兩株西洋參根際拮抗細(xì)菌的鑒定及其抑菌促生效果

章嘉會(huì)，魏艷麗，李紅梅，扈進(jìn)冬，安淑輝，李紀(jì)順

(齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)生態(tài)研究所，山東 濟(jì)南 250103)

土壤微生物在土壤養(yǎng)分循環(huán)、物質(zhì)轉(zhuǎn)化、作物養(yǎng)分有效性、抑制病原菌等方面發(fā)揮積極的作用。定殖于根際土壤中的微生物對(duì)植物根系發(fā)育、植株生長(zhǎng)具有重要影響[1]。 由于土壤和根際微生物對(duì)非生物條件(包括環(huán)境脅迫和擾動(dòng))的微小變化非常敏感，被認(rèn)為是土壤質(zhì)量的重要指標(biāo)[2]。 植物根際促生菌的作用方式分為兩種:一種是直接作用，通過(guò)為植物提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如固氮[3]、溶磷[4]或者通過(guò)調(diào)節(jié)赤霉素、細(xì)胞分裂素、茉莉酸、脫落酸和吲哚乙酸(IAA)等植物激素來(lái)刺激植物的生長(zhǎng)發(fā)育[5-7]；另一種是間接作用，通過(guò)產(chǎn)生鐵載體、抗生素等方式和病原菌競(jìng)爭(zhēng)生態(tài)位抑制病原菌的生長(zhǎng)，降低病害對(duì)植物的影響，促進(jìn)植物生長(zhǎng)[8-10]。

西洋參(Panax quinquefolium)為五加科人參屬多年生草本植物，其干燥根是一種珍貴的藥材。隨著種植年限的延長(zhǎng)，西洋參病害逐漸加劇，連作障礙現(xiàn)象嚴(yán)重影響了其品質(zhì)及產(chǎn)量[11]。 化學(xué)防治不僅影響西洋參的品質(zhì)，還容易造成環(huán)境污染。運(yùn)用根際促生菌可消減連作障礙[12]，其中尋找有效的多功能根際促生菌成為關(guān)鍵所在。 本試驗(yàn)以從西洋參根際土壤中分離到的兩株拮抗細(xì)菌為研究對(duì)象，對(duì)其ACC 脫氨酶活性、產(chǎn)IAA 及鐵載體的能力、抑菌特性和促生效果進(jìn)行測(cè)定，以期為根際拮抗細(xì)菌在西洋參生產(chǎn)中的開發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

試驗(yàn)于2021年9—12月在山東省科學(xué)院生態(tài)研究所中進(jìn)行。 拮抗細(xì)菌JK-1 和JK-4 分離自山東威海榮成虎山鎮(zhèn)4年生西洋參根際土，純化后保存于-80℃。

9 株常見病原真菌:禾谷絲核菌(Rhizoctonia cerealis)、小葡萄坐腔菌(Botryosphaeria parva)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、串珠鐮孢菌(Fusarium moniliforme)、交鏈格孢(Alternaria alternata)、茄棒孢菌(Corynespora melongnaeTakimoto)、立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)、假禾谷鐮孢菌(Fusarium pseudograminearum)、膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioide)，由本實(shí)驗(yàn)室保存。

3 株西洋參病原真菌:腐皮鐮孢菌(Fusarium solani)和尖孢鐮孢菌(Fusarium oxysporum)由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存；毀滅柱孢菌(Cylindrocarpon destructans) ACCC39132 購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.2 供試培養(yǎng)基

檢測(cè)菌株ACC 脫氨酶能力的TSB 培養(yǎng)液和DF 液體培養(yǎng)基[13]；驗(yàn)證鐵載體的CAS 培養(yǎng)基和鐵載體類型檢測(cè)的LNM 液體培養(yǎng)基[14]；檢測(cè)菌株IAA 含量的King-B 細(xì)菌培養(yǎng)基[15]。

1.3 拮抗細(xì)菌JK-1 和JK-4 的16S rDNA 測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育分析

