)果Tab.1 ELISA results of polyclonal antibody titer against heat-resistant hemolysin of Vibrio parahaemolyticus

2.4 DAS-ELISA方法最佳條件的確認(rèn) 通過棋盤試驗，選擇P/N值最大且強(qiáng)陽性樣本值接近1.0，陰性樣本值接近0.1為最佳條件，得到 DAS-ELISA 方法最佳優(yōu)化結(jié)果,見表2。

表2 DAS-ELISA 方法最佳優(yōu)化結(jié)果Tab.2 Optimized conditions of the DAS-ELISA

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及體系靈敏度的確定 將TDH從10 μg/mL開始進(jìn)行連續(xù)倍比稀釋，應(yīng)用建立好的DAS-ELISA方法，以濃度為自變量，以測得A450為因變量，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果如圖4，分析得標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程為y=0.002 2x+0.094 2，R2>0.99，檢測最佳范圍為：78～312 ng/mL，最低檢出值為78 ng/mL。

2.6 特異性實驗 以建立好的DAS-ELISA方法對VVH、ETX以及CPA進(jìn)行檢測，結(jié)果見表3，3種毒素的P/N值明顯低于2.1，呈現(xiàn)陰性，表明本方法與其他抗原無交叉反應(yīng)，特異性強(qiáng)。

表3 特異性檢測結(jié)果Tab.3 Specificity test of the DAS-ELISA

2.7 模擬樣本的檢測 本實驗用扇貝、花蛤和魁蚶模擬實際應(yīng)用中海鮮樣本，在海鮮中加入TDH重組蛋白，采用建立好的DAS-ELISA方法進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示靈敏度并不會受到海鮮樣本中復(fù)雜基質(zhì)的影響，3種模擬樣本的最低檢測限均保持在78 ng/mL，標(biāo)準(zhǔn)曲線的檢測最佳范圍為：78～312 ng/mL，R2均在0.99以上，線性關(guān)系良好(圖5)。在海鮮中加入菌液上清模擬天然毒素檢測時，模擬樣本檢出率為100%，濃度測定結(jié)果與菌液上清做對比，誤差(E)為5.13%～13.25%(表4)。以上結(jié)果表明本方法具有良好的檢測復(fù)雜基質(zhì)的能力且適用于天然毒素的檢測，具備檢測市場上海鮮樣本的能力。

表4 模擬樣本檢測結(jié)果Tab.4 Detection of TDH in simulated samples

3 討 論

近年來食品安全問題頻繁發(fā)生，世界衛(wèi)生組織已將其視為世界性挑戰(zhàn)難題，而食源性致病菌產(chǎn)生的毒素是引起食品安全問題的主要原因之一。根據(jù)我國疾病監(jiān)測系統(tǒng)最新數(shù)據(jù)顯示[18]，生物性因素是引起食源性疾病的最主要因素，其中Vp是微生物性因素中所致的發(fā)病人數(shù)比例最高的致病菌，目前副溶血弧菌中毒已取代沙門氏菌成為我國沿海地區(qū)引發(fā)人類腸胃炎的首要原因[18]，也是水產(chǎn)品養(yǎng)殖內(nèi)引發(fā)甲殼類動物紅腿病、魚類敗血癥的主要致病菌。目前，Vp的致病機(jī)制尚不明確，不同學(xué)者所持觀點各不相同，有研究表明TDH具有劑量和時間依賴性的肝毒性和非常迅速的致死效應(yīng)[19]，TDH仍是公認(rèn)的Vp產(chǎn)生的最主要的致病因子。目前針對TDH的檢測主要集中在分子生物學(xué)領(lǐng)域[20]，但此類方法在毒性檢測方面具有局限性。為了更好地檢測TDH對人類的致病作用，研究人員開始聚焦于蛋白水平的檢測，如竇勇等[21]利用甲醛滅活的Vp菌體作為抗原制備兔多克隆抗體做檢測抗體[22]及TDH 毒素鼠單克隆抗體做捕獲抗體，建立的ELISA檢測方法靈敏度為6 000 ng/mL，該方法利用鼠單抗做捕獲抗體，提高了檢測特異性，但是由于捕獲抗體的制備使用的是菌體而非純化的蛋白，所以靈敏度略低。王艷等[23]以實驗室自制多克隆抗體[24]建立了檢測TDH毒素的Dot-ELISA方法，其自制的抗體效價為1∶25 600，該方法的靈敏度為25 000 ng/mL，雖然操作簡單，但是該方法在結(jié)果判定上過于主觀，且無法進(jìn)行定量檢測。由于該方法制備的抗體效價較本方法低一個數(shù)量級，所以可能導(dǎo)致靈敏度低于本方法。T. Honda等[17]利用天然菌液進(jìn)行產(chǎn)毒培養(yǎng)制備了單克隆抗體，構(gòu)建了用于TDH檢測的ELISA方法，其靈敏度可達(dá)1 ng/mL，但是天然菌液產(chǎn)毒率過低而且單克隆抗體僅能識別毒素的特定表位，在擁有較高靈敏度的同時也存在一定程度的漏檢率。

本研究通過構(gòu)建表達(dá)TDH重組蛋白，完成了多克隆抗體的制備，抗體效價可達(dá)1∶102 400，優(yōu)于既往研究；此外，抗體親和力常數(shù)為10-8，具備很好的親和力。通過利用制備的多克隆抗體建立了DAS-ELISA檢測方法，靈敏度可達(dá)78 ng/mL，優(yōu)于國內(nèi)現(xiàn)有的TDH毒素ELISA檢測方法，且特異性良好。在海鮮模擬樣本的檢測中，靈敏度并不會受到復(fù)雜基質(zhì)的影響，3種模擬樣本的最低檢測限均為78 ng/mL；與菌液上清進(jìn)行混合后驗證其檢測天然毒素能力時，檢出率為100%，表明初步具備檢測天然毒素的能力。目前，國內(nèi)僅有用于tdh基因的檢測試劑盒，針對TDH檢測的試劑盒市場仍為空白，本研究構(gòu)建的DAS-ELISA檢測方法有望開發(fā)成為副溶血弧菌TDH快速診斷試劑盒，為副溶血弧菌TDH毒素基層檢測提供新的思路。

利益沖突：無

引用本文格式：白雪欣，胡宸藝，金志穎，等. 副溶血弧菌耐熱直接溶血素DAS-ELISA檢測方法的建立[J]. 中國人獸共患病學(xué)報，2022，38(8)：666-672. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.106