良附丸治療胃寒型功能性消化不良的藥效學(xué)研究

付江波，桂蓓，李坤平，楊超燕，魏玲，梁晉如，馬江，任孟月，陳艷芬

(廣東藥科大學(xué)1.中藥學(xué)院；2.中醫(yī)藥研究院，廣州 510006)

良附丸出自《良方集腋》，主要由高良姜和香附組成，具有溫胃散寒、理氣止痛的功效，臨床主要應(yīng)用于胃脘痛、胃炎、胃潰瘍等，藥理研究表明該方具有促進胃腸運動作用[1-2]。功能性消化不良(functional dyspepsia，F(xiàn)D)是一種常見的無明確器質(zhì)性病因的胃腸疾病，主要臨床表現(xiàn)為餐后飽脹不適、早飽、上腹痛和上腹灼燒感[3]。流行病學(xué)調(diào)查顯示在亞洲人群中 FD 的發(fā)病率5%～30%，在西方國家發(fā)病率10%～40%[4]。中醫(yī)古籍對該疾病沒有確切的記載，根據(jù)FD的臨床癥狀，將其歸屬為“胃脘痛”“痞滿”“積滯”等范疇[5]。為了探討良附丸對FD是否具有潛在治療作用，本研究首先通過小鼠胃腸運動實驗和鎮(zhèn)痛實驗考察良附丸的基礎(chǔ)藥效，并通過建立胃寒型FD大鼠模型，探討良附丸治療FD的作用及其機制，為良附丸的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1動物 SPF級昆明小鼠，雌雄兼用，體質(zhì)量18～22g，實驗動物使用許可證號：SYXK-(粵)2017-0125；SPF級SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量180～220 g，實驗動物使用許可證號：SYXK-(粵)2020-0002，均購于廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心。所有動物實驗前先適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，期間水、飼料自由攝取。

1.2藥品與試劑 高良姜、醋香附購于嶺南中藥飲片有限公司，批號分別為2006001，2005001，經(jīng)廣東藥科大學(xué)程軒軒副教授鑒定為正品；按照高良姜、醋香附各 9 g配比良附丸，加水煎煮2次，收集濾液濃縮至一定濃度備用。吲哚美辛(廣東華南藥業(yè)集團有限公司，批號：190501)；多潘立酮(西安楊森制藥有限公司，批號：190107)；莫沙必利分散片(成都康弘藥業(yè)集團有限公司，批號：0I002)；羧甲基纖維素鈉(carboxymethyl-cellulose sodium，CMC-Na，天津市致遠化學(xué)試劑有限公司，批號：2016092094)；冰醋酸(國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號：20150505)；甲醛(天津市福晨化學(xué)試劑廠，批號：20190926)；電鏡固定液(賽維爾生物科技有限公司，批號：G1102)；S12包埋劑(SPI公司，批號：90529-77-4)；磷酸鹽緩沖液(PBS，賽維爾生物科技有限公司，批號：G0002)；4%多聚甲醛(賽維爾生物科技有限公司，批號：G1101)；組化試劑盒二氨基聯(lián)苯胺顯色劑(賽維爾生物科技有限公司，批號：G1211)。

1.3儀器 分析天平(日本島津 SHIMADZU，感量：0.1 mg)；醫(yī)用離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)；YLS-6B智能熱板儀(濟南益延科技發(fā)展有限公司)；包埋機(武漢俊杰電子有限公司)；病理切片機(上海徠卡儀器有限公司)；全自動酶標(biāo)儀(Bio Tek Instruments)。

1.4實驗方法與檢測指標(biāo)

1.4.1對醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)的影響 取小鼠60只，按照隨機數(shù)字表法隨機分為正常對照組，吲哚美辛組，良附丸大(14.4 g·kg-1)、中(7.2 g·kg-1)、小劑量組(3.6 g·kg-1)，每組12只。各組小鼠灌胃20 mL·kg-1相應(yīng)藥物，連續(xù)3 d，每天1次。正常對照組小鼠灌胃等劑量0.5% CMC-Na。末次給藥1 h后腹腔注射0.6%醋酸0.2 mL。觀察并記錄在15 min內(nèi)出現(xiàn)的扭體次數(shù)。扭體次數(shù)抑制率(%)=(正常對照組扭體數(shù)-給藥組扭體數(shù))/正常對照組扭體數(shù)×100%[6]。

