3個(gè)小分子拮抗劑與C-X-C型趨化因子受體4的構(gòu)效關(guān)系*

王坤，何璐，廖欣宇，王旭，施政良，楊光，李彥林

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)科，昆明 650031)

骨關(guān)節(jié)炎是一種常見的關(guān)節(jié)退行性疾病，目前臨床上尚無特別有效的治療方法，傳統(tǒng)的藥物治療只能緩解臨床癥狀而不能改變其病理進(jìn)程[1]。基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1(stromal cell derived factor-1，SDF-1)與C-X-C型趨化因子受體4(C-X-C chemokine receptor 4，CXCR4)結(jié)合并啟動(dòng)SDF-1/CXCR4信號(hào)通路，進(jìn)而發(fā)生一系列的生物學(xué)效應(yīng)。近年來，研究發(fā)現(xiàn)SDF-1/CXCR4信號(hào)通路在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用，通過阻斷該信號(hào)通路可以延緩關(guān)節(jié)軟骨退變[2]。筆者前期研究表明，3個(gè)小分子拮抗劑(TN14003、T140、AMD3100)均可延緩關(guān)節(jié)軟骨退變，但它們的具體作用位點(diǎn)及機(jī)制尚不清楚[3-5]。通過計(jì)算機(jī)對(duì)接技術(shù)可以很好地預(yù)測(cè)藥物與靶點(diǎn)的空間構(gòu)型及相互作用機(jī)制，并能找到藥物的關(guān)鍵作用基團(tuán)，極大地減少了新藥研發(fā)的盲目性[6]。因此，筆者在前期研究的基礎(chǔ)上，借助計(jì)算機(jī)模擬對(duì)接技術(shù)，深入探索TN14003、T140和AMD3100的藥效基團(tuán)及作用機(jī)制，找到它們與CXCR4的構(gòu)效關(guān)系，為3個(gè)小分子拮抗劑的進(jìn)一步優(yōu)化及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)軟件、細(xì)胞及主要試劑 使用英國(guó)劍橋大學(xué)晶體數(shù)據(jù)中心研發(fā)的GOLD5.2.2版分子對(duì)接軟件和美國(guó)Tripos公司開發(fā)的SYBYL-X 2.0版計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)軟件，以及美國(guó)Biovia公司的Accelrys Discovery Studios 4.5版藥物設(shè)計(jì)軟件。由于骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞傳代后容易衰老，因此本部分實(shí)驗(yàn)選用第1代(passage 1，P1)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。TN14003及T140購(gòu)自北京中科亞光公司，AMD3100購(gòu)自美國(guó)Peprotech公司，人基質(zhì)金屬蛋白酶-13(matrix metalloproteinase-13，MMP-13)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)實(shí)驗(yàn)試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D Systems公司。

1.2受體和配體準(zhǔn)備 分子對(duì)接技術(shù)是分析配體與受體相互作用的主要方法，在小分子藥物研發(fā)中愈來愈受到重視。在進(jìn)行分子對(duì)接之前，需要進(jìn)行配體和受體的準(zhǔn)備和優(yōu)化。受體結(jié)構(gòu)主要來源于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)(prorein data bank，PDB)晶體數(shù)據(jù)庫(kù)(www.rcsb.org)或者根據(jù)同源建模等方法通過計(jì)算機(jī)模擬獲得。通常情況下，如果PDB晶體數(shù)據(jù)庫(kù)中已有解析好的晶體結(jié)構(gòu)則優(yōu)先選用該類結(jié)構(gòu)，以確保晶體結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確性。恰好，在PDB晶體數(shù)據(jù)庫(kù)中能檢索到CXCR4的晶體結(jié)構(gòu)，因此筆者選定PDB編號(hào)為3ODU的蛋白晶體結(jié)構(gòu)作為受體結(jié)構(gòu)。受體蛋白結(jié)構(gòu)的選擇一般遵循以下規(guī)則：①分辨率高，resolution值通常不應(yīng)小于2.5?；②蛋白結(jié)構(gòu)應(yīng)較為完整，蛋白活性口袋周圍的氨基酸殘基尤其不能缺失；③以能包含配體結(jié)構(gòu)較大為宜。因此，根據(jù)該原則設(shè)定3ODU蛋白resolution值為2.5?，活性口袋周圍氨基酸殘基較為完整，包含配體IT1t結(jié)構(gòu)較大。