使用天根生化科技(北京)有限公司的細(xì)菌基因組提取試劑盒提取菌株基因組DNA，具體方法參照試劑盒說(shuō)明書。 16S rDNA 基因采用通用引物27F(5′- AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和1492R (5′- GGYTACCTTGTTACGACTT-3′)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。 擴(kuò)增體系(25.0 μL):DNA 模板1.0 μL，PowerPol 2× PCR Mix with Dye 12.5 μL，引物各0.5 μL，ddH2O 10.5 μL。 擴(kuò)增程序:98℃預(yù)變性45 s；98℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸20 s，共30 個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后，由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。 測(cè)序結(jié)果在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST 相似性比對(duì)分析，下載同源序列，利用MEGA 5.0 軟件中的鄰近法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 拮抗細(xì)菌對(duì)植物病原菌的拮抗作用

采用平板對(duì)峙法進(jìn)行抑菌能力測(cè)定。 在PDA 平板中央接種生長(zhǎng)72 h 的病原真菌菌餅(直徑9 mm)，在距離菌餅邊緣2.0 cm 等距的4 個(gè)點(diǎn)上分別接種菌株JK-1 和JK-4 菌懸液5.0 μL，于28℃恒溫培養(yǎng)3 ～5 d，觀察是否有抑菌帶產(chǎn)生。重復(fù)3 次，以接種無(wú)菌水為對(duì)照，待對(duì)照菌落長(zhǎng)滿整個(gè)平板時(shí)測(cè)量菌落直徑并計(jì)算抑制率。

抑制率(%)＝(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/對(duì)照菌落直徑×100 。

1.5 拮抗細(xì)菌促生能力測(cè)定

1.5.1 ACC 脫氨酶活性檢測(cè) ACC 脫氨酶活性測(cè)定參照費(fèi)詩(shī)萱等[16]的方法。 分別將拮抗細(xì)菌JK-1 和JK-4 在TSB 培養(yǎng)液中28℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，7000 r/min 離心5 min 收集沉淀。用7.5 mL 不含硫酸銨的DF 液體培養(yǎng)基重懸菌體并加入0.5 mol/L 的ACC 溶液45 μL。 28℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h，12000 r/min 離心2 min 收集沉淀，用0.1 mol/L Tris-HCl 緩沖液(pH ＝7.6)洗滌離心兩次，用0.1 mol/L 的Tris-HCl 緩沖液(pH＝8.5)600 μL 重懸，加入30 μL 甲苯后迅速振蕩30 s。 采用2，4-二硝基苯肼比色法繪制α-丁酮酸標(biāo)準(zhǔn)曲線并測(cè)定拮抗菌株的ACC 脫氨酶活性，以不添加ACC 溶液作為對(duì)照，測(cè)定反應(yīng)溶液在540 nm 波長(zhǎng)下的吸光值(A540)。 根據(jù)α-丁酮酸溶液濃度及其對(duì)應(yīng)的吸光值(A540)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)根據(jù)樣品中α-丁酮酸含量，計(jì)算出每單位時(shí)間ACC 脫氨酶催化生成α-丁酮酸的量，酶比活力單位為U/mg。

1.5.2 產(chǎn)鐵載體能力及類型測(cè)定 產(chǎn)鐵載體能力采用榮良燕等[9]的方法。 分別將LB 平板上的拮抗細(xì)菌JK-1 和JK-4 單菌落點(diǎn)接在CAS 固體檢測(cè)平板上，每個(gè)平板接種4 個(gè)點(diǎn)，28℃培養(yǎng)72 h。 觀察平板上菌落形態(tài)，分泌鐵載體的細(xì)菌菌落周圍會(huì)出現(xiàn)明顯的橘黃色暈圈，測(cè)定暈圈大小，計(jì)算可溶性指數(shù)。