1.4.2對甲醛致小鼠舔足反應(yīng)的影響 取小鼠60只，分組與給藥同“1.4.1”項。于每只小鼠皮下注射2.5%甲醛溶液50 μL。給藥后置于透明容器中觀察小鼠足部。每個時間段均觀察15 s，并在15 s按評分標(biāo)準(zhǔn)記錄小鼠的最高疼痛強度評分。分別記錄各組小鼠1，10，20，30，40 min的疼痛反應(yīng)分值。評分方法具體為：小鼠出現(xiàn)舔足、咬足、抖足時，為3分；小鼠出現(xiàn)提高足部時，為2分；小鼠出現(xiàn)跛行或足部輕觸地面但不負重時，為1分；小鼠正常負重、走動自如，為0分[7]。

1.4.3小鼠胃排空與腸推進實驗 取小鼠60只，稱質(zhì)量，隨機分為正常對照組，多潘立酮組，良附丸小(3.6 g·kg-1)、中(7.2 g·kg-1)、大(14.4 g·kg-1)劑量組。各組小鼠灌胃20 mL·kg-1相應(yīng)藥物，末次給藥40 min后，每只小鼠灌胃營養(yǎng)半固體糊0.8 mL。灌胃完畢后，立即對小鼠進行逐一計數(shù)。灌胃20 min后，脫頸椎處死，開腹。結(jié)扎胃賁門，取出全胃。取出后，用濾紙把胃擦干，稱總質(zhì)量(G)。然后沿胃的大曲線切開，清洗胃內(nèi)容物，用濾紙將胃體擦干，稱凈質(zhì)量(M)。胃排空率(%)=[1-(G-M)/所灌半固體營養(yǎng)糊的質(zhì)量]×100%[8]。

取出幽門到回盲部的小腸，用尺測量小腸總長度(S)及幽門端到炭末端長度(L)，計算小腸推進率。小腸推進率(%)=L/S×100%[8]。

1.4.4胃寒型FD大鼠模型實驗 大鼠72只，隨機分為6組，分別為正常對照組、模型對照組、莫沙必利組(0.016 g·kg-1)和良附丸小、中、大劑量組(1.8，3.6，7.2 g·kg-1)，每組12只。除正常對照組外其余各組均造模，胃寒型FD模型根據(jù)課題組前期經(jīng)驗構(gòu)建，即采用郭氏夾尾刺激法+不規(guī)律飲食+0.9%氯化鈉溶液多因素干預(yù)方法，造模14 d。夾尾刺激法：于每日9：30和15：30用長柄醫(yī)用紗布包裹3或4層的金屬鉗夾住大鼠尾端1/3處，激怒大鼠，與籠內(nèi)其他大鼠打斗，每次30 min；不規(guī)律飲食：單日禁食，雙日給予 飼料150 g，正常飲水；0.9%氯化鈉溶液：于每日9：00和15：00用0～4 ℃ 0.9%氯化鈉溶液灌胃大鼠(每只2 mL)。

①大鼠一般情況觀察。詳細記錄各組大鼠的精神、皮毛、活動度、糞便和進食量。食物進食量的測定方法如下：每組大鼠單獨飼養(yǎng)，稱取24 h前后飼料質(zhì)量。

②糖水偏好實驗。在實驗的第3天、第8天、第14天分別進行糖水實驗，在進行糖水偏好實驗前需對大鼠進行糖水適應(yīng)性練習(xí)，操作方法參考文獻[9]。測1 h的糖水偏好，到時間取走各組水壺，測量水壺剩余質(zhì)量，計算糖水偏好率[9]。