受體和配體的準(zhǔn)備是分子對(duì)接模擬的前提，主要包含4個(gè)步驟：①?gòu)腜DB晶體庫(kù)下載蛋白，并應(yīng)用藥物設(shè)計(jì)軟件Accelrys Discovery Studios 4.0刪除蛋白3ODU原始結(jié)構(gòu)所包含的所有共結(jié)晶水以及無用的小分子配體；②用Discovery Studios自動(dòng)優(yōu)化蛋白，蛋白的優(yōu)化過程主要包含五步：cleaning protein、inserting missing、refining loops、minimizing loops、protonating protein，優(yōu)化好的蛋白存儲(chǔ)為.mol2格式備用；③運(yùn)用化學(xué)作圖工具ChemDraw15.0構(gòu)建TN14003、T140和AMD3100分子結(jié)構(gòu)，并分別存為.mol格式，由于分子對(duì)接所需配體結(jié)構(gòu)為3D形式，故應(yīng)用OpenBabel將小分子格式轉(zhuǎn)為.mol2格式；④將相應(yīng)結(jié)構(gòu)導(dǎo)入SYBYL-X 2.0進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，優(yōu)化過程主要包括加氫、加電荷等，優(yōu)化好的分子存為1個(gè).mol2格式的文件以備用。

1.3分子對(duì)接 采用GOLD5.2.2版軟件進(jìn)行分子對(duì)接研究。在分子對(duì)接的過程中，打分函數(shù)的選定以及活性位點(diǎn)的定義是對(duì)接結(jié)果好壞的重要因素。經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)，分別選定goldscore_P450_csd作為最佳打分模板及ChemPLP作為打分函數(shù)進(jìn)行后續(xù)分子的對(duì)接研究。在Discovery Studios軟件中優(yōu)化好蛋白后，利用該軟件Receptor-ligand interactions模塊中的Define and edit binding site，根據(jù)from PDB site record定義出活性位點(diǎn)，并顯示其坐標(biāo)：22.8，-7.774，70.712。由于AMD3100分子結(jié)構(gòu)較小，TN14003和T140的分子結(jié)構(gòu)較大，故將TN14003、T140對(duì)接活性位點(diǎn)為前述坐標(biāo)周圍25?的范圍，而將AMD3100對(duì)接活性位點(diǎn)為前述坐標(biāo)周圍15?的范圍。每個(gè)分子在分子對(duì)接過程中生成200種構(gòu)象，保留每個(gè)化合物排名前30的構(gòu)象保存，以備后續(xù)研究。對(duì)接后主要生成1個(gè).mol2格式的文件，以保存各分子對(duì)接后構(gòu)象，同時(shí)生成1個(gè).lst文件以應(yīng)用于每個(gè)分子的對(duì)接打分，方便后續(xù)計(jì)算參數(shù)。分子對(duì)接完成后，利用Discovery Studio 4.5 visualize和Pymol等軟件對(duì)分子對(duì)接結(jié)構(gòu)進(jìn)行結(jié)合模式和相互作用等可視化分析。

1.43個(gè)小分子拮抗劑抑制骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞分泌MMP-13的生物活性 TN14003、T140和AMD3100主要是通過阻斷SDF-1/CXCR4信號(hào)通路而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。前期實(shí)驗(yàn)表明AMD3100能體外減緩軟骨細(xì)胞分泌MMP-13，因此本部分實(shí)驗(yàn)通過觀察3個(gè)小分子拮抗劑干預(yù)軟骨細(xì)胞分泌MMP-13的生物學(xué)效應(yīng)，進(jìn)而驗(yàn)證計(jì)算機(jī)對(duì)接模擬小分子藥物的可靠性。