可溶性指數(shù)＝(暈圈＋菌落直徑)/菌落直徑。

菌株產(chǎn)生的鐵載體化學(xué)結(jié)構(gòu)采用張孝龍等[17]的方法進(jìn)行判定。 將LB 培養(yǎng)基上的單菌落轉(zhuǎn)接到LNM 液體培養(yǎng)基，28℃、160 r/min 培養(yǎng)24 h，每個(gè)菌株3 次重復(fù)，利用氯化鐵分別檢測(cè)異羥肟酸型鐵載體和兒茶酚型鐵載體，利用分光光度檢測(cè)法判斷是否有羧酸型鐵載體的產(chǎn)生。

1.5.3 產(chǎn)IAA 能力檢測(cè) 細(xì)菌產(chǎn)IAA 能力測(cè)定參考張國(guó)壯等[18]的Salkowski 方法并進(jìn)行改良。將菌株分別接種在含0.5 g/L 色氨酸的King-B 液體培養(yǎng)基中，28℃、160 r/min培養(yǎng)48 h，8000 r/min離心5 min，取上清液2.0 mL 加入50.0 μL 體積分?jǐn)?shù)為83%的正磷酸和Salkowski 試劑4.0 mL，溶液變?yōu)榉奂t色表示有IAA 產(chǎn)生。 IAA 濃度采用比色法測(cè)定，以含色氨酸的無(wú)菌King-B 培養(yǎng)基為對(duì)照，測(cè)定530 nm 下的吸光值(A530)，重復(fù)3 次。

1.6 拮抗細(xì)菌對(duì)小麥和黃瓜種子發(fā)芽的影響試驗(yàn)

將拮抗細(xì)菌JK-1 和JK-4 在固體LB 培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h，轉(zhuǎn)接至無(wú)菌LB 液體培養(yǎng)基中，28℃、160 r/min 培養(yǎng)48 h，將發(fā)酵液在10000 r/min離心5 min 去除菌體，上清液過(guò)0.22 μm 濾膜后得到發(fā)酵濾液，用無(wú)菌水將發(fā)酵濾液稀釋500 倍備用。 分別將小麥種子和黃瓜種子用70%乙醇消毒5 min，無(wú)菌水清洗3～5 次，無(wú)菌培養(yǎng)皿中放置3 層無(wú)菌濾紙，每個(gè)培養(yǎng)皿加入5.0 mL 500 倍稀釋發(fā)酵濾液后均勻放入20 粒消毒的小麥或黃瓜種子，以無(wú)菌水為對(duì)照，每處理3 次重復(fù)，每日觀察并統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽情況，48 h 后測(cè)量其芽長(zhǎng)和根長(zhǎng)。

其中，Gt 為t 時(shí)間內(nèi)的發(fā)芽數(shù)，Dt 為相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)。

1.7 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 25.0 對(duì)不同處理間數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA 方差分析，P＜0.05 為顯著性差異，利用OriginPro 2021 進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗細(xì)菌16S rDNA 基因序列測(cè)定及分析

將菌株16S rDNA 序列在GenBank 中進(jìn)行BLAST 同源性分析對(duì)比發(fā)現(xiàn)，JK-1 和分離自越南土壤中的洋蔥伯克霍爾德氏菌(Burkholderia cepaciaDF2 MG768914.1)的序列(GenBank 收錄號(hào)MG768914.1)相似度達(dá)到99.80%；JK-4 和分離自中國(guó)水稻上的越南伯克霍爾德氏菌(B. vietnamiensisRTA ) 的 序 列 ( GenBank 收 錄 號(hào)MK014280)相似度達(dá)到99.86%。 運(yùn)用MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果(圖1)顯示，JK-1 與B. cepacia處于同一分支，JK-4 與B. vietnamiensis處于同一分支。 因而確定JK-1 是洋蔥伯克霍爾德氏菌(B. cepacia)，JK-4 為越南伯克霍爾德氏菌(B.vietnamiensis)。

圖1 菌株JK-1 和JK-4 的16S rDNA 序列系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 拮抗細(xì)菌對(duì)植物病原菌的抑制作用