③曠場實驗。建模第14天，用長寬80 cm、高80 cm的黑色內(nèi)壁紙箱，底部畫出20塊等面積為12 cm×12 cm的白色方塊。將大鼠放于紙箱底部的中央，開始計時5 min。水平分數(shù)為：兩只前爪交叉在盒子底部其他方格內(nèi)的次數(shù)為1分；垂直分數(shù)為：兩只前爪抬起并爬上盒子墻壁的次數(shù)為1分。每次實驗結(jié)束后，及時清理箱體底部和內(nèi)壁，避免影響下次檢測結(jié)果[9]。

④胃腸運動實驗。末次給藥1 h后，處死大鼠，立即打開腹腔，測量胃排空率和小腸推進率，實驗具體步驟及結(jié)果見相關(guān)文獻[10]。

⑤酶聯(lián)免疫吸附測定實驗(ELISA)測定5-羥色胺(5-HT)、胃動素(motilin，MTL)、血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)、P物質(zhì)(substance P，SP)的含量。末次給藥1 h后取血，分離血清，分別測定各組大鼠血清 VIP、MTL、SP 的含量和胃腸組織5-HT水平，測定步驟嚴格按照試劑盒說明書操作。

⑥透射電鏡觀察胃竇、結(jié)腸組織中嗜鉻細胞。在新鮮組織中確定取樣部位，組織體積一般不大于1 mm×1 mm×1 mm，用電子顯微鏡固定液 4 ℃快速固定 2～4 h，用含1%鋨酸的0.1 mol·L-1磷酸鹽緩沖液(PBS，pH值7.4)沖洗3次，每次15 min。沖洗后用乙醇梯度脫水，丙酮透明，包埋烘烤后超薄切片，最后采用鈾鉛雙染色(2%醋酸鈾飽和乙醇，檸檬酸鉛)，置于透射電鏡下觀察并攝片。

⑦免疫組化(immunohistochemistry，ICH) 法觀察胃竇及空腸組織中5-HT的表達。切開胃竇和空腸組織，用 4%甲醛溶液固定，然后脫水。石蠟切片成厚4 μm切片，免疫組化染色后，置于顯微鏡下觀察并攝片。用ImageJ圖像分析系統(tǒng)進行陽性顯色的平均吸光度(A值)測定。將圖片調(diào)節(jié)為灰度圖片：Image/Type，將圖片改為8-bit；將8-bit灰度圖片轉(zhuǎn)換為A值：Analyze/Calibrate，選擇Uncalibrate OD；選擇需要測量的參數(shù)：Analyze/Set Measurements，選擇Integrated Density、Area、 Limit to Threshold；選擇陽性信號：Image/Adjust/Threshold調(diào)節(jié)閾值，選擇所有陽性信號；計算，分析結(jié)果：Analyze/Measure，得到平均A值(平均A值=積分A值/陽性區(qū)域面積)。

2 結(jié)果

2.1對醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)的影響 結(jié)果見表1。與正常對照組比較，良附丸各劑量組小鼠的平均扭體次數(shù)均有不同程度減少，呈劑量依賴關(guān)系，表明良附丸能顯著抑制醋酸刺激所致小鼠扭體的次數(shù)[F(4，55)=30.723，P<0.01或P<0.05]。

表1 5組小鼠扭體反應(yīng)比較 Tab.1 Comparison of writhing response among five groups of mice

2.2對甲醛致小鼠舔足反應(yīng)的影響 結(jié)果見表2。與正常對照組比較，良附丸各劑量組和吲哚美辛組在1 min內(nèi)差異無統(tǒng)計學(xué)意義；10 min時，良附丸各劑量組可略微減輕小鼠疼痛，吲哚美辛組能顯著降低小鼠疼痛；20～40 min時，良附丸各劑量組能降低甲醛致小鼠的疼痛值，其鎮(zhèn)痛作用隨時間延長減弱，吲哚美辛組也能顯著降低小鼠的疼痛值[F(4，55)=46.891，P<0.01或P<0.05]。