收集確診為膝骨關(guān)節(jié)炎行膝關(guān)節(jié)置換術(shù)患者的軟骨組織塊(改良Mankin評(píng)分為0或1)，軟骨標(biāo)本的采集征得患者知情和同意。采用胰酶聯(lián)合Ⅱ型膠原酶兩步消化法體外培養(yǎng)人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞(原代細(xì)胞)，經(jīng)過第1次傳代后為P1代骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞。P1代骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞隨機(jī)分成A組、B組、C組、D組，A組、B組、C組預(yù)先分別加入1000 nmol·L-1TN14003、T140、AMD3100拮抗劑1 h，然后4組同時(shí)加入100 ng·mL-1SDF-1。4組細(xì)胞以1×105·mL-1的細(xì)胞密度接種于24孔培養(yǎng)板中，每3孔作為同一時(shí)間點(diǎn)復(fù)孔，每孔含培養(yǎng)基600 μL，于37 ℃、5%二氧化碳(CO2)恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)12 h后，移去培養(yǎng)液及因胰酶消化而受損導(dǎo)致貼壁不牢的細(xì)胞，每組加入含相應(yīng)藥物的新鮮培養(yǎng)基。4組細(xì)胞在加藥干預(yù)培養(yǎng)第2、第4天時(shí)，每孔細(xì)胞收集培養(yǎng)基500 μL，并迅速置于-80 ℃深低溫冰箱中保存，用人MMP-13 ELISA試劑盒檢測(cè)每組細(xì)胞培養(yǎng)基中MMP-13含量。

2 結(jié)果

2.13個(gè)小分子拮抗劑的分子對(duì)接結(jié)果 通過計(jì)算機(jī)模擬對(duì)接軟件可以直接顯示對(duì)接得分，主要選取得分較高且與受體結(jié)合模式較好的構(gòu)象進(jìn)行分析，結(jié)果見表1。實(shí)驗(yàn)得出TN14003、T140和AMD3100與受體CXCR4形成氫鍵的數(shù)目不一。從分子對(duì)接結(jié)果來看，無論是對(duì)接得分還是形成氫鍵數(shù)目，TN14003均表現(xiàn)最好，T140次之。可見TN14003與靶標(biāo)蛋白CXCR4結(jié)合最為緊密，T140稍差于TN14003，AMD3100最小。

表1 TN14003、T140、AMD3100與CXCR4的分子對(duì)接結(jié)果 Tab.1 Molecular docking results among TN14003，T140，AMD3100 and CXCR4

2.2小分子拮抗劑TN14003與受體CXCR4的計(jì)算機(jī)模擬 通過計(jì)算機(jī)對(duì)接模擬實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)小分子拮抗劑TN14003與受體CXCR4形成氫鍵的氨基酸為：Arg2、Nal3、Cys4、Tyr5、Arg6、Arg11和Cit12；TN14003與CXCR4蛋白形成13個(gè)氫鍵，形成氫鍵的受體氨基酸為：Ser178、Glu32、Gln272、Glu179、Cys186、Asp187、Arg30、Glu277、Cys28和Asp97，其中Ser178、Glu32和Gln272與配體各形成2個(gè)氫鍵(圖1A)。計(jì)算機(jī)模擬二維結(jié)構(gòu)觀察后發(fā)現(xiàn)，TN14003與受體分子CXCR4主要形成氫鍵作用、π-烷基相互作用和π-sulfur相互作用(圖1a)。