由表1 可知，兩株拮抗菌對(duì)12 株病原真菌都有拮抗活性。 JK-1 和JK-4 對(duì)膠孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioide)的抑制率最低，分別為53.13%和35.94%。 對(duì)其他11 株病原真菌的抑制率在55.00%～80.36%之間，其中JK-1 對(duì)小葡萄坐腔菌(Botryosphaeria parva)、JK-4 對(duì)假禾谷鐮孢菌(Fusarium pseudograminearum)的抑制率最高，分別為80.36%和79.61%。 JK-1 對(duì)串珠鐮孢菌(Fusarium moniliforme)、膠孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioide)、腐皮鐮孢菌(Fusarium solani)和尖孢鐮孢菌(Fusarium oxysporum)的抑制率分別為67.50%、53.13%、70.19%和75.46%，顯著大于JK-4。 JK-4 對(duì)茄棒孢菌(Corynespora melongnaeTakimoto)、立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)和假禾谷鐮孢菌(Fusarium pseudograminearum)的抑制率為68.33%、79.06%和79.61%，顯著大于JK-1。

表1 菌株JK-1 和JK-4 對(duì)12 株病原真菌的抑制效果

2.3 拮抗細(xì)菌產(chǎn)ACC 脫氨酶活性

如圖2 所示，JK-1 菌株產(chǎn)ACC 脫氨酶的比活力較高，為0.50 U/mg，JK-4 菌株產(chǎn)ACC 脫氨酶的比活力是0.19 U/mg，兩菌株產(chǎn)生的ACC 脫氨酶活性有顯著差異(P＜0.05)。

圖2 西洋參根系拮抗菌株產(chǎn)ACC 脫氨酶活性

2.4 拮抗細(xì)菌產(chǎn)IAA 能力

兩株拮抗菌都可以產(chǎn)生IAA(圖3)，其中菌株JK-1 培養(yǎng)液中IAA 濃度為13.93 mg/L，JK-4中的IAA 濃度為4.55 mg/L，兩菌株產(chǎn)IAA 的能力存在顯著差異(P＜0.05)。

圖3 西洋參根系拮抗菌株產(chǎn)IAA 能力

2.5 拮抗細(xì)菌產(chǎn)鐵載體能力及類型測(cè)定

由圖4 可以看出，JK-1 和JK-4 在CAS 固體平板上都可產(chǎn)生橘黃色暈圈，JK-1 產(chǎn)生暈圈直徑明顯大于JK-4。 經(jīng)測(cè)定，JK-1 菌株產(chǎn)生鐵載體的可溶性指數(shù)是4.08，JK-4 菌株為1.50，二者產(chǎn)鐵載體能力差異顯著(P＜0.05)。 JK-1 和JK-4產(chǎn)生的鐵載體在190～250 nm 之間有相似的吸收峰(圖5)，說(shuō)明二者產(chǎn)生的鐵載體均是羧酸型鐵載體。

圖4 菌株JK-1 和JK-4 產(chǎn)鐵載體能力定性測(cè)定

圖5 拮抗菌株JK-1 產(chǎn)生的鐵載體在不同波長(zhǎng)下的吸光值

2.6 拮抗細(xì)菌對(duì)小麥和黃瓜種子發(fā)芽的影響

由表2 看出，菌株JK-1 和JK-4 對(duì)小麥種子發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)無(wú)顯著影響，但促生效果差異顯著(P＜0.05)。 JK-1 發(fā)酵濾液處理后的小麥根長(zhǎng)比對(duì)照增加43.29%，芽長(zhǎng)增加38.50%；JK-4處理組與對(duì)照相比根長(zhǎng)和芽長(zhǎng)分別增加24.70%和14.17%。

表2 菌株JK-1 和JK-4 發(fā)酵濾液對(duì)小麥種子發(fā)芽的影響

由表3 看出，菌株JK-1 和JK-4 發(fā)酵液對(duì)黃瓜種子發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)沒有顯著影響，但二者可以顯著增加黃瓜根和芽的長(zhǎng)度。 JK-1 和JK-4 發(fā)酵液處理后的黃瓜根長(zhǎng)分別比對(duì)照增加29.88%和48.17%，芽長(zhǎng)分別增加32.60%和35.36%。