表2 5組小鼠舔足反應(yīng)(疼痛評分)比較 Tab.2 Comparison of foot licking reaction(pain score) among five groups of mice

2.3小鼠胃排空與腸推進實驗 結(jié)果見表3。與正常對照組比較，良附丸中、大劑量組小鼠胃排空率顯著升高[F(4，55)=9.558，P<0.01]。良附丸各劑量組小鼠小腸推進率均有不同程度升高[F(4，55)=74.352，P<0.05或P<0.01])。

表3 5組小鼠胃排空率和腸推進率比較 Tab.3 Comparison of gastric emptying rate and intestinal propulsion rate among five groups of mice

2.4胃寒型FD大鼠模型實驗

2.4.1一般情況 各組大鼠第1天精神狀態(tài)良好，皮毛整齊有光澤，敏感活躍，糞便呈棕色、干燥、球形，抗捕性強；造模第6天，正常對照組大鼠無異常，其余各組大鼠精神尚可，活動量如前，均有不同程度的毛發(fā)散亂，體形漸瘦，活動減少，抓捕時掙脫束縛次數(shù)逐漸減少，糞便呈褐色等癥狀；造模第10天，正常對照組大鼠無異常，其余各組大鼠出現(xiàn)活動量大幅減少，逐漸放棄掙扎，精神疲憊，聲音嘶啞，糞便呈黃色軟便等現(xiàn)象；造模第14天時，正常對照組大鼠未見異常，其余各組大鼠扎堆靜臥，神態(tài)疲倦，叫聲微弱，糞便呈時干時溏。

經(jīng)藥物治療7 d后，藥物組大鼠皮膚毛發(fā)及精神均較前明顯好轉(zhuǎn)，活動度明顯增加，抓捕時開始掙扎反抗，糞便轉(zhuǎn)干。模型對照組大鼠一般狀態(tài)較造模時略有好轉(zhuǎn)，但與正常對照組比較在活動和反應(yīng)等情況仍有明顯差異。

2.4.2體質(zhì)量、進食量及飲水量 結(jié)果見圖1。14 d造模結(jié)束時，與正常對照組大鼠比較，其余各組大鼠體質(zhì)量均明顯下降(P<0.01)。治療7 d后，各給藥組大鼠的體質(zhì)量有所改善，但與正常對照組比較仍有明顯差異；與模型對照組大鼠比較，良附丸各劑量組和莫沙必利組的體質(zhì)量明顯增長[F(5，66)=98.23，P<0.01或P<0.05]。良附丸和莫沙必利對FD模型大鼠體質(zhì)量、進食量及飲水量降低有一定改善作用。

圖1 6組大鼠體質(zhì)量的變化 Fig.1 Body mass changes in six groups of rats

2.4.3對大鼠糖水消耗百分率的影響 見表4。治療前，給藥組、模型對照組大鼠的糖水偏好率與正常對照組相比均差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而給藥組與模型對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。治療后，與正常對照組大鼠比較，模型對照組大鼠的糖水消耗百分率比較均差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型對照組比較，良附丸各劑量組大鼠的糖水偏好百分率均有不同程度上升[F(5，66)=69.914，P<0.05或P<0.01]。

表4 6組大鼠糖水消耗百分率比較 Tab.4 Comparison of sugar water consumption percentage among six groups of rats

2.4.4對大鼠曠場實驗得分的影響 見圖2。治療前，給藥組和模型對照組大鼠的曠場實驗得分與正常對照組相比均差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而藥物組與模型對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。治療后，模型對照組與正常對照組大鼠比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型對照組比較，良附丸各劑量組的曠場實驗得分均有不同程度上升[F(5，66)=165.758，114.778，152.498，120.388，P<0.05或P<0.01]，表明良附丸可能具有一定的抗焦慮作用。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.莫沙必利組；D.良附丸小劑量組；E.良附丸中劑量組；F良附丸大劑量組。①與正常對照組比較，P<0.05；②與正常對照組比較，P<0.01；③與模型對照組比較，P<0.01；④與模型對照組比較，P<0.05。圖2 6組大鼠曠場實驗水平運動和垂直運動得分 A.normal control group；B.model control group；C.mosapride group；D.Liangfu pill low dose group；E.Liangfu pill middle dose group；F Liangfu pill high dose group.①Compared with normal control group，P<0.05；②Compared with normal control group，P<0.01.③Compared with model control group，P<0.01；④Compared with model control group，P<0.05.Fig.2 Horizontal locomotion and vertical locomotion scores in the open field test in six groups of rats