圖A中紅色虛線為氫鍵，綠色分子為CXCR4氨基酸殘基，藍(lán)色分子為配體TN14003，虛體為受體CXCR4螺旋結(jié)構(gòu)；圖a中小球表示受體CXCR4氨基酸，編號(hào)代表氨基酸位置，不同顏色的小球及虛線表示相互作用的不同，與虛線相連的配體基團(tuán)即為與受體發(fā)生相互作用的特定基團(tuán)。圖1 TN14003與CXCR4計(jì)算機(jī)3D模擬圖(A) 和2D模擬圖(a) Red dotted line is hydrogen bond；green molecule is CXCR4 amino acid residue；blue molecule is ligand TN14003；virtual body is helical structure of receptor CXCR4 in Fig.A；The small ball represents receptor CXCR4 amino acid，number represents amino acid position；the different color of the ball and the dotted line represents different interaction；the ligand group connected to the dotted line is the specific group that interacts with the receptor in Fig.a.Fig.1 Computer 3D (A)and 2D (a) simulation diagram between TN14003 and CXCR4

2.3小分子拮抗劑T140與受體CXCR4的計(jì)算機(jī)模擬 通過計(jì)算機(jī)對(duì)接模擬實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)T140與CXCR4蛋白形成12個(gè)氫鍵，形成氫鍵的受體氨基酸為：Gln200、Arg30、Asp262、Cys186、Ala98、Asp193、Tyr255、Asp262、Asp187和Glu32，其中Gln200和Arg30與配體分子各形成2個(gè)氫鍵，Asp187和Asp193與T140各形成了1個(gè)氫鍵。與受體形成氫鍵的T140氨基酸為：Arg1、Arg2、Nal3、Cys4、Tyr5、Xaa6、Tyr10、Arg11和Cit12(圖2A)。Leu266和Ala180與T140主要形成了π-烷基相互作用。此外受體氨基酸Phe29、Ile265、Glu277、Ser285、Ile284、Val99、His281、Glu288、Ile259、Trp94、Val112、Tyr116、His113、Ile185、Asp182、Tyr190和Glu179均與配體T140存在范德華相互作用(圖2a)。

藍(lán)色分子為配體T140，虛體為受體CXCR4螺旋結(jié)構(gòu)，編號(hào)代表氨基酸位置，其余關(guān)于本圖的詳細(xì)描述請(qǐng)參照?qǐng)D1。圖2 T140與CXCR4計(jì)算機(jī)3D模擬圖(A)和2D模擬圖(a) Blue molecule is ligand T140；virtual body is helical structure of receptor CXCR4；number represents the amino acid position；other detailed description of this figure please refer to Fig.1.Fig.2 Computer 3D (A)and 2D (a) simulation diagram between T140 and CXCR4

2.4小分子拮抗劑AMD3100與受體CXCR4的計(jì)算機(jī)模擬 研究結(jié)果顯示，AMD3100分子結(jié)構(gòu)中含有2個(gè)四氮雜環(huán)，其中1個(gè)四氮雜環(huán)的第4、8位氮基團(tuán)和另1個(gè)四氮雜環(huán)的第4位氮基團(tuán)與受體CXCR4形成氫鍵，它與受體分子一共形成了4個(gè)氫鍵，受體分子CXCR4氨基酸分別是：Arg188、 Asp187和Asp97(圖3A)。關(guān)鍵氨基酸Asp187與配體分子AMD3100形成2個(gè)氫鍵，Asp97與AMD3100形成1個(gè)氫鍵。Arg30、Trp94、Tyr116、Tyr190、Gln200、His281、Val196、Trp102、Cys186、Ile284、His133和Ser285與AMD3100發(fā)生范德華相互作用(圖3a)。

藍(lán)色分子為配體AMD3100，虛體為受體CXCR4螺旋結(jié)構(gòu)，編號(hào)代表氨基酸位置，其余關(guān)于本圖的詳細(xì)描述請(qǐng)參照?qǐng)D1。圖3 AMD3100與CXCR4計(jì)算機(jī)3D模擬圖(A)和2D模擬圖(a) Blue molecule is ligand AMD3100；virtual body is helical structure of receptor CXCR4；number represents the amino acid position；other detailed description of this figure please refer to Fig.1.Fig.3 Computer 3D (A)and 2D (a) simulation diagram between AMD3100 and CXCR4