表3 菌株JK-1 和JK-4 發(fā)酵濾液對(duì)黃瓜種子發(fā)芽的影響

3 討論與結(jié)論

由病原真菌引起的土傳病害嚴(yán)重影響西洋參的產(chǎn)量和品質(zhì)，造成重大經(jīng)濟(jì)損失。 植物根際土壤中存在著大量的拮抗細(xì)菌，篩選拮抗細(xì)菌并對(duì)其鑒定是開發(fā)微生物資源的重要途徑。 本研究從根腐病發(fā)生嚴(yán)重的西洋參根部分離到兩株有拮抗活性的細(xì)菌JK-1 和JK-4，經(jīng)鑒定JK-1 是洋蔥伯克霍爾德氏菌(B. cepacia)，JK-4 為越南伯克霍爾德氏菌(B. vietnamiensis)。 伯克霍爾德氏菌是一類重要的根際促生細(xì)菌和生防菌，多數(shù)具有抑制植物病原菌生長(zhǎng)、促進(jìn)植物生長(zhǎng)、修復(fù)土壤等功能[19]。 于曉慶等[20]通過(guò)平板對(duì)峙培養(yǎng)、盆栽試驗(yàn)等方法研究表明，洋蔥伯克霍爾德氏菌株Lye2 不僅有廣泛的抑菌譜，同時(shí)對(duì)棉花幼苗具有防病和促生效果；洋蔥伯克霍爾德氏菌CF-66 產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)對(duì)灰葡萄孢菌等真菌具有較強(qiáng)的抑制活性[21，22]；李紀(jì)順等[23]研究表明越南伯克霍爾德氏菌B418 具有多種促生功能，可以固氮、解磷、解鉀、促進(jìn)植物生長(zhǎng)、防治植物真菌病害及線蟲病害。 本研究結(jié)果表明兩株拮抗菌對(duì)常見植物病原菌具有較強(qiáng)的抑制作用，并且JK-1 對(duì)分離自西洋參的3 種病原真菌均有較高的抑制活性，是西洋參土傳病害的潛在生防菌株。

本研究分離菌株JK-1 產(chǎn)ACC 脫氨酶的比活力為0.50 U/mg，產(chǎn)生的鐵載體類型為羧酸型，可溶性指數(shù)高達(dá)4.08；JK-4 產(chǎn)ACC 脫氨酶的比活力稍低，為0.19 U/mg，產(chǎn)生的鐵載體可溶性指數(shù)為1.50。 JK-1 和JK-4 發(fā)酵培養(yǎng)48 h 產(chǎn)生的IAA 濃度分別為13.93 mg/L 和4.55 mg/L，與吳婧等[24]從砂姜黑土中篩選出來(lái)的玉米固氮螺菌(Azospirillum zeae)IAA 產(chǎn)量20.15 mg/L 相比，產(chǎn)IAA 能力較弱。 菌株JK-1 和JK-4 對(duì)小麥和黃瓜種子發(fā)芽的促生作用顯著(P＜0.05)，JK-1 對(duì)小麥種子發(fā)芽的促生效果優(yōu)于JK-4，因此推斷，本研究分離的兩株拮抗菌的促生原因可能是通過(guò)產(chǎn)生ACC 脫氨酶、鐵載體和吲哚乙酸進(jìn)而促進(jìn)植物生長(zhǎng)。

本研究結(jié)果表明，從西洋參根部分離的兩株拮抗細(xì)菌JK-1 和JK-4 具有廣譜抑菌活性，可以通過(guò)產(chǎn)生ACC 脫氨酶和鐵載體促進(jìn)黃瓜和小麥種子的發(fā)芽，但受限于西洋參種子發(fā)芽的季節(jié)性并未研究菌株對(duì)西洋參生長(zhǎng)和病害防治的影響，下一步將深入研究菌株對(duì)西洋參生長(zhǎng)的影響和田間的防病效果，以期為菌株對(duì)西洋參土傳病害防治和連作障礙消減提供重要的資源和理論支撐。