2.4.5ELISA法測定5-HT、MTL、VIP、SP水平 結(jié)果見表5。與正常對照組比較，模型對照組大鼠的胃竇組織、空腸組織中5-HT、MTL、SP含量顯著下降，VIP的含量顯著升高。與模型對照組比較，給藥組大鼠的胃竇組織中、空腸組織中的5-HT含量明顯上升[F(5，66)=55.262，59.378，P<0.05或P<0.01]，MTL、SP的含量均明顯上升[F(5，66)=98.328，112.657，P<0.05或P<0.01]，VIP的含量顯著下降[F(5，66)=68.615，P<0.05或P<0.01]。說明良附丸能不同程度調(diào)節(jié)FD大鼠的胃腸組織中5-HT以及血清腦腸肽水平。

表5 6組大鼠5-HT、SP、MTL、VIP水平比較 Tab.5 Comparison of 5-HT，SP，MTL and VIP levels among six groups of rats

2.4.6透射電鏡觀察胃竇、結(jié)腸組織中嗜鉻細胞分布 腸嗜鉻細胞是腸道中的一種特化細胞，由腸上皮基底干細胞分化而來，雖然只占腸道上皮細胞的1%，但產(chǎn)生超過90%的體內(nèi)5-HT。電鏡下發(fā)現(xiàn)，呈圓形或橢圓形的腸嗜鉻細胞在正常胃黏膜和腸黏膜有較多分布，模型對照組相對較少，而與模型對照組比較，良附丸大劑量組嗜鉻細胞數(shù)量明顯增多(圖3)，提示其可能通過影響嗜鉻細胞進而調(diào)節(jié)5-HT水平產(chǎn)生胃腸功能調(diào)節(jié)作用。

圖3 3組大鼠胃腸黏膜嗜鉻細胞分布情況(×2000) Fig.3 Distribution of chromaffin cells in gastrointestinal mucosa of three groups of rats(×2000)

2.4.7IHC法觀察胃竇及腸組織中5-HT的表達 結(jié)果見圖4，5。與模型對照組比較，良附丸中、大劑量組和莫沙必利組胃竇及腸組織中5-HT陽性表達明顯增高[F(5，30)=52.063，46.891，P<0.05或P<0.01]，表明良附丸可能通過調(diào)節(jié)5-HT表達改善FD模型的胃腸動力障礙癥狀。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.莫沙必利組；D.良附丸小劑量組；E.良附丸中劑量組；F良附丸大劑量組。①與模型對照組比較，P<0.01；②與模型對照組比較，P<0.05。圖4 6組大鼠胃竇中5-HT表達水平比較(×40) A.normal control group；B.model control group；C.mosapride group；D.Liangfu pill low dose group；E.Liangfu pill middle dose group；F Liangfu pill high dose group.①Compared with model control group，P<0.01；②Compared with model control group，P<0.05.Fig.4 Comparison of 5-HT expression levels in gastric antrum among six groups of rats(×40)

A.正常對照組；B.模型對照組；C.莫沙必利組；D.良附丸小劑量組；E.良附丸中劑量組；F良附丸大劑量組。①與模型對照組比較，P<0.01；②與模型對照組比較，P<0.05。圖5 6組大鼠空腸組織中5-HT表達水平比較(×40) A.normal control group；B.model control group；C.mosapride group；D.Liangfu pill low dose group；E.Liangfu pill middle dose group；F Liangfu pill high dose group.①Compared with model control group，P<0.01；②Compared with model control group，P<0.05.Fig.5 Comparison of 5-HT expression levels in jejunal tissues of six groups of rats(×40)