2.53個(gè)小分子拮抗劑抑制骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞分泌MMP-13的生物活性 A組、B組、C組、D組細(xì)胞分泌至培養(yǎng)基中MMP-13的含量經(jīng)ELISA法檢測(cè)，結(jié)果見表2：①相同時(shí)間點(diǎn)組間比較，A組、B組、C組、D組培養(yǎng)基中MMP-13含量依次遞增，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示在拮抗效率方面：TN14003>T140>AMD3100。②同一組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)比較，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，A組、B組、C組、D 組分泌至培養(yǎng)基中MMP-13含量逐漸增高，但A組增高較緩慢，均低于B組、C組、D組，組內(nèi)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表2 4組軟骨細(xì)胞分泌至培養(yǎng)基中的MMP-13的含量 Tab.2 The levels of MMP-13 secreted into the culture medium by chondrocytes in four groups

3 討論

CXCR4(TN14003、T140、AMD3100)屬于G蛋白偶聯(lián)受體(G protein coupled receptors，GPCRs)中的一員[7]。結(jié)構(gòu)決定功能，目前有35%～45%的藥物是針對(duì)GPCRs的結(jié)構(gòu)而研發(fā)出來的，其中就包含CXCR4拮抗劑[8]。AMD3100最早發(fā)現(xiàn)是一種人工合成的大環(huán)類CXCR4特異性拮抗劑[9]，與SDF-1通過競(jìng)爭(zhēng)受體而達(dá)到阻斷SDF-1/CXCR4信號(hào)通路的作用，但具有心臟毒性等缺點(diǎn)。T140在抗人類免疫缺陷病毒、抗腫瘤等方面均具有重要作用[10]，但生物穩(wěn)定性稍差；TN14003則具有拮抗效率高及穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，但TN14003在骨關(guān)節(jié)炎方面的研究較少。

3.1小分子拮抗劑在骨關(guān)節(jié)炎中的研究現(xiàn)狀 SDF-1/CXCR4信號(hào)通路在骨關(guān)節(jié)炎中發(fā)病過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[2]，小分子拮抗劑通過阻斷該信號(hào)通路而延緩關(guān)節(jié)軟骨退變[11]。通過對(duì)小分子拮抗劑的深入研究，希望能找到一種從病理進(jìn)程上延緩骨關(guān)節(jié)炎的藥物。

前期研究發(fā)現(xiàn)[3，5，10]，3個(gè)小分子CXCR4拮抗劑(AMD3100、T140、TN14003)具有延緩關(guān)節(jié)軟骨退變，但三者在拮抗效率及生物穩(wěn)定性等方面并不一樣。TN14003通過上調(diào)miR-146a-5p表達(dá)而抑制由SDF-1誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨退變[4]。雖然已經(jīng)開展了許多關(guān)于3個(gè)小分子拮抗劑的研究，但它們是如何發(fā)揮這種拮抗作用的具體機(jī)制并不清楚。因此，本研究通過計(jì)算機(jī)對(duì)接模擬技術(shù)，深入探索這3個(gè)小分子拮抗劑與CXCR4蛋白相互作用的分子機(jī)制。

3.2計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)在新藥研發(fā)中的應(yīng)用 傳統(tǒng)的藥物研發(fā)是一個(gè)漫長(zhǎng)且耗資巨大的過程。新藥研發(fā)有多種方法，有針對(duì)原癌基因研發(fā)的新型藥物[12]，也有靶向藥物制劑的研究[13]。近年來，隨著計(jì)算機(jī)科學(xué)技術(shù)發(fā)展，計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)方法日趨成熟。通過與生物實(shí)驗(yàn)緊密結(jié)合，計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)在藥物研究中正發(fā)揮著重要作用，現(xiàn)在已有許多關(guān)于應(yīng)用計(jì)算機(jī)分子對(duì)接輔助藥物設(shè)計(jì)的報(bào)道[14-15]。目前已經(jīng)解析出許多GPCRs的晶體結(jié)構(gòu)，其中包括CXCR4的晶體結(jié)構(gòu)[16]。 CXCR4三維晶體結(jié)構(gòu)的解析為深入研究CXCR4及其配體藥物帶來極大的便利，其結(jié)構(gòu)特征是理解藥物產(chǎn)生藥效機(jī)制并用于藥物研發(fā)的分子基礎(chǔ)[17]。

3.3計(jì)算機(jī)對(duì)接模擬技術(shù)應(yīng)用于TN14003、T140及AMD3100小分子藥物 計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)的方法主要分為2種：一種是基于配體的藥物設(shè)計(jì)，另一種是基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)[18]。基于配體的藥物設(shè)計(jì)方法包括定量構(gòu)效關(guān)系和藥效基團(tuán)方法，基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)方法主要分為分子對(duì)接和全新藥物設(shè)計(jì)。

本實(shí)驗(yàn)中，由于小分子拮抗劑(TN14003、T140、AMD3100)和CXCR4的結(jié)構(gòu)是已知的，應(yīng)用計(jì)算機(jī)模擬對(duì)接技術(shù)，分別構(gòu)建這3個(gè)小分子拮抗劑與CXCR4的對(duì)接模擬結(jié)構(gòu)。對(duì)接結(jié)果精確地找出3個(gè)小分子拮抗劑與CXCR4的藥效基團(tuán)及作用位點(diǎn)?？梢猿醪秸J(rèn)為，這些結(jié)合位點(diǎn)屬于3個(gè)小分子藥物的核心基團(tuán)，與CXCR4不結(jié)合的基團(tuán)屬于藥效基團(tuán)之外的基團(tuán)，于是可以在藥效基團(tuán)以外的位點(diǎn)上進(jìn)行修飾，一方面可以制備小分子藥物探針，另一方面還可以進(jìn)行藥物的優(yōu)化。通過計(jì)算機(jī)軟件打分，得分越高則結(jié)合越緊密，初步提示藥物的拮抗效率越好。筆者發(fā)現(xiàn)TN14003的得分稍高于T140，并且明顯高于AMD3100，可以初步認(rèn)定，TN14003的拮抗效率稍高于T140，明顯高于AMD3100，這個(gè)結(jié)果與 BURGER等[19]的研究結(jié)果相符。另外，本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)了CXCR4與TN14003、T140和AMD3100的對(duì)接位點(diǎn)，找到了配體與受體的相互作用分子機(jī)制。因此，通過計(jì)算機(jī)對(duì)接模擬技術(shù)可以直觀地發(fā)現(xiàn)小分子配體藥物與其受體的構(gòu)效關(guān)系。

3.4TN14003、T140、AMD3100對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞分泌MMPs的影響 MMP-13為骨關(guān)節(jié)炎軟骨破壞中膠原酶指標(biāo)[20]。本實(shí)驗(yàn)中，TN14003、T140及AMD3100均能減少骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞MMP-13的分泌。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這3個(gè)小分子拮抗劑減緩骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞分泌MMP-13的效率依次為：TN14003>T140>AMD3100，這與計(jì)算機(jī)對(duì)接模擬結(jié)果一致。

綜上所述，通過計(jì)算機(jī)對(duì)接模擬技術(shù)提前預(yù)測(cè)3個(gè)小分子拮抗劑(TN14003、T140及AMD3100)的核心作用基團(tuán)及與受體蛋白(CXCR4)的作用機(jī)制，同時(shí)通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)初步驗(yàn)證了它們的生物學(xué)效應(yīng)，這對(duì)將來優(yōu)化3個(gè)小分子拮抗劑具有重要作用，但要想獲得一種高效、安全的抗骨關(guān)節(jié)炎藥物，仍需要大量的生物學(xué)及臨床試驗(yàn)驗(yàn)證。