3 討論

良附丸具有溫胃散寒、理氣止痛功效，可以治療寒凝氣滯導(dǎo)致的上腹痛、腹脹等病癥。FD是一種常見的臨床綜合征，發(fā)病具有持續(xù)性或反復(fù)性的特點。FD的病理生理機制認為是多種因素綜合而成的，但胃腸動力障礙和內(nèi)臟超敏反應(yīng)是目前FD最重要和公認的病理生理學(xué)基礎(chǔ)[11]。因此，本研究首先以胃腸運動實驗和鎮(zhèn)痛實驗考察了良附丸的基本藥效。研究結(jié)果表明良附丸可明顯抑制醋酸、甲醛疼痛模型，且能促進小鼠胃排空及小腸推進，初步確定了其治療功能性消化不良的潛在作用。

目前 FD 較為經(jīng)典的造模方法是夾尾刺激法或加不規(guī)則飲食法[12]，模擬的是不良生活事件形成的心理應(yīng)激和飲食失調(diào)導(dǎo)致出現(xiàn)類似FD 癥狀。本研究胃寒型FD模型采用文獻加自身經(jīng)驗的方法構(gòu)建，即采用郭氏夾尾刺激法+不規(guī)律飲食+0.9%氯化鈉溶液多因素干預(yù)方法，符合中醫(yī)實寒證的理論和表現(xiàn)。實驗結(jié)果表明，經(jīng)藥物治療7 d后，藥物組大鼠一般狀況明顯好轉(zhuǎn)，活動度明顯增加，抓捕時開始掙扎反抗，糞便轉(zhuǎn)干；良附丸對模型大鼠體質(zhì)量、進食量及飲水量降低也有一定的拮抗作用。糖水偏好實驗和曠場實驗結(jié)果表明，良附丸具有一定的抗焦慮作用。近年以來，腦腸軸與腦腸肽的異常被認為是FD發(fā)病的重要病理生理基礎(chǔ)[13]。在影響胃腸的動力因素中，5-HT是調(diào)整胃腸運動、分泌和感覺的關(guān)鍵神經(jīng)遞質(zhì)[14]。人體95%的5-HT分布在胃腸道的嗜鉻細胞和腸神經(jīng)元[15]。外周神經(jīng)系統(tǒng)90%的5-HT由嗜鉻細胞合成、分泌和再攝取。5-HT一方面可以直接影響胃腸平滑肌，另一方面可以通過調(diào)整其他神經(jīng)纖維影響胃腸運動，在調(diào)整胃腸動力及腸道敏感性方面均起著重要作用。5-HT與受體結(jié)合增加后，腸道初級傳入神經(jīng)元興奮性增加，加速胃排空、增加內(nèi)臟敏感性。除此之外，腦腸肽MTL、VIP、SP等成分對胃腸運動也具有重要的調(diào)節(jié)作用[16-17]。本研究采用透射電鏡觀察胃竇、結(jié)腸組織中嗜鉻細胞，IHC法觀察檢測5-HT的表達，ELISA檢測5-HT、MTL、VIP、SP的含量。實驗表明良附丸組嗜鉻細胞數(shù)量增多，胃竇、空腸組織中的5-HT含量相比模型對照組也有顯著增高，提示良附丸可能通過影響嗜鉻細胞進而調(diào)節(jié)5-HT水平產(chǎn)生胃腸功能調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，本研究通過小鼠鎮(zhèn)痛與胃腸動力實驗，證實了良附丸對FD的潛在治療作用；通過FD大鼠實驗觀察到良附丸的抗焦慮作用以及通過調(diào)控5-HT、SP、MTL、VIP等的含量發(fā)揮治療FD的作用，從而為良附丸的臨床應(yīng)用提供了實驗依據(jù)，下一步可針對其具體作用機制進行深入研